ÍNDICE

1.- Introducción..................................................................................................2

2.- Cromatografía de Gases..............................................................................6

2.1.- Componentes básicos de un cromatógrafo Gas - Líquido ...............7

2.2.- Aplicaciones de la Cromatografía de Gases...................................13

3.- Cromatografía de Líquidos........................................................................15

3.1.- Componentes básicos de un equipo de HPLC...............................16

4.- Métodos cromatográficos en HPLC..........................................................22

4.1.- Cromatografía de Reparto..............................................................22

4.1.1.- Cromatografía en Fase Reversa.......................................22

4.1.2.- Cromatografía en Fase Normal.........................................23

4.1.3.- Aplicaciones de la Cromatografía de Reparto...................24

4.2.- Cromatografía Iónica.......................................................................24

4.2.1.- Aplicaciones de la Cromatografía Iónica...........................25

4.3.- Cromatografía de Exclusión por Tamaños......................................26

4.3.1.- Aplicaciones de Cromatografía Exclusión por tamaño......26

5.- Comparación entre Cromatografía de Gases y HPLC.............................27

6.- Aplicaciones de la Cromatografía de Gases y de HPLC.........................29

7.- Glosario.......................................................................................................31

8.- Bibliografía..................................................................................................32

1.- INTRODUCCIÓN: MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.

• ¿ Qué es la Cromatografía?

La cromatografía es un conjunto de técnicas que permiten identificar, separar y determinar compuestos químicos en mezclas complejas.

Cabe destacar desde un principio que en todas las técnicas cromatográficas hay:

• Una Fase estacionaria y una Fase móvil.

• En Cromatografía de gases, la fase móvil es un gas, el cual se hace pasar a través de una fase estacionaria.

• En Cromatografía Líquida, la fase móvil es un líquido que se hace pasar a través de una fase estacionaria.

• Un Cromatografía de Fluidos Supercríticos la fase móvil es un fluidos supercrítico que también pasa a través de una fase estacionaria.

Una de las características fundamentales en las cromatografías es que los componentes de la mezcla que queremos separar / identificar / cuantificar, se separan cuando sus velocidades de migración son distintas.

• Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los científicos a buscar técnicas, cada vez, más precisas. Fue el botánico ruso Mikhail Tswett quien inventó la cromatografía a principios del siglo XX. Tswett hizo pasar soluciones que contenían pigmentos vegetales, como clorofilas y xantofilas, a través de columnas de vidrio empacadas con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecían como bandas coloridas sobre la columna, lo cual explica el nombre que se escogió para el método, chroma que significa color en griego y graphein que significa describir.

Para elegir una técnica de separación además de tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección específica).

El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.
Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas.

Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos.

Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.

La cromatografía comprende un conjunto importante y diverso de métodos que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc...

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación.

El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se diseña, constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. La fase móvil puede pasarse a través de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen de forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se recogen en forma de gráficos llamados cromatogramas.

• Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la situación de la fase estacionaria en:

• Cromatografía en columna

• Cromatografía plana.

O bien según la Fase móvil en:

• Cromatografía de gases.

• Cromatografía líquida.

• Cromatografía de Fluidos Supercríticos.

Relacionando estas dos clasificaciones entre sí, sólo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas. Por otra parte, tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil.

La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.

2.- CROMATOGRAFÍA DE GASES.

En esta técnica cromatográfica, la muestra se inyecta y volatiliza en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte y a diferencia de la mayoría de las técnicas cromatográficas la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única misión es transportar el analito a través de la columna.

• Existen dos tipos de cromatografía de gases:

• Cromatografía Gas - Sólido: La fase estacionaria es un sólido de gran área superficial sobre el que se adsorbe el analito. Actualmente sólo se aplica a la separación de especies de bajo peso molecular (CO2, O2, N2 e hidrocarburos). Los compuestos más polares son retenidos en la fase estacionaria de manera semipermanente.

• Cromatografía Gas - Líquido: La fase estacionaria es un líquido no volátil inmovilizado sobre la superficie de un soporte sólido inerte. La velocidad de migración de un analito está determinada por su distribución entre la fase líquida inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del analito (Peb) y su solubilidad en la fase estacionaria son los factores que regulan su retención.

En la cromatografía de gases (que uno de los objetos de estudio en este trabajo: Cromatografía Gas - Líquido), se usa como fase estacionaria un compuesto orgánico polimérico de baja volatilidad, estable térmicamente y con adecuadas características de disolvente. Es preciso señalar que deben usarse fases estacionarias, similares funcionalmente al compuesto a analizar.

Fig 1: Algunos ejemplos de fases estacionarias comunes en cromatografía gas - líquido.

2.1.- Componentes básicos de un Cromatógrafo Gas - Líquido:

De forma muy esquemática podemos resumirlos en:

Gas portador Sistema de Inyección de muestra Columna Detector Registrador

O también como indica esta imagen:

Fig 2: Esquema Cromatógrafo de gases.

Vamos a ver los componentes uno a uno:

GAS PORTADOR

El gas portador debe ser inerte y de alta pureza (He, Ar, N2, CO2, H2). Su elección vendrá determinada por el tipo de detector que se use. Este gas estará en la botella de gas portador que son botellas con manureductores para poder controlar el caudal.

SISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRAS.

Las muestras están formadas por un disolvente, compuestos volátiles (analito) y compuestos no volátiles (suciedad).

El método más común de inyección de muestra implica el uso de una microjeringa que inyecta la muestra líquida o gaseosa a través de un septum de goma de silicona en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna. Esta cámara normalmente está a unos 50 ºC por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra.

Al inyectar con microjeringas el sistema debe asegurar:

• Que la muestra se vaporice en la cabeza de la columna sin distorsión del gas portador.

• Que la muestra ocupe la mínima longitud posible de la columna.

También se encuentra el inyector en columnas empaquetadas es una cámara de vidrio o cuarzo denominada glass insert, colocada en un bloque termostatizado a 200 - 300 ºC. El gas portador circula a través del bloque, penetra caliente en el inyector por una parte lateral y arrastra la muestra vaporizada al interior de la columna.

Otro tipo de inyector es el usado en columnas capilares donde la muestra vaporizada debe ser mucho más pequeña. Se inyectan volúmenes similares a los de las columnas empaquetadas que, o bien dejan pasar sólo una pequeña fracción de la muestra inyectada a la cabeza de la columna (inyección Split), o bien reconcentra el analito gas en la cabeza de la columna (inyección Splitness), o bien vaporizan los analitos una vez que lo ha hecho el disolvente (inyección on - column).

Fig 3: Inyector en columnas empaquetadas. Fig 4: Inyector usado en columnas capilares

COLUMNAS

Las columnas cromatográficas varían en longitud desde menos de 2 hasta 60 metros. Se construyen de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida, o teflón. A fin de poder ser colocadas en el interior del horno termostatizado, normalmente son configuradas como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm.

La temperatura de trabajo es una variable importante para realizar un trabajo preciso, por ello son introducidas dentro de un horno termostatizado.

La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. Normalmente con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullición promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elución razonables (2 a 30 minutos).

En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas y las capilares.

En las columnas empaquetadas la fase estacionaria se impregna en un soporte sólido poroso. Este soporte sólido debe mantener inmóvil la fase líquida proporcionándole la máxima superficie. Estos soportes sólidos suelen ser tierra de Diatomeas que son fuertemente adsortivas.

Las columnas Capilares son de sílice fundida con una capa protectora exterior de poliamida. Su longitud varia entre los 10 y 60 metros. Su diámetro interior oscila entre 0,1 - 0,32 mm. Su fase estacionaria recubre las paredes internas de la sílice y permiten conseguir mejores eficiencias que las empaquetadas aunque su uso es más complicado. Este tipo de columna requiere sistemas especiales de inyección de muestra y detectores más sensibles.

En ambas columnas, su fase estacionaria está unida químicamente al soporte sólido, lo que las lleva a ser más estables frente a la temperatura y pérdida de fase estacionaria que aquellas en las que la fase estacionaria está inmovilizada por adsorción física.

DETECTORES

La función básica de un detector es que debe producir respuestas muy rápidas a pequeñas concentraciones de soluto.

Las características ideales de un detector en cromatografía de gases son:

1. Adecuada sensibilidad. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de analito/s.

2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios órdenes de magnitud.

3. Buena estabilidad y reproducibilidad

4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 °C.

5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.

6. Alta fiabilidad y fácil manejo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos.

7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos.

8. No sea destructivo de la muestra.

Actualmente no existe el detector que reúna todas esas características, y tampoco parece probable que pueda llegar a diseñarse nunca.

Los detectores más generalizados son:

• Detector de conductividad térmica (TCD): Es totalmente universal y muy sencillo, aunque no es muy sensible. Se emplea básicamente en el análisis de gases. Su baja sensibilidad impide usarlo con columnas capilares. Los gases que salen de la columna entran en un compartimiento en el que se encuentra un filamento caliente, cuya temperatura depende de la capacidad del gas que le rodea en disipar calor, esto es, su conductividad térmica. En el momento en que se eluye de la columna un compuesto con diferente conductividad térmica que el gas portador, la temperatura del filamento varía, y por tanto su resistencia eléctrica, lo que es registrado en forma de aumento o disminución de la corriente.

• Detector de ionización a la llama (FID): Es como detector, el más usado. Esto se debe porque es prácticamente universal para los compuestos orgánicos, donde es bastante sensible y tiene un comportamiento excelente. Los gases que efluyen de la columna son introducidos en una llama formada por H2 y aire cuya conductividad eléctrica está permanentemente registrada. En el momento es que un compuesto de carbono se eluye de la columna, se quema y durante la reacción de combustión se generan electrones y otras especies cargadas que alteran la conductividad eléctrica de la llama.

• Detector de captura de electrones (ECD): Este detector es selectivo para las moléculas que contienen átomos electronegativos, como peróxidos o halógenos e insensible a compuestos como aminas, alcoholes, o hidrocarburos. Por lo que se emplea en el análisis de pesticidas halogenados. Se trata de un detector tremendamente sensible y en algunos casos hasta inestable. El efluyente de la columna se hace circular entre un pequeño núcleo de un metal radiactivo que emite electrones (partículas ), y un electrodo cargado positivamente que los recibe. En el momento en que de la columna eluye una especie de átomos electronegativos, capaces de capturar a dichos electrones, se detecta una disminución de la corriente del electrodo.

• Detector Termoiónico (TID): Se trata de un detector selectivo de los compuestos orgánicos que contienen fósforo y nitrógeno. En comparación con un FID, el TID es 500 veces más selectivo para los compuestos continentes de fósforo y 50 veces más con los compuestos continentes de nitrógeno. Un detector termoiónico tiene una configuración similar al detector de llama. El efluente de la columna se mezcla con hidrógeno, pasa a través de la llama y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una bola de silicato de rubidio calentada eléctricamente, la cual se mantiene a unos 180 con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800 °C. Esto provoca que se produzcan una gran cantidad de iones a partir de las moléculas que contienen fósforo o nitrógeno, lo que resulta en una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la determinación de compuestos que contienen esos dos elementos.

• Detector de Emisión Atómica (AED): Es el detector más reciente y se encuentra a la venta. En este detector el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido por microondas que se acopla a un espectrofotómetro de emisión con series de diodos. El plasma es suficientemente energético como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y así obtener los espectros de emisión. Estos espectros son recogidos en un espectrómetro.

2.2.- Aplicaciones de la Cromatografía de Gases.

La cromatografía de gases se puede aplicar a gases y cualquier compuesto que pueda ser volatilizado o convertido en un derivado volátil.

Con carácter general se puede aplicar en los siguientes casos:

• Para separa muestras analíticas complejas.

• En el análisis cualitativo: Por ejemplo para determinar el criterio de pureza, la presencia o ausencia de compuestos, el número de átomos de carbono en una serie homóloga...

• En el análisis cuantitativo: para realizarlo se requiere es uso de patrones o estándares.

Centrándonos en el tema que nos compete que son los alimentos, podemos destacar las siguientes aplicaciones o ejemplos:

• Aminas aromáticas heterocíclicas (HAA) formadas durante la cocción de alimentos proteicos (carne y pescados). Donde estos compuestos son mutagénicos potentes bien conocidos y algunos de ellos son carcinógenos. Se han formado en alimentos cocinados, y también se han detectado en las muestras ambientales (aerotransportadas partículas, aire de interior, humo del cigarrillo...) y en las muestras biológicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA son muy importantes para el gravamen de riesgo para la salud humana.

• Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial: Se identifica y cuantifica, mediante cromatografía en fase gaseosa  aquellos componentes que definen la  calidad básica de los orujos y cuyo control exige la administración: grado alcohólico, acidez total, acetato de etilo, metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.

• Determinación de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana, cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.

• Estudio de vinos monovarietales.

• Caracterización de avellanas por su composición en ácidos grasos.

• Identificación d compuestos volátiles en granos de cacao.

• Determinación del perfil del ácido graso, acidez y valor del peróxido en la calidad del aceite de oliva contra el almacenaje.

• Determinación cuali y cuantitativa de componentes volátiles en hierbas y especias.

• Separación de compuestos volátiles del queso.

• Análisis de compuestos terpénicos de la uva de la variedad albariño.

• Estudio de compuestos azufrados volátiles pesados es vinos tintos de la denominación de origen ribeira sacra.

***** Se adjuntan al final del trabajo los artículos que corresponden a cada aplicación aquí expuesta *****

3.- CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS.

En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que circula a través de una columna en la que está contenida la fase estacionaria. La fase móvil no sólo arrastra al analito, sino que existen interacciones intensas entre el analito y la fase móvil.

La retención cromatográfica es función de:

• La fase móvil.

• La fase estacionaria.

• El analito.

Todas las especies que pueden disolverse pueden separarse eligiendo la combinación adecuada de fase móvil y fase estacionaria.

• La cromatografía líquida se clasifica según el lecho cromatográfico:

• Cromatografía Líquida Clásica: La columna es de vidrio y se usa para mezclas complejas.

• Cromatografía de alta resolución o HPLC: La columna es de acero inoxidable. Va a ser objeto de estudio en este trabajo.

• La HPLC consta de una columna de acero inoxidable de 10 30 cm de longitud, y un diámetro interno de 4 - 10 mm. Las partículas de la fase estacionara son de un tamaño aproximado a las 5 - 10m.

Cabe destacar que separa con gran eficacia, identifica los compuestos separados por la columna y además lo cuantifica por su altura o área de picos en el cromatograma.

3.1.- Componentes básicos en un equipo de HPLC:

De forma esquemática los componentes básicos son:

Sistema de suministro, Inyector Columna Detector Registrador

Bombeo y conducciones

de la fase móvil

En esta figura pueden observarse con más detalle:

Fig. 5: Esquema de un aparato de HPLC.

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MÓVIL:

Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para desgasificar y eliminar partículas en suspensión de los disolventes que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección.

SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MÓVIL:

Se usan bombas para impulsar a la fase móvil y deben cumplir los siguientes requisitos:

• Deben vencer altas presiones.

• Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.

• Deben estar libres de pulsaciones y tener volúmenes muertos pequeños.

• Deben estar construidas de materiales resistentes a la presión y a las agresiones químicas.

• Fácil manejo y mantenimiento.

Se utilizan tres tipos de bombas :

• Bombas recíprocas

• Bombas de desplazamiento

• Bombas neumáticas.

INYECTORES:

Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma reproducible y adecuada.

Hay dos tipos de inyectores

• Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite mucha presión.

• Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en el equipo cromatográfico y existen bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra.

PRECOLUMNAS

Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composición del relleno debe ser semejante al de la columna. Aunque el tamaño de partícula es mayor para minimizar la caída de presión. En muchas ocasiones se usan para aumentar la vida de la columna.

COLUMNA:

Normalmente son de acero inoxidable de diámetro interno uniforme aunque en ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.

La mayoría de las columnas de cromatografía de líquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10m.

Los empaquetados más comunes son de partículas de sílice pero también se usa la alúmina, polímeros porosos y resinas de intercambio iónico.

La columna más utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno, empaquetada con partículas de 5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro.

Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener diámetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partículas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Pueden tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo consumo de disolvente característica muy importante ya que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son muy caros.

DETECTORES:

A diferencia de la cromatografía de gases, en HPLC no existen detectores tan universalmente aplicables, ni tan fiables tampoco. En lo que si coinciden cromatografía de gases y HPLC, son las cualidades enumeradas en los detectores de cromatografía de gases.

En HPLC existen dos tipos básicos de detectores:

• Los basados en una propiedad de la disolución: Que corresponden a una propiedad de la fase móvil, como el índice de refracción, la constante dieléctrica, la densidad...

• Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil.

En la siguiente tabla se presentan los detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades más importantes:

Fig.5: Detectores más comúnmente usados en HPLC.

Paso a hacer una breve descripción de algunos de ellos:

• Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna cromatográfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se usan detectores fotoeléctricos contrastados. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representación en función del tiempo del logaritmo del cociente de las dos señales transducidas. También se utilizan instrumentos de un solo haz, en cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la absorbancia.

• Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente.

• Detectores de Índice de refracción: Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografía de gases. Se añade que son fiables, no dependen del caudal, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.

• Detector de dispersión de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla gracias a un flujo de nitrógeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de conducción a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase móvil y se originan partículas de analito. Estas partículas pasan a través de un láser y por un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser más sensible que el detector de índice de refracción.

• Detectores Electroquímicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroquímicos, que se basan en cuatro métodos: amperometría, voltamperometría, coulombimetría, conductimetría.

• Detectores por espectrometría de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas. De forma general se pueden obtener tanto cromatogramas a tiempo real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.

4.- MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN HPLC

Hay cinco métodos cromatográficos:

• Cromatografía de Reparto:

• Cromatografía en fase normal.

• Cromatografía en fase reversa.

• Cromatografía iónica.

• Cromatografía de Exclusión.

• Cromatografía de adsorción.

4.1.- Cromatografía de Reparto:

La cromatografía de reparto es hoy en día el método más utilizado. La cromatografía de reparto se divide en “fase normal”, y “fase reversa”, cuyas principales diferencias radican en las distintas polaridades de sus fases estacionarias y móviles.

4.1.1.- Cromatografía en fase reversa:

En la cromatografía de fase reversa su fase estacionaria en apolar, y la fase móvil polar. Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano.

La retención se produce en esta especie de capa líquida depositada químicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria ( apolar) y la fase móvil (polar).

Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y selectividad se controlan fundamentalmente con la composición de la fase móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de elución óptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.

Fig 6: Las polaridades de los solutos son A> B > C

Actualmente, el 75% de los análisis con HPLC se realizan en fase reversa. Permite un análisis directo de muestras acuosas y de compuestos solubles en agua o en disolventes relativamente polares (metanol) y con peso molecular no superior a 2000 o 3000 ua.

Si se compara con la de adsorción, su comportamiento cromatográfico es excelente.

4.1.2.- Cromatografía en fase normal:

En esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano.

La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluir.

Fig.7: Polaridades de los solutos A > B > C

Se deduce que los analitos A, B, C tardan más tiempo en eluirse si se usa una fase móvil poco polar. Es decir, cuanto más polar sea el analito, más tardará en eluir.

4.1.3.- Aplicaciones de la Cromatografía de Reparto:

Como aplicaciones de la cromatografía de reparto en productos de alimentación : edulcarantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos en bebidas refrescantes, colorantes, aminoácidos, proteinas, carbohidratos, lípidos.

4.2.- Cromatografía iónica:

La cromatografía iónica se usa para separar y determinar especies iónicas. La fase móvil es un líquido acuoso y salino que contiene un disolvente orgánico como metanol o acetonitrilo y un compuesto iónico que aporta un contraion de carga opuesta al analito. La elución de los pares iónicos se consigue mediante una disolución acuosa de metanol u otro disolvente orgánico soluble en agua. La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico. Se trata de un material polimérico (Ej: poliestireno), que contiene muchos grupos funcionales por molécula y prácticamente insoluble en agua.

Hay dos tipos de cromatografía iónica, que se clasifican según el método empleado, para evitar que la alta conductividad de la fase móvil interfiera en la medida de conductividad del analito. Estos dos tipos son:

• Con detector conductimétrico y supresión química: Se coloca una columna supresora del eluyente inmediatamente después de la columna analítica (de baja capacidad). Esta columna supresora es un intercambiador iónico de alta capacidad y de signo opuesto a la columna analítica, que convierte los iones del eluyente en especies moleculares poco ionizadas y no retiene los iones del analito. La columna supresora se debe regenerar periódicamente. Veamos las reacciones entre el eluyente y el supresor:

La primera reacción de la imagen se corresponde a cuando la columna analítica es catiónica.

La segunda reacción de la imagen corresponde a cuando la columna analítica es aniónica:

Fig. 9:Reacciones en cromatografía con detector conductimétrico y supresión química.

• Con detector conductimétrico y supresión electrónica: Se utilizan fases móviles de conductividad muy baja y diluidas. Su conductividad se corrige de forma electrónica. Comparada con la supresión química, requiere un equipo más sencillo, pero menos sensible.

4.2.1. Aplicaciones de la Cromatografía Iónica:

Como aplicaciones de la cromatografía iónica está el análisis de drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azúcares, y preparaciones farmacéuticas.

4.3.- Cromatografía de Exclusión por Tamaños:

También conocida como cromatografía en geles permeables o de filtración en geles. Es una técnica que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular.

La fase estacionaria está compuesta de partículas de sílice o polímeros en forma de gel, que contienen una red de poros uniformes. La retención está basada en el tamaño de las moléculas. Si las moléculas con más grandes que los poros, no pueden penetrar en ellos (sólo pasan las partículas), y son las primeras que se eluyen. Si las moléculas son más pequeñas que los poros, penetran en ellos recorriendo caminos mucho más largos, y serán las últimas en eluir. Si las moléculas tienen un tamaño intermedio, podrán penetrar en los poros más grandes (camino recorrido intermedio). Por tanto, el tiempo de residencia medio en los poros, depende del tamaño afectivo de las moléculas de los analitos.

La retención no se controla con la fase móvil, se controla eligiendo la fase estacionaria, cuya elección vendrá determinada por:

• Si la separación se realiza en fase acuosa (filtración en gel), o en fase orgánica.

• El rango de pesos moleculares (tamaños) que contienen la muestra que queremos analizar.

Cabe observar, que este tipo de separación difiere de los demás que han sido considerados, en que no implica una interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones, dado que originan una mala eficacia de la columna.

4.3.1.- Aplicaciones de la Cromatografía de exclusión de tamaños.

Como aplicación referida a productos alimenticios en cromatografía por exclusión de tamaños: separación de ácidos grasos, determinación de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados.

5.- COMPARACIÓN ENTRE CROMATOGRAFÍA DE GASES Y HPLC:

Como características de ambos métodos:

• Son eficientes, muy selectivos, ampliamente aplicables.

• Sólo se requiere una muestra pequeña.

• Pueden utilizarse sin destruir la muestra.

• Se adapta fácilmente al análisis cuantitativo.

Ventajas de la HPLC:

• Puede acomodar muestras no volátiles e inestable térmicamente.

• Es aplicable a iones inorgánicos.

Ventajas de la CG:

• Se trata de un equipo sencillo y barato en comparación con HPLC.

• Es rápido.

• Tiene resolución en paralelo (columnas capilares).

• Se conecta fácilmente con la espectroscopia de masas, (MS).

La CG, ofrece la ventaja de la velocidad y simplicidad del equipo, pero la HPLC es aplicable a sustancias no volátiles y materiales térmicamente inestables.

Algunas diferencias instrumentales:

• En HPLC no existen detectores tan aplicables universalmente, ni tan tampoco tan fiables como en CG.

• El detector en HPLC no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas.

• El detector usado en HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

6.- APLICACIONES DE CG Y HPLC

En el desarrollo del trabajo, cuando han sido descritos de cada uno de los métodos, tanto CG como HPLC (en todas sus variantes), se han incluido sus aplicaciones correspondientes. Algunas van a ser renombradas y otras, van a ser incluidas y descritas en este apartado. Se han recogido artículos que son adjuntados en este apartado del trabajo.

• Aplicaciones en Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) : Como aplicaciones de la cromatografía de reparto en productos de alimentación : edulcorantes artificiales, antioxidadntes, aflatoxinas, aditivos, colorantes, aminoácidos, proteinas, carbohidratos, lípidos.

Las aplicaciones de la cromatografía iónica está el análisis de drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azúcares, y preparaciones farmacéuticas.

Respecto a las aplicaciones referidas a productos alimenticios en cromatografía por exclusión de tamaños: separación de ácidos grasos, determinación de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados.

• Aplicaciones de La cromatografía de Gases. Se pueden destacar las siguientes aplicaciones o ejemplos.

• Aminas aromáticas heterocíclicas (HAA) formadas durante la cocción de alimentos proteicos (carne y pescados). Donde estos compuestos son mutagénicos potentes bien conocidos y algunos de ellos son carcinógenos. Se han formado en alimentos cocinados, y también se han detectado en las muestras ambientales (aerotransportadas partículas, aire de interior, humo del cigarrillo...) y en las muestras biológicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA son muy importantes para el gravamen de riesgo para la salud humana.

• Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial: Se identifica y cuantifica, mediante cromatografía en fase gaseosa  aquellos componentes que definen la  calidad básica de los orujos y cuyo control exige la administración: grado alcohólico, acidez total, acetato de etilo, metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.

• Determinación de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana, cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.

• Estudio de vinos monovarietales.

• Caracterización de avellanas por su composición en ácidos grasos.

• Identificación d compuestos volátiles en granos de cacao.

• Determinación del perfil del ácido graso, acidez y valor del peróxido en la calidad del aceite de oliva contra el almacenaje.

• Determinación cuali y cuantitativa de componentes volátiles en hierbas y especias.

• Separación de compuestos volátiles del queso.

• Análisis de compuestos terpénicos de la uva de la variedad albariño.

• Estudio de compuestos azufrados volátiles pesados es vinos tintos de la denominación de origen ribeira sacra.

***** A continuación adjunto los artículos encontrados de las aplicaciones en alimentos de CG y HPLC *****

7.- GLOSARIO.

CONTRAIÓN: (Termino usado en HPLC, cromatografía iónica), Un contraión es un ión que se combina con el ión analito para formar una pareja de iones, que es una especie neutra que es retenida por el relleno de la fase inversa.

CROMATOGRAMA: Es una gráfica de alguna función de concentración de soluto contra el tiempo o el volumen de elución.

EFECTIVIDAD O SELECTIVIDAD DE UNA COLUMNA CROMATOGRÁFICA: Se dice que una columna es efectiva cuando las especies a separar se eluyen a velocidades relativas suficientemente diferentes (los picos están suficientemente separados).

EFICACIA DE UNA COLUMNA CROMATOGRÁFICA: Se dice que una columna es tanto más eficaz cuanto menos sea el ensanchamiento de los picos. La eficacia será mayor cuanto más pequeña sea la altura de plato y mayor sea el número de platos.

ELUCIÓN: Es un proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil.

ELUYENTE: Se trata de un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.

RESOLUCIÓN DE UNA COLUMNA: Parámetro que proporciona una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos solutos. Debe ser mayor a 1,5 para que se considere buena.

TIEMPO DE RETENCIÓN:( TR ) Es el tiempo entre la inyección de una muestra y la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica.

TIEMPO MUERTO: ( TM ) Es el tiempo que tarda en salir de la columna una sustancia no retenida.

8.- BIBLIOGRAFÍA.

LIBROS:

“Análisis Instrumental” Skoog / Leary - 4ª Ed. Mc Graw Hill

“Química Analítica” Skoog / West / Holler - 6ª Ed. Mc Graw Hill

“Análisis químico cuantitativo” D.C. Harris. Grupo editorial Iberoamérica, Méjico, 1992.

Apuntes de la asignatura “Química Analítica” de la E.U.I.T.I.Z.

INTERNET:

www.altavista.com

www.google.com

www.eurojai.com

www.ig.csic.es

Término definido en el glosario, al final del trabajo.

Término definido en el glosario, al final del trabajo.

Término definido en el glosario, al final del trabajo.

Tiempo de retención: Ver definición en el glosario.

Tabla recogida de “ Análisis Instrumental” Skoog / Leary.

Recogida del libro Análisis Instrumental : Skoog / Leary. 4ª Ed. Mc Graw - Hill.

Fig 2: Tomada de los apuntes de química analítica de la EUITIZ.

Fig 3 : Tomada de los apuntes de química analítica de la EUITIZ.

Término definido en el glosario.

Término definido en el glosario.

Imagen tomada del libro “Química Analítica” 6ª Ed. Skoog / West / Holler.

Tabla tomada del libro “ Análisis Instrumental” 4ª Ed.. Skoog / Leary.

Término definido en el glosario.

Dibujo sacado de los apuntes de la asignatura “Química Analítica” de la EUITIZ.

Término definido en el glosario.

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