PRACTICA 1

MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA DE ERITROCITOS HUMANOS

INTRODUCCIÓN

La actividad de una enzima puede expresarse, a sugerencia de la comisión de enzimas de la unión internacional de bioquímica, como actividad molecular (número de recambio), y como actividad específica.

La actividad molecular es el número de moléculas de sustrato transformadas por minuto por una sola molécula de enzima(o por un solo centro activo), cuando la enzima es el factor limitante de la velocidad, se basa en la Vmax y tiene unidades de recíproco de tiempo (min.-1).

La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que origina la transformación de un micromol de sustrato por minuto a 250c en condiciones óptimas de medida). La actividad específica constituye una medida de la pureza de la enzima, aumenta durante el proceso de su purificación y llega a ser máxima y constante cuando ésta se halla en estado puro. La forma más usada de expresión de la actividad específica es la de micromoles de producto formado por minuto por miligramo de proteína.

Aunque estas definiciones son sugeridas por la Comisión de Enzimas, no siempre seguidas, como en el caso de preparaciones crudas. Cada investigador aplica su propia definición de unidad de enzima y es necesaria una interconversión cuidadosa para comparar diferentes preparaciones de la misma enzima. En esta práctica la actividad de la catalasa se expresará como el número de micromoles de peróxido de hidrógeno transformado por minuto a 0 C, por ml de sangre.

La actividad de los preparados de catalasa se mide de diversas formas, casi siempre sujetas a errores. Un método conveniente consiste en medir el peróxido de Hidrógeno no atacado por la enzima, mediante titulación con Permanganato de Potasio, después de incubar la enzima (por cinco minutos) sobre una solución diluida de peróxido de Hidrógeno, (la reacción se detiene añadiendo ácido sulfúrico que destruye a la enzima).

PRODUCTO BIOLÓGICO:

Sangre humana completa obtenida al momento de realizar la práctica.

MATERIAL Y EQUIPO:

• 5 Matraces Erlenmeyer de 50 ml.

• 1 Matraz de Aforación de 100 ml.

• Pipetas Serológicas de 0.1 ml , 1 ml, 5ml y 10 ml.

• 1 Bureta

• 1 Soporte y pinzas para bureta.

• Tubos de 13 x 100 mm con tapón

• Baño de temperatura constante (100 C)

• 1Baño con hielo.

REACTIVOS:

• Acido sulfúrico, 6 N

• Amortiguador de fosfatos, 0.02 M (pH= 7.0)

• Permanganato de potasio, 0.005M

• Peróxido de Hidrógeno, 0.05M; en amortiguador de fosfato 0.02M, (pH=7.0)

• Sal di sódica de EDTA, al 1%

TÉCNICA:

A.-OBTENCION Y MANEJO DE LA MUESTRA DE SANGRE.

Extraer 2 ml de sangre venosa y mezclarla con EDTA al 1 % (en tubo de 13x100) y colocarla inmediatamente sobre hielo. La muestra debe ser utilizada lo más rápidamente posible.

B.- MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA

NOTAS

CALCULOS

• Para calcular los mol de H2O2 iniciales sustituir en la formula uno los ml de Kmno4 utilizados para titular el H2O2 del matraz uno.

• Para calcular los mol de H2O2 restantes sustituir en la formula uno los ml de Kmno4 utilizados para titular el H2O2 de los matraces el 2 al 5.

(mol de H2O2 descompuesto en un min./ml de sangre)

(En 5 minutos por 5x10-4 ml de sangre)

REFERENCIAS

REPORTE