PRE-PRÀCTICA Nº 5

CITOLOGIA

1) Material:

- Microscopi.

- Poartaobjectes

- Cobreobjectes

- Pinces

- Tisores

- Ganivet

- Llanceta

- Comptagotes

- Paper de filtre

- Vidre de rellotge

- Bunsen

- Culletetes

2) Mostres:

Epiteli de ceba, de mucosa bucal, respiratori de musclo, arrel de ceba, jacint o llentia.

3) Fixadors:

Metanol i etanol.

4) Colorants:

Orceina A i B, Lugol, Blau de Metilè, eosina i hematoxilina.

5) Muntatge:

Bàlsam de Canadà, laca d'ungles.

6) Introducció Teòrica I

Per realitzar esperiments de tinció es poden fer servir molts mètodes, segons el que s'hagi de determinar: les substàncies reaccionants, la quantitat de reacció, etc. Abanç de realitzar la pràctica es convenient informan-nos sobre les tincions que realitzarem; en aquest cas les tincions es realitzaran amb:

Hematoxilina: Sustància colorant, de fórmula C16H14O6·3H2O que és un principi actiu del "pal campeche". És un sólid groc, que s'utilitza en la tinció de preparacions microscópiques, en citología y en histología. El "pal campeche" o Haematoxylum campechianu és un arbre perenne, de 6-7 m d'altura, de rames ascendents, amb el tronc y rames fisurades. Es natural de Méxic y América Central. De la seva fusta s'obté el colorant "hematoxilina", utilizat en histología, en la tinció de teixits; també s'utilitza en la fabricació de tintes per a la indústria téxtil. La fusta té propietats medicinals.

Blau de Metilé: Colorant que forma part del grup de la tiazina. És un sólid cristalí, de color verd blavós, molt soluble, que es fa servir en histología y bacteriología com a mitjà de diagnóstic de la permeabilitad renal y com a terapéutic, analgésic, antirreumátic, antipalúdic y antiblenorrágic. La tiazina és el nom genéric que té cadascun dels colorants que se obtenen per aminació de la ditiofenilamina, el més important dels quals és el blau de metilé.

Eosina: Colorant àcid de color vermell, de la família de les ftaleínes, derivad de la fluoresceína, de fórmula C20H8Br4O5. S'utilitza en la tinció de llanes i sedes i en preparacions microscópiques; tinyeix especialmente els hematíes i les fibres musculars.

Orceína: Sustància colorant de color vermell intens, de fórmula C28H24N2O7, que se obtiene de la orcina (compost orgànic de color blanc, soluble, de fórmula C6H3(OH)2CH3, derivad del tolué per sustitució de dos àtoms d'hidrogen per dos grups hidroxi, i que es troba en cierts líquens, dels que s'obté per fermentació y extracció).

7) Introducció teòrica II:

7.1) Obtenció de la mostra

Per tal d'aconseguir uns bons resultats en els nostres esperiments les mostres han de complir tres condicions bàsiques: que siguin primes (que deixin passar la llum a través seu, ja que les observacions les realitzem mitjançant la tècnica de tranparència), que siguin fresques (per tal que les mostres no estiguin deteroirades) i que siguin adequades al que volem observar.

7.2) Fixació

Amb aquesta tècnica aconseguirem immobilitzar les estructures cel·lulars o els teixits que volem observar. Aquesta tècnica té la propietat de conservar les estructures com a l'estat original. El que hom busca en un fixador és que tingui una penetració ràpida i homogènia en les estructures. Els fixadors més emprats són el formol, el metanol i l'etanol.

7.3) Inclusió i confecció de talls

La inclusió consisteix en fer penetrar, dintre de la mostra problema, una sustància homogènia, solidificable i opticament neutre, que donarà la consistència necesària a la mostra per tal de ser estudiada. Les substàncies més emprades per aquest mètode són la parafina i la celoidina (resina sintètica).

Per a la confecció dels talls necesitarem l'ajud d'uns estris anomenats micròtoms per tal de fer els talls el més prim possible. Els micròtoms que utilitzarem nosatres al laboratori seran els més senzills: navalles.

7.4) Tinció i coloració

Veure Introducció teòrica I.

7.5) Muntatge

Es tracta d'obtenir la mostra definitiva que s'acnsegueix posant el cobreobjectes sobre del porta. Encara que sembli senzill s'ha de fer amb molt de conte per tal que no quedi aire entre les dues capes. Per tal que la mostra sigui el més perfecte posible cal fer dos pasos importants: Secar la mostra (eliminar el líquid sobrant) i segellar la mostra (enganxar les vores del cobre al porta).

8) Procediment

8.1) Recollida de mostres

S'han de recollir mostres de:

• Epiteli de ceba: talls fins i sense doplegar.

• Musclo: epiteli respiratori amb una mica del aigua que ja conté.

• Mucosa bucal: la mostra és el suc que obtenim en rascar-nos la galta amb un escuradents pla.

• Mitosi: tallar 5 mm de les arrels humides en creixement preparades 3-4 dies abanç.

8.2) Fixació

La fixaió només és necessaria en el cas C i el paper de fixador el realitza la pròpia Orceina (que també fa de colorant).

8.3) Tinció

Per als esperiments A i B podem elegir qualsevol fixador, per al musclo no en cal cap, pel cas C utilitzarem la orceina (tenyir amb orceina A, escalfar fins estreure vapor, i en fresc, tenyir amb orceina B)

8.4) Muntatge

En els cassos A i B primer eliminem el colorant sobrant i unim el cobre amb el porta mitjançant una mica d'aigua; en el cas del musclo la pròpia aigua d'aquest uneix el porta amb el cobre. En el C, i procurant que estigui sec, realitzarem la tècnica del squash (apressa anteriorment); després col·locarem paper de filtre sobre el contjunt cobre-porta i ho aixafarem per tal de: compactar la mostra i aliminar el colorant sobrant.

8.5) Muntatge definitiu

Ho deixem asecar abanç de utilitzar la laca fixadora (casos A i B); en el cas del musclo, com que ha de ser en fresc, no la podem fer definitiva; en el cas C, per tal de no fer malbé la mostra ho fixarem calentant-ho una mica.

Objectiu:

Realitzar observacions de cèl·lules vegetals, animals i cèl·lules vegetals en mitosi.

2) Introducció teòrica

Per tal d'aconseguir uns bons resultats, en l'apartat de preparació, haurem de crear unes mostres han de ser primes (que deixin passar la llum a través seu, ja que les observacions les realitzem mitjançant la tècnica de transparència), fresques (per tal que les mostres no estiguin deteriorades). Amb la tècnica de la fixació aconseguirem immobilitzar les estructures cel·lulars o els teixits que volem observar. Aquesta tècnica conserva les estructures com a l'estat original. El que hom busca en un fixador és que tingui una penetració ràpida i homogènia en les estructures. Els fixadors més emprats són el formol, el metanol i l'etanol. La inclusió i confecció de talls consisteix en fer penetrar una substància homogènia, solidificable i òpticament neutre, que donarà consistència. Les substàncies més emprades per aquest mètode són la parafina i la celoidina (resina sintètica). Per a la confecció dels talls faríem servir uns estris anomenats micròtoms però en el nostre cas seran substituïts per navalles. Per realitzar experiments de tinció utilitzarem les següents substàncies

Hematoxilina: Substància colorant, de fórmula C16H14O6·3H2O que és un principi actiu del "pal campeche". És un sòlid groc, que s'utilitza en la tinció de preparacions microscòpiques, en citologia i en histologia. El "pal campeche" o Haematoxylum campechianu és un arbre perenne, de 6-7 m d'altura, de rames ascendents, amb el tronc i rames fisurades. Es natural de Mèxic i Amèrica Central. De la seva fusta s'obté el colorant "hematoxilina", utilitzat en histologia, en la tinció de teixits; també s'utilitza en la fabricació de tintes per a la indústria tèxtil. La fusta té propietats medicinals.

Blau de Metilè: Colorant que forma part del grup de la tiazina. És un sòlid crestallí, de color verd blavós, molt soluble, que es fa servir en histologia i bacteriología com a mitjà de diagnòstic de la permeabilitat renal i com a terapèutic, analgèsic, antireumàtic, antipalúdic i antiblenorrágic. La tiazina és el nom genèric que té cadascun dels colorants que s'obtenen per aminació de la ditiofenilamina, el més important dels quals és el blau de metilè.

Eosina: Colorant àcid de color vermell, de la família de les ftaleínes, derivat de la fluoresceïna, de fórmula C20H8Br4O5. S'utilitza en la tinció de llanes i sedes i en preparacions microscòpiques; tenyeix especialment els hematíes i les fibres musculars.

Orceïna: Substància colorant de color vermell intens, de fórmula C28H24N2O7, que s'obté de l'orcina (compost orgànic de color blanc, soluble, de fórmula C6H3(OH)2CH3, derivat del toluè per substitució de dos àtoms d'hidrogen per dos grups hidroxil, i que es troba en certs líquens, dels que s'obté per fermentació i extracció).

Ara ja només queda la part de muntatge on es tracta d'obtenir la mostra definitiva que s'aconsegueix posant el cobreobjectes sobre del porta.

Material:

- Mostres: epiteli de ceba, epiteli de mucosa bucal, epiteli respiratori de musclo i arrel de ceba.

- Fixadors: metanol i etanol.

- Colorants: Orceina A i B, Lugol, Blau de Metilè, eosina i hematoxilina.

- Material del laboratori: Microscopi, poartaobjectes, cobreobjectes, pinces, tisores, ganivet, llanceta, comptagotes, paper de filtre, vidre de rellotge, bunsen i culleretes.

Procediment:

- Preparació de la mostra d'epiteli de ceba:

El primer que cal fer és retirar les capes exteriors de la ceba en qüestió fins que arribem a veure les capes joves i més internes. Un cop arribat a aquest punt realitzarem un petit tall amb el bisturí d'on podrem obtenir la mostra d'epiteli de ceba. Aquesta mostra l'obtindrem amb l'ajut d'unes pinces especials la punta de les quals fa forma de L. Un cop obtinguda la mostra de ceba, feina prou difícil ja que l'epiteli té el costum d'enrotllar-se sobre si mateix i espatllar així la mostra, la col·locarem sobre un porta vigilant que no es doblegui ni quedin bombolletes d'aire sota la mostra. Un cop obtingut i preparat l'epiteli procedirem a la tinció. Aquesta tinció la realitzarem amb blau de metilè (col·lorant ja explicat en la introducció teòrica i usat en pràctiques anteriors). El mecanisme per tenyir amb blau de metilè és molt senzill: només cal que impregnem la mostra amb unes gotes (2 o 3) del col·lorant i deixem assecar la mostra durant 5 o 6 minuts. Transcorreguts aquests minuts procedirem a la part més delicada de la preparació: el rentat de la mostra. En aquest punt és on es pot produir un error que ens pot suposar la repetició del procés de tinció: l'error típic és rentar la mostra amb aigua destil·lada sense tenir en compte la pressió amb que surt l'aigua. Degut a aquesta pressió la nostra mostra es pot desprendre del porta i desaparèixer claveguera avall. Un cop tinguem lliure la mostra del col·lorant en excés ens dirigirem a finalitzar la preparació de la mostra; ara, ja només cal col·locar-hi el cubre-objectes. Encara que aquesta operació és molt senzilla cal realitzar-la amb molta cura si volem veure res després en el microscopi. Si col·loquem el porta de qualsevol manera quedaran bombolles d'aire entre la mostra i el cubre que apareixeran com boles negres en el microscopi. Degut a això caldrà col·locar el cubre amb molt de compte, però desició, i un cop col·locat pressionar suaument fins observar la completa simbiosi entre cubre, porta i mostra.

1.- Objectius:

Els objectius d'aquesta pràctica són dos, un per a cada tècnica estudiada:

• Amb la pràctica de cromatografia es pretén separar els pigments bàsics de la clorofil·la.

• S'efectua l'electroforesi per obtenir un proteïnograma plasmàtic.

2.- Introducció teòrica:

• Sobre la cromatografia:

És una tècnica que permet separa substàncies semblants químicament en base a la diferent capacitat a ser arrossegada per una fase mòbil (dissolvent) i retinguda per una fase estacionària (paper, gel, etc.). Nosaltres emprarem la cromatografia en paper:

La fase estacionària és representada per les fibres del paper. La fase mòbil (dissolvent) i la mescla problema ascendeixen per capil·laritat pel paper mantingut en posició vertical. La diferent velocitat d'ascensió de la mescla és la que separa els elements.

• Sobre l'electroforesi:

És una tècnica que ens permet separar substàncies, en base la seva capacitat per desplaçar-se en un camp elèctric en funció de la seva càrrega neta. Segons el pH del medi i els grups ionitzables localitzats en els radicals moleculars que poden presentar càrrega (segons el corresponent pK), en funció de la intensitat de càrrega, del signe, la massa molecular, l'afinitat pel medi... la substància migra cap a l'ànode o el càtode. En una mescla sotmesa a electroforesi se separen els seus elements en una migració diferencial, que les pèrmet identificar.

• Sobre la centrifugació:

La força centrífuga depèn de directament de la massa, que _en el cas de les masses moleculars_ ens ofereix un sistema de separació d'elements que sedimenten i es dipositen d'una forma diferencial. Això, en el laboratori, s'usa amb suspensions i macromolècules, que contenen partícules de gran mida enfront d'altres més lleugeres (la sang, per exemple, conté cèl·lules en suspensió plasmàtica).

3.- Material:

• Per la cromatografia:

Fulles d'espinac.

Tires de paper de cromatografia.

Erlenmeyer.

Alcohol etílic.

Tubs d'assaig amb tap.

Plaques de petri.

Comptagotes.

Tub capil·lar.

Dissolvent: èter de petroli, acetona i benzè (17:2:1).

• Per l'electroforesi:

Sang (prèviament centrifugada per obtenir plasma sanguini).

Heparina.

Centrífuga.

Tubs de centrífuga.

Placa dipòsit.

Aplicador.

Tampó fosfat pH 7 aproximadament.

EDTA pH 8 aproximadament.

Papers d'acetat de cel·lulosa.

Papers de filtre (o secant).

Cubeta d'electroforesi.

Colorant “Roig ponceau”.

Àcid acètic 1%.

Cubetes pel colorant (roig ponceau) i el decolorant (àcid acètic).

4.- Procediments:

• Per la cromatografia:

Primerament, submergim diverses fulles d'espinac en un erlenmeyer de 200ml, on hi ha entre 5 i 10ml d'alcohol etílic. Escalfarem l'erlenmeyer al bany Maria durant cinc minuts, després dels qual filtrarem la solució obtinguda. Llavors, podrem fer la cromatografia mitjançant tres procediments:

• Apliquem diverses gotes a un mateix punt d'una tira llarga de paper, que introduirem en un tub capil·lar (on ja hi ha 2ml de dissolvent) i esperarem l'ascensió del solvent.

• Col·loquem en una placa de petri, amb 2mm de dissolució de pigments, una peça rectangular plegada en V (situada perpendicular al vas). Aquest paper tindrà una taca de pigment que haurem dipositat com en el cas anterior. Esperarem l'ascensió.

• Dipositem diverses gotes en un tros de paper, l'extrem inferior del qual submergirem en dissolvent, que estarà col·locat en un gran recipient. Esperarem l'ascensió.

• Per la electroforesi:

Disposem d'una cubeta d'electroforesi (que compta amb dos pols i treball amb diversos voltatges), d'una mostra de plasma sanguini i d'uns suports de paper (acetat de cel·lulosa) impregnats de solució tampó (pH 7).

Un cop hem submergit els papers en la solució tampó, prenem en una xeringa una mica de plasma i pressionem amb l'aplicador 2 o 3 cops per poder obtenir unes microgotes que el propi aplicador posa en l'acetat. Col·loquem l'acetat en la cubeta (que conté una solució tampó de pH 8) i el sotmetem 15 minuts a un voltatge 180V.

Finalment, colorem les mostres amb Roig Ponceau (les hi submergim 6 minuts) i n'esbandim l'excés amb àcid acètic. Observarem que les proteïnes formen proteïnograma.

• Per la centrifugació:

Usarem diversos tubs d'assaigs especials (sempre amb nombre parell), tapats, amb 5-10 ml de mostra dins la centrifugadora durant un temps no definit. Passada una estona, es treuen i s'observen les mostres.

5.- Resultats:

Primerament podem observar el resultat que vàrem obtenir a l'apartat d'electroforesis. També podem observar que aquesta mostra no és gaire clara; les raons d'aquest fet estan exposades a l'apartat de comentari.

A continuació podem veure el resultat de practicar la cromatografia sobre una gota de ploma de tinta negra. Podem deduir, a partir de les tonalitats que observem, que la tinta negra no és res més que tinta blava amb un colorant desconegut de color groc-marronós

6.- Discussió de resultats:

• Les proteïnes plasmàtiques, per què migren amb pH 8?

Aquest fenomen es produeix al treballar amb un pH = 8, el qual no és el propi de les proteïnes plasmàtiques; per tant, en variar el seu pH, el que estem fent és alterar el pK i conseqüentment, alguns dels aminoàcids variaran el seu grau de dissociació (quedaran carregats).

• Les proteïnes plasmàtiques, per què migren de forma diferencial?

En aquest cas, l'explicació per a aquest fenomen també està lligada amb els aminoàcids i les seves càrregues. El fet que unes proteïnes migrin de forma diferent de la de les altres, es deu a que cada proteïna té uns aminoàcids diferents o en té un nombre diferent i per tant, cada proteïna presenta una càrrega pròpia i diferent de la de les altres proteïnes.

7.- Comentari:

D'aquesta pràctica cal fer dos comentaris bàsics que expliquen el perquè de la poca claredat dels resultats de l'experiment d'electroforèsis i el poc resultat que vàrem obtenir en l'apartat de cromatografia. L'experiment d'electroforesis va resultar poc aclaridor per dos motius principals: les dissolucions tampó i els colorants ja s'havien utilitzat prèviament, eren reciclats, i per tant ja no tenien les mateixes propietats que quan eren immaculats. A més a més d'això cal dir que la nostra mostra de sang no fou centrifugada avanç de realitzar l'experiment i per tant la mostra que vàrem utilitzar era impura. El canvi entre una mostra prèviament centrifugada i una de no centrifugada el trobem en el nostre propi grup on certes persones que varen utilitzar la mostra centrifugada obtingueren uns resultats clars i entenedors.

Dels resultats que obtinguérem en l'apartat de cromatografia cal dir que no foren altament aclaridors ja que les fulles d'espinacs no van estar prou temps en ebullició i per tant no vàrem poder extreure tots els pigments que calia. Degut això, de l'apartat de cromatografia, només presentem una mostra.