OBJECTIU

Fer un estudi sobre el funcionament d'un sistema d'HPLC (High Performance Liquid Crhromatography) per mitjà d'un simulador per ordinador. Trobar les variables més adients per a la determinació dels patrons definits a la mostra.

FONAMENT TEÒRIC

La diferent velocitat de migració dels pigments que volem separar per la fase estacionària és la propietat que farem servir per fer aquesta separació cromatogràfica en columna.

El mecanisme de separació que tractem en aquesta pràctica és partició, de forma que la repartició per dissolució (polaritat) de la mostra a la fase estacionària i a la fase mòvil depén de les seves polaritat. Les columnes de què disposa el simulador son les següents:

NOM	TAMANY DE PARTICULA (µ)	DIMENSIONS
DuPont C-18	6,0	23,0 x 0,46
DuPont C-8	6,0	23,0 x 0,46
Waters C-18	10,0	30,0 x 0,39
Merck C-8	10,0	25,0 x 0,46
Hypercyl C-18	6,0	16,0 x 0,50

Els rebliments que tenen més carbonis són més polars.

La fase mòbil que podem preparar es pot composar d'aigua i un dels següents compostos: metanol, tetrahidrofurà i acetonitril. La composició en percentatge del compost que no és aigua es pot definir a l'ordinador.

El detector és molt complet, fa servir l'UV proper i té una gama de sensibilitat de 2,00 a 0,005. Té opció diode array, que és un escombrat de les longitud d'ona que és capaç de llegir.

Altres paràmetres que es poden definir son: quantitat de mostra a injectar, mode isocratic o gradient, fluxe de la fase mòbil, detector en mode de variable o diode array i la sensibilitat del detector.

MATERIAL

• Equip cromatogràfic (simulat a l'ordinador).

REACTIUS

• Fenol. Acid fènic. C6H6O.

Tòxic. T

R34: Provoca cremades.

R24/25: Tòxic en contacte amb la pell i per ingestió.

S28.6: En cas de contacte amb la pell, renteu-vos inmediata i abundantment amb... (producte especificat pel fabricant).

S45: En cas d'accident o malestar, aneu inmediatament al metge (si és possible ensenyeu-li l'etiqueta).

• P-Nitrofenol.( C6H5NO3)

Nociu, irritant, Xn

R20/21/22: Nociu per inhalació, ingestió i en contacte amb la pell.

R33: Perill d'efectes acumulatius.

S28.1: En cas de contacte amb la pell, renteu-vos inmediatament amb... (producte especificat pel fabricant)

• P-Cresol. (C7H8O).

Tòxic. Corrosiu. T

R24/25: Tòxic en contacte amb la pell i per ingestió.

R34: Provoca cremades.

S36/37/39: Useu vestimenta i guants adequats i protecció per als ulls/la cara.

S45: En cas d'accident o malestar aneu inmediatament al metge (si és possible, ensenyeu-li l'etiqueta.

• 2,5-xilenol. (informació no disponible).

• Benzoat de metil. C8H8O2.

Nociu. Xn

R22: Nociu per ingestió.

• Anisol. Metoxibencè. C7H8O.

Inflamable, irritant. Xn

R10: Inflamable.

R36/37/38: Irrita els ulls, la pell i les víes respiratòries.

• Bencè. Benzol. C6H6.

Fàcilment inflamable, carcirogènic, tòxic. F, T.

• Fenetol. Etoxibencè.

S23:No en respireu els vapors.

S24/25: Cal evitar-ne el contacte amb els ulls i la pell.

• Toluè. C7H8.

Fàcilmente inflamable, nociu. F, Xn.

R11: Fàcilment inflamable.

R20: Nociu per inhalació.

S16: Protegiu de fonts d'ignició. No fumeu.

S25: Eviteu-ne el contacte amb els ulls.

S29: No llenceu els residus pel desguàs.

S33: Eviteu l'acumulació de càrregues electrostàtiques.

• Metanol. Alcohol metílic. CH4O.

Fàcilment inflamable, tòxic. F, T.

R11: Fàcilment inflamable.

R23/25: Tòxic per inhalació i per ingestió.

S7: Mantingueu el recipient ben tancat.

S16: Protegiu de fonts d'ignició, no fumeu.

S24: Eviteu-ne el contacte amb la pell.

S45: En cas d'accident o malestar, aneu inmediatament al metge (si és possible ensenyeu-li l'etiqueta).

• Acetonitrilo. Cianur de metil. AN. C3H3N.

Fàcilment inflamable, tòxic. F, T.

R11: Fàcilment inflamable.

R23/24/25:Tòxic per inhalació, per ingestió i en contacte amb la pell.

S16: Protegiu de fonts d'ignició, no fumeu.

S27: Traieu-vos inmediatament la roba tacada o esquitxada.

S45: En cas d'accident o malestar, aneu inmediatament al metge (si és possible ensenyeu-li l'etiqueta).

• Tetrahidrofurà. THF. C4H8O.

MÈTODE

El primer pas és fer un estudi sobre les condicions analítiques óptimes per fer la cromatografia, tenint en compte l'equip de què es disposa, les característiques de la mostra i la bibliografia.

Es configura la part física del cromatòfraf abans de posar-lo en marxa, col·locació de la columna, selecció dels eluents.

Es prepara la mostra.

Es posa en marxa el cromatògraf i es configuren el paràmetres de funcionament: fluxe de FM, quantitat de mostra a injectar, % de eluent a la FM, mode isocràtic o gradient, i es verifica que l'equip no dóni missatges d'erros.

Es posa en marxa el detector i es seleccionen els paràmetres del mateix, que són mode diode array o variable i la seva sensibilitat.

Es fa la injecció de la mostra prenent “Inyect sample”.

Al sistema computeritzat de control es pot veure el cromatograma i fer els estudis pertinents, com integrar-lo, comparar-lo amb un altre, ampliar-reduïr pics, etc...

En aquesta pràctica probarem algunes de les combinacions que es poden fer per obtenir cromatogrames de diferents tipus, de forma que podrem descubrir les condicions òptimes de funcionament de l'equip per a una mostra determinada. No seguirem un mètode concret de configuració de paràmetres del cromatògraf.

RESULTATS I CÀLCULS

Treballarem amb una mostra creada amb patrons que tindrà els següents components (incorporo també els resultats de la cromatografia per facilitar la interpretació):

Patró	Concentració (mg/litre)	Temps de retenció (s)	Àrea del pic
Fenol	15	18,44	996
p-nitrofenol	15	41,40	695
2,5-xilenol	15	33,91	330
Benzoat de metil	15	17,06	876
Anisol	15	30,26	429
Bencè	10	39,11	150
Fenetol	15	55,33	175
Toluè	15	72,83	48
p-cresol	15	34,93	230

En aquesta, la primera configuració, he fet servir:

Columna	DuPont C-18
%B	20%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	1 ml/min
Eluent	THF
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Isocràtic

I el cromatograma resultant ha estat:

Ara, injectem la mateixa quantitat de mostra, sent aquesta una mostra problema que té 3 components desconeguts. No hi ha cap més variació al cromatògraf. Obtenim el cromatograma següent:

I els resultats són, tenint en compte les dades del cas anterior (els temps de retenció permeten identificar els components de les mostres i l'àrea dels pics permet fer la determinació quantitativa):

Temps de retenció	Area del pic	Concentració (mg/litre)	Compost
34,93	80	7,32	p-Cresol
39,07	126	12,02	Bencè
55,47	63	5,58	Fenetol

Ara fem servir la mostra de patrons i les condicions cromatogràfiques inicials, amb l'excepció del %B, que ara és un 10% i obtenim el cromatograma següent.

Si es fa una comparació visual, podem veure com, en no entrar tanta quantitat d'eluent, la mostra és arrossegada més a poc a poc, de forma que hi ha més distància entre els pics. Això també provoca que hi hagui només 8 pics encara que la mostra té 9 patrons. Així, podem dir que hem guanyat en selectivitat, la resolució ha millorat, encara que hi ha 2 pics junts, i en fi, la resolució és millor.

Posem ara, amb la mostra de patrons, la columna número 2 (DuPont C8) per veure quines diferències tenim. El cromatograma resultant és, en les condicions que s'indiquen:

Columna	DuPont C-8
%B	10%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	1 ml/min
Eluent	THF
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Isocràtic

Podem veure que només surten 5 pics i a més hi ha dos que es troben junts, de forma que hem perdut en tots els paràmetres de qualitat, fem ara una prova amb la columna 3 (Waters C-18) (conservant els altres paràmetres i sempre amb la mostra de patrons indicada al principi):

Es veu un pic més, encara que no gaire bé, i continúa tenint dos pics junts (poca selectivitat), hem tornat a perdre qualitat. Provem ara amb la columna 4 (Merck C-8):

A més de veure els pics més petits, només es veuen 5 dels 9 que han de sortir, presentant l'últim una fusió de dos pics amb tailing. Tornem a perdre en quant a selectivitat, eficàcia i resolució. Ho intentem amb la columna 5 (Hypercil C-18):

Es veuen 6 pics, els primers, com sempe, bastant ben separats i amb bona eficàcia, però els altres no són tan perfectes, i a més només surten 6. Veure els resultats en números:

Pic	Temps de retenció (s)	Area
1	26,00	176
2	36,44	198
3	53,11	150
4	67,11	117
5	69,56	57
6	85,78	87

Ara modifiquem la quantitat d'eluent que es barreja a la fase mòbil amb l'aigua, i posem una quantitat superior:

Columna	Hypercil C-18
%B	30%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	1 ml/min
Eluent	THF
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Isocràtic

El cromatograma presenta uns pics que es surten de la pantalla, ya que l'eluent arrosega massa ràpid els components de la mostra. No obstant hem guanyat resolució i tenim 8 pics. Si comparem els resultats numerics:

Pic	Temps de retenció (s)	Area
1	6,87	658
2	7,87	587
3	10,33	308
4	11,60	1059
5	12,13	884
6	15,33	204
7	19,27	370
8	24,93	196

Podem veure com els temps de retenció quan puja un 20% la quantitat de THF de la FM és molt més inferior. I, en canvi, les àrees dels pics són molt superiors.

Ara cambiem la columna per la 2 (DuPont C-8), mantenint el 30% amb la mostra de patrons:

Podem observar que els tres pics que es trobaven junts s'han separat d'una forma més nítida (selectivitat), encara que només es veuen 8.

Per continuar probant, posem ara la següent configuració (variem només el %THF a un 10%)

Columna	DuPont C-18
%B	10%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	1 ml/min
Eluent	THF
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Isocràtic

Veiem, per primera vegada des del primer cromatograma, els 9 pics dels 9 components de la mostra. Observem que es trobem alguns bastant junts (poca selectivitat) i l'últim presenta un tailing. A més hi ha una mica d'asimetria.

Una altra opció que presenta el simulador tenir un fluxe gradient de FM, posarem que tingui un fluxe inicial de 5% THF i un fluxe final de 35% en un temps de 0,5 segons, sense canviar la configuració:

Columna	DuPont C-18
%B	10%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	1 ml/min
Eluent	THF
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Gradient (5%/35%)

Com que hem posat poc temps per fer la pendent de %, la mostra ha arribat més de cop que als cassos anteriors (veure l'escala). És un cromatograma pésim, que no té res de resolució, selectivitat ni eficàcia.

Canviem ara la configuració del gradient perquè sigui inicial %THF= 10% i final 30%, en 0,5 minuts, també. Mantenim els paràmetres del cromatograma anterior i fem servir, encara la mostra de patrons.

Tenim un cromatograma totalment diferent, però que no presenta gaire més qualitat, només als tres primers pics podem parlar de selectivitat i eficàcia. Cal tenir present que la mostra consta de 9 components.

Per continuar fent convinacions, fem servir ara un altre eluent a la FM, acetonitril:

Columna	DuPont C-18
%B	20%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	1 ml/min
Eluent	ACN
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Isocràtic

I tenim el cromatograma següent:

Que es veu molt millor que el primer de tot (fent servir THF), encara que l'últim pic té una eficàcia bastant dolenta. Podem parlar d'una bona selectivitat, eficàcia mitjana i resolució bona.

I per veure si l'altra solvent és millor, fem la cromatografia:

Columna	DuPont C-18
%B	20%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	1 ml/min
Eluent	Metanol
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Isocràtic

Tenim només 3 pics, és un cromatograma amb bastant eficàcia, però sense selectivitat (no es veuen els pics restants).

I ara tornem a posar la configuració del cromatograma original i modifiquem el fluxe de FM, el cromatograma de sota és el que té 1 ml/min (el primer de tot) de FM i comparteix els altres paràmetres:

Columna	DuPont C-18
%B	20%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	2 ml/min
Eluent	THF
W	254 nm
Isocràtic/gradient	Isocràtic

Es veuen uns pics més grans i igual de separats (els mateixos temps de retenció), de forma que es perd selectivitat i eficàcia, resolució, en definitiva.

Aquest simulador té una opció al detector que permet fer un escombrat de longituds d'ona, de forma que es pot fer una gràfica temp/longitud d'ona i surt un cromatograma tridimensional, que en el nostre cas, surt de la pantalla:

Columna	DuPont C-18
%B	20%
Mostra	50µlitres
Floxe FM	2 ml/min
Eluent	THF
W	DIODE ARRAY
Isocràtic/gradient	Isocràtic

Amb aquesta gràfica es pot veure quina és la longitud d'ona més adient a un compost determinat, i gràcies a les eines informàtiques, es pot veure una determinada longitud i comparar-la amb una altra:

Conclusions

Com a conclusionos podem dir que els compostos més difícils de separar (els últims en sortir) sempre han sortit representats per pics molt poc atractius, de forma que potser si es provés amb un gradient que sigui més progressiu a la segona meitat del cromatograma igual es separen millor.

El solvent més adequat per a una mostra que conté tots els patrons és l'acetonitril.

OBSERVACIONS

La informació de perillositat d'alguns compostos no és complerta per manca de bibliografia. He fet servir els catàlegs Merck (1996), Fluka (99-00) i el Diccionari de química i de productes químics (Ed. Omega).

Aquest informe és molt resumit, ja que s'han evitat les taules de dades que no semblaven interesants per comparar.

A les dades que proporciona el programa sobre el cromatograma, consta també el % relatiu de l'area de cada pic.

Es pot comparar un espectre d'un temps en mode Diode Array amb uns espectres que té el programa per fer qualitatius.

Per aconseguir quantificar mostres cal fer mostres de patró amb diferents concentracions i fer la recta de regressió, per aplicar-la després a les dades que s'obtindràn de la mostra problema.

En un HPLC real, caldria afegir els inconvenients de l'acció del soroll de fons, els pics fantasmes deguts a possibles contaminants i altres problemes.

Algunes de les cromatografies que hi ha en aquesta pràctica han estat reescalades per poder-les veure millor, ja que en el format original eren massa grans i es sortien de la pantalla.

1

1

ANÀLISI INSTRUMENTAL 19-feb-2000

Pràctica 5: Simulador HPLC.

Tema: Cromatografía en columna tancada: HPLC