Problemas de Enzimología

Hoja 1

1."

• Vol = 0,1 ml

• Pm (NR) = 500.000 Da

• Vmax = 20 mol/5ml

• [E] = 0,5 mg/ml (de ella sola al estar en homogeneidad)

• Vfinal de reacción = 1 ml

a)

Para definir la actividad de la reacción, en este caso para una enzima purificada a homogeneidad, se parte siempre de un dato de velocidad, Vmax. Este parámetro es la condición en la que normalmente se define la cantidad de enzima que hay en una preparación, midiendo la velocidad en condiciones de saturación por sustrato. Por esto se sobrentiende que el dato que nos da el problema de velocidad es el de Vmax.

Por lo tanto, para definir la actividad (Act) en U/ml, partimos de la equivalencia de los apuntes:

Lo que nos piden con la actividad es la cantidad de enzima que hay en la preparación de NR. Lo que nosotros hacemos es ensayar en un volumen total de reacción de 1 ml un volumen de enzima de 0,1 ml, con lo que 1/10 del volumen será enzima. Lo que nos piden es la cantidad de enzima en 1ml, que es la misma que hay en los 0,1 de preparación de enzima homogénea.

Para calcular el dato comenzamos con la Vmax expresada en min"1:

Esta velocidad, es la que presentan 0,1 ml de la muestra de enzima. Como nos piden las Unidades por mililitro de la reacción, no hay más que realizar una regla de tres:

b)

En este caso nos piden la actividad específica (Ae), que se trata de la actividad referida a la cantidad total de proteína. La forma habitual de expresar la Ae es en U/mg de proteína. Como ya sabemos la actividad, y nos dan la concentración de proteína. En este caso, al encontrarse la enzima purificada a homogeneidad, los mg de proteína que nos dan están referidos únicamente a la NR. Ya que la Ae nos define un valor de concentración de enzima, y toda la proteína es ella misma, el dato de Ae que nos da, es el máximo alcanzable.

El valor máximo que obtenemos es:

c)

Los Katales son una medida de actividad, definida por los moles transformados por segundo. Po lo tanto, no se trata más que de transformar las unidades:

d)

En este apartado se nos pide la actividad molecular de la enzima, o lo que es lo mismo, Kcat. Como ya vimos en teoría, la constante catalítica sale de la expresión de Vmax, siendo la constante de proporcionalidad que multiplica a [E]T para darnos Vmax. Ya que tenemos el dato de Ae máxima, podemos calcular directamente Kcat, sin más que multiplicar por el peso molecular.

Esto se debe al hecho de estar purificada a homogeneidad, de modo, que la Ae que hemos hallado es velocidad de transformación por mg de proteína, y como toda la proteína es enzima queda en moles al multiplicarlo por el peso molecular. Hay que tener en cuenta que este dato solo es aplicable en el caso de tener un dato de Ae de la enzima pura. Esto se demuestra fácilmente, mediante las unidades.

Esto puede ser útil en muchas ocasiones, pero siempre hay que tener en cuenta que necesitamos un dato de Vmax obtenido de la enzima purificada. Una vez sabido esto, calculamos Kcat.

e)

Si nos confirman que la enzima presenta dos centros activos, sabríamos que la Kcat hallada es Kcat molecular, al haber utilizado en la expresión del apartado anterior el peso del oligómero. De modo que, como vimos en teoría, lo único que hay que hacer para calcular Kcat C.A. es dividir por el nº de C.A.. En este caso Kcat C.A.= 666,6 s"1/2 = 333,3 s"1.

f)

El tiempo del ciclo catalítico (tcc) no es más que la inversa de Kcat. Ya que tenemos una Kcat C.A. es preferible utilizar este valor, al garantizarnos un tiempo de catálisis por C.A. tcc = 1/333,3 s"1 = 3·10"3 s = 3 milisegundos.

En esta segunda parte del ejercicio se nos dan unos datos de purificación, a través de los cuales debemos hallar el grado de purificación alcanzado. En esta tabla se nos dan los valores de Volumen, Actividad y Cantidad de proteína, suficientes para calcular el resto de la siguiente forma:

El resultado de calcular esto para todos los pasos se presenta en la siguiente tabla.

Si recordamos, la Ae máxima calculada en el extracto puro, era de 80 U/mg, mientras que la calculada para el V paso de esta purificación es de 26,2 U/mg. Esto no nos indica necesariamente que en este paso la enzima no esté pura, sino que pudiera ser que la enzima se halla degenerado. Esto habría que confirmarlo con otras pruebas como un gel de electroforesis.

2."

• Pm = 29,6 Kda

• 0.9 gr en 10 ml. Purificada.

a)

Nos piden si se ajusta a una cinética M&M. Para averiguarlo, lo que hacemos es primero visualizar la gráfica V Vs [S], que se presenta en la siguiente página.

Evidentemente, a simple vista parece asemejarse bastante a una hipérbola cuadrangular, con una Vmax que debe rondar 0,6 nmol · min"1. Para asegurarse, lo que se hace es representrar la linearización de los datos, y si estos se ajustan a una recta, es que efectivamente estamos ante una cinética M&M.

Los datos a representar se encuentran en la tabla anterior, ya que utilizaremos la linearización H"W.

El Excel no nos representa el corte en el eje X, pero nos da la ecuación de la recta, con la que podemos calcular todos los parámetros:

• Pendiente: Ya nos la dan en la ecuación de la recta: tg  = 1,4858. Su inversa será Vmax. Vmax = 0,673 nmol · min"1.

• Ordenada en el origen: Se trata del valor de y cuando x = 0.
  

Con estos dos datos, hacemos la media para obtener que Vmax = 0,6735 · 10"9 mol · min"1.

3."

4."

Nos piden la especificidad, y el parámetro que nos da ese dato es la constante de especificidad Kcat/Km. Para determinar Kcat en cada caso, de divide la Vmax entre la concentración total de enzima, (0,03 M). No es necesario cambiar las unidades ya que las dos están en M y se irán en la operación. Los resultados se muestran en la tabla:

En principio no importan las unidades de Kesp ya que, de momento, nos sirve para compararlas. Según eta tabla, la especificidad iría (de mayor a menor) con el siguiente orden: 2 > 3 > 1 > 4.

b)

En esta pregunta hay que utilizar el dato de Kcat máximo que se muestra en los apuntes, este es de 108 M"1· s"1 (máximo valor de k1 obtenido experimentalmente), mientras el obtenido en este experimento es de 1,755 ·10"5 M"1· s"1, evidentemente no es ele máximo.

Esto se corresponde con lo dicho en teoría, que las proteasas eran, tal vez las enzimas menos eficientes.

5."

E + S ES E + P

No se trata más que de retomar los apuntes:

Se trata de las 4 premisas genéricas más la específica para el estado preestacionario.

b)

Sabemos la ecuación genérica de velocidad, independiente del nº de etapas, que es la que nos muestra el problema, salvo que nos sustituye Kcat por k2. Entonces se trata de hacer que la constante catalítica sea k2. Para ver las posibilidades acudimos a la relación de constantes que nos dan Kcat. Para el supuesto k2 << k3.

Con esta condición, la suma del denominador es prácticamente k3, que se elimina con el numerador, quedando como resultado que Kcat = k2. Esto es el resultado de la limitación del proceso, k2 es tan pequeña que nos está condicionando toda la transformación. Esto nos sirve para diferenciar las etapas lentas, ya que siempre que veamos una Kcat que tiende a una sola etapa, sabremos que esa es una etapa lenta que nos limita el proceso, ya que la constante es mucho menor que las demás.

c)

Se ha insistido en numerosas ocasiones en los apuntes, que Km es Ks sólo en el caso sencillo de la aproximación al equilibrio. Para demostrarlo cogemos la relación de constantes para Km y le aplicamos la 5º premisa k2 << k"1 (al menos dos órdenes de magnitud).

Como se ve, al hacerse despreciable k2, queda sola la constante k"1, que dividida por k1 es la constante de disociación.

En un ejemplo numérico como este, lo que se pretende es que sepamos manejar las diferentes unidades de las constantes, bien sean de 1er o 2º orden. En primer lugar:

Con esto,
, con lo que Km " Ks.

6."

Tenemos las ecuaciones, de modo que hallamos Km y Vmax para cada una.

• Km= 7007,8 nM = 70·10"5 M.

• Vmax = 654934,54 nmol · min"1 = 654,9 mol · min"1.

• Km = 20843,5 nM = 2,08·10"5 M.

• Vmax = 3020797 nmol · min"1 = 3.021 mol · min"1.

b)

c)

Según estas constantes de especificidad, la xantina oxidasa prefiere 27 veces más a la Xantina que a la Hipoxantina.

En respuesta a la segunda parte de la pregunta, hay que decir que…

Hemos dicho unas 10 n veces que las enzimas no afectan a la constante de equilibrio, de modo, que qué importa Kesp, lo único que se notará es que en una mezcla de ambos sustratos, primero llegará al equilibrio el de la xantina y después la hipoxantina.

d)

En principio el alopurinol no es un inhibidor competitivo, ya que es transformable por la enzima a aloxantina, pero tampoco es suicida ya que la unión con la enzima no es lo suficientemente estable (aunque 300 min no están mal). No sabemos si el complejo E"AloXan es covalente, con lo que tampoco podemos basarnos en esas pruebas. Por lo tanto se concluye que el alopurinol no es suicida ni competitivo. Sí sería competitivo el producto de la reacción, la aloxantina, ya que entra en el C.A. y prácticamente lo bloquea (si es que el paso es igual de lento en una dirección y en la otra).

Podríamos pensar que se trata de un inhibidor reversible parcial, pero estos se caracterizan por unirse al complejo ES, no a la enzima libre.

1

1

k1

k2

k"1