TEMA 1: INTRODUCCION HISTÓRICA.

DEFINICIÓN: ciencia que estudia los diferentes aspectos biológicos de los microorganismos. Es un término muy amplio pero se entiende como microorganismo aquellos que tienen tamaño microscópico y con organización simple.

Tb. Pueden formar agregados celulares. Poseen estas características:

• Nutrición

• Generación de energía

• Reproducción.

TIPOS.

Procariotas que son las bacterias.

Eucariotas que son las algas y los protozoos.

La microbiología se dedica a.

• El estudio de los virus y partículas subvirales.

• A la interacción de los microorganismos con los otros seres vivos.

• Y al reciclaje de la tierra.

También hay otra que se dedica a los aspectos aplicados de los microorganismos.

El descubrimiento de los microorganismos se debe a Anthony Van Leeuvenhoek que descubrió a estos seres vivos y construyó microscopios capaces de verlos. Alcanzaba a ver incluso con una sola lente a 300 aumentos. Observó células sanguíneas, semillas pero lo principal fue lo que él llamó animáculos.

Sus observaciones no se pudieron volver a repetir hasta el S XVIII ya que los microscopios compuestos tenían más aberraciones que los que fabricó Leeuvenhoek y el no dejó heredero de su invento.

GENERACIÓN ESPONTÁNEA O ABIOGÉNESIS.

Había científicos que consideraban el origen de la vida como de origen espontáneo. Y muchos estudios fueron a intentar rebatir esta idea como por ejemplo Redi que demostró que los gusanos que aparecían en la carne cuando esta se podrían no era otra cosa que huevos de mosca que ponían en la carne.

En el s XIX no se pudo demostrar la no espontaneidad aunque en el XVIII Spallanzani apuntó que los microorganismos estaban en el aire y que luego crecían sobre soluciones depositadas en el ambiente.

Y lo demostró esterilizando por calor una solución en un matraz y sellarla herméticamente y asi la dejaba estéril, tapándola para siempre.

Lavoasier demostró que el O2 era esencial para la vida y ya se volvió a la idea de espontaneidad ya que se basaban en la ausencia de O2 todos aquellos que apoyaban dicha teoría.

Appert usó la idea de Sapalanzani para esterilizar alimentos y lo llamó apertización (lo que actualmente es el baño María.)

Pasteur fue el que rebocó ya la generación espontánea. Probó que en el aire existen microorganismos, esto lo hizo usando algodón de pólvora por donde hizo pasar aire por el y lo vió después en microscopio observando microorganismos.

Luego metió el algodón en solución estéril viendo que al cabo del tiempo había microorganismos procedentes del algodón.

También dijo que una solución expuesta al aire si es estéril permanecerá estéril. Lo probó con un matraz de cuello curvo ya que los microorganismos se quedaban en el inicio.

Surgieron algunos problemas derivados de que había microorganismos resistentes al calor. La respuesta ha este problema la dio Tyndall en 1877 y lo hizo trabajando con heno que posee microorganismos sensibles y otros termosensibles.

Y los segundos seguían creciendo asi que ideó un sistema de calentamiento discontinuo llamado tindalización y que son calentamientos cortos de 5 minutos y reposos de enfriamiento de varios días.

Y los termoresistentes germinan en el primer día de reposo y mueren en el segundo calentamiento y los que quedan resistentes caen mas adelante.

CRECER MICROORGANISMOS EN INFUSIÓN.

Esto provocaba unos cambios químicos que unos decían que eran solo químicos y otros que eran biológicos.

Teníamos dos tipos de transformaciones en la materia:

Putrefacción que era aquella la que pasaba la materia animal a sustancias malolientes.

Fermentación que modificaba plantas en alcohol y ácidos grasos.

Pasteur volvió a decir que las fermentaciones eran llevadas a cavo por los microorganismos dentro de estos compuestos por ejemplo en la remolacha que en vez de alcohol sacaban ácido láctico y Pasteur vio que en las vasijas había:

• Levaduras.

• Bacterias que eran las que producían el ácido láctico.

Comenzó a estudiar diferentes tipos de fermentaciones como la butírica que no necesitaba aire y el O2 era tóxico para este tipo de fermentación. Fue el que aportó el término anaerobiosis.

Buchner dijo que no se necesitaban microorganismos para que hubiese fermentación lo hizo con extractos de levaduras que eran capaces de llevar acabo fermentaciones alcohólicas iguales que las de las levaduras y se vio que era por los encimas de las levaduras llegando al acuerdo químicos y biólogos. Eran microorganismos con encimas los que producían las fermentaciones.

OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS.

• Se observaban poblaciones mixtas y pensaban que eran iguales pero con diferente estado.

• A esta corriente se la llamó Pleomorfismo al contrario que la teoría del Monoformismo de Pasteur.

• Koth en 1881 obtuvo cultivos puros sólidos para que los microorganismos crecieran sobre su superficie añadiendo un solidificante sobre el medio de cultivo líquido.

Añadió gelatina y vio que los micro. La licuaban.

También usó agar y vio que era ideal.

En el siglo XIX se pensó si podían ser los causantes de enfermedades en sv.superiores.

• Listen en 1864 obtuvo las primeras pruebas ya que él introdujo la antisepsia quirúrgica, y consiguió reducir las infecciones postoperatorias.

• Koth en 1876 demostró que el agente productor del carbunco era el Bacillus anthracis. Se sabía que en los animales enfermos había micro en su sangre y se los metió a ratones y comprobó que desarrollaban la enfermedad. También usó trozos del bazo para crear n medio de cultivo de ese ratón, aislando colonias de micro de ese bacillus.

Las sembró en otro y así ocho veces por último lo metió en un ratón sano y vio que se desarrollaba nuevamente la enfermedad y demostró que era ese el causante de la enfermedad.

• Koth dijo que.

El micro debe estar presente en todas las fases de la enfermedad.

Debe poder ser aislado en cultivo puro.

Cuando se inocule a uno sano debe desarrollar la enfermedad.

El micro ha de poder aislarse apartir del nuevo enfermo. Y que el micro sea idéntico al de partida.

Se desarrollo lo que se llama la edad de oro de la Microbiología gracias a Koth y a Pasteur.

DESCUBRIMIENTO DE LOS VIRUS.

Lo hizo Ivanowsky en 1892 y estudio el agente infeccioso que provocaba el mosaico del tabaco y que era un agente filtrable es decir que era muy pequeño.

Stanley en 1935 cristalizó el virus del mosaico del tabaco y observó que solo era proteína y RNA.

Diener en el 1971 descubre viroides y Pruksimeer en 1981 descubre los priones.

Los viroides solo son moléculas de RNA.

LOS MICROORGANISMOS COMO AGENTES GEOQUÍMICOS.

• Gran importancia en el reciclaje de la materia de la Tierra, debido a su diversidad fisiológica.

• Winogradsky en 1889 estudió los micro y halló bacterias quimiolitotróficas con grupos fisiológicamente diferentes.

• Beijerinck en 1901 idea los cultivos de enriquecimiento y así solo crecen micro que no necesitan un nutriente ya que se hace que falte dicho nutriente debido a que son micro de crecimiento pobre y basándose en la ventaja de que no necesitan dicho nutriente podemos aislarlos. Así se descubrieron bacterias fijadoras de N atmosférico y si no fuera por ellas se acabarían las reservas de N.

Bacterias N

NO3- SV

DESARROLLO DE LA MICROBIOLOGÍA EN EL SIGLO XX

Se investigó mucho en la Fisiología y Bioquímica bacteriana. También la genética bacteriana y la tecnología del DNA recombinante, lo que llamamos Biotecnología.

Esto lo podemos aplicar en Microbiología médica e inmunología.

Microbiología agrícola.

Microbiología industrial, productos médicos alimenticios etc.

TEMA 2:

LOS MICRO EN LA ESCALA BIOLÓGICA.

• Teoría celular, la célula es la unidad fundamental de toda la materia viva.

• Tenemos una composición química DNA RNA proteínas.

• Metabolismo con rutas anabólicas y catabólicas.

• Las células tienen división celular.

MODELOS DE ORGANIZACIÓN.

• Unicelular cuando la célula es capaz de realizarlo todo.

• Multicelular de dos tipos: -células sin diferenciar.

-Células diferenciadas en tejidos y órganos.

• Cenocítica, que es el citoplasma plurinucleada que está en hongos y algas.

SITUACIÓN DE LOS MICRO.

• En el descubrimiento de los micro solo había:

Reino animalia

Reino plantae que son individuos inmóviles y fotosintéticos.

Así basándonos en esta división se agruparon los micro en inmóviles y móviles.

Pero se observó que había micro que eran mixtos fotosintéticos y móviles por ejemplo.

• Haekel en 1866 sugirió la creación del reino protistas caracterizado por organismos de organización biológica sencilla.

Luego a mediados del siglo XX se vio que las células podían ser ecucariotas y procariotas así que más tarde;

• Wittakerk 1969 propone cinco reinos: cuatro que eran los eucariotas ( animalia, plantae, protistas, fungi)

Y uno procariota que era el reino procaryota.

• Woese 1980 estableció relaciones filogenéticas entre ellos y encontró que todos los sv tenían tres ramas evolutivas diferentes.

• Dominio bacteria que incluye a eubacterias.

• Dominio archeae que incluye a las arqueobacterias.

• Dominio eucarya todos los eucariotas.

Comparó los RNA ribosómicos tanto de procariotas como de eucariotas y observó:

16S en procariotas

18S en eucariotas.

Estableció una relación entre secuencia y evolución. Cuanto más diferencias más alejados evolutivamente.

Está presente en todos los seres vivos por eso se usa esta molécula.

• Siempre es constante.

• Y facilmente alineable con otro RNA de otro organismo.

• Se conserva mucho a lo largo de la evolución y realiza una función importante no tiene mucha mutación.

Se ha visto que los diferentes grupos evolutivos tienen un trozo de secuencia idéntico en todos ellos. Así uno nuevo se puede asignar un grupo.

Las archeobacterias son los menos evolucionados y los eucariotas son las más evolucionadas.

Estos estudios nos aportan que las mitocondrias y los cloroplastos se han obtenido por un origen endosimbiótico, ya que se relacionan filogenéticamente con las eubacterias ya que es muy parecido su RNA. También se han encontrado eucariotas que no tienen mitocondrias que son los de la parte más baja. Diplomonadales y Monosporidia.

Son ancentros de los eucariotas antes de que consiguiesen esos orgánulos.

EVOLUCIÓN DE LA TIEERA.

4600 mill a se crea el sistema solar.

4000 mill a aparece le agua líquida con temperatura superior a 100ºC

3600 mill a aparecen los primeros fósiles de esta época, son los estromatolitos. ( son capas de sedimentos)La atmósfera es muy diferente a la actual ( H20 CO2 N2 CH4 H2S FeS COH2 ). Estas condiciones se pueden con compuestos inorgánicos lograr compuestos orgánicos.

Después se podrían formar macromoléculas. Esto se piensa que tuvo lugar en mares poco profundos y que la polimeración se produjo sobre la superficie del fondo. Aquí ya tendríamos macromoléculas acumuladas en los mares.

Luego se formaría vesículas de lípidos y proteínas que engloban luego macromoléculas necesarias y suficientes para que esta estructura pudiera replicarse. Esto tendría lugar miles de veces infructuosamente.

Los primeros organismos tenía RNA como moléculas claves con capacidad.

• Catalizadora.

• Almacenamiento de información genética.

Luego se produciría una presión selectiva hacia el establecimiento de micro donde fuese DNA y la capacidad catalítica fuese de las proteínas.

Empezaran a bajar los nutrientes así se ejerce presión sobre los microorganismo que no pueden aprovechar bien los nutrientes. Más tarde aparecieron las porfirinas y a partir de aquí tendremos citocromos para la respiración anaeróbica, también clorofila para la fotosíntesis.

Hace 2500 ma se estableció la vida aerobia ya que se había empezado antes la producción de O2. La vida aerobia es mucho más eficiente que la anaerobia, 2000 ma se creó la capa de ozono O3 por la incidencia de los rayos ultravioleta sobre el O2 y así se posibilitó la vida en la superficie terrestre.

1200 ma se dio el proceso de endosimbiosis que dio lugar a los eucariota modernos.

Aproximadamente 700 ma surgen los metazoos. A partir de aquí se llegó a la actualidad.

5/6 del total de la historia es de los microorganismos.

TÉCNICAS DE LA MICROBIOLOGÍA.

TEMA 3:

TÉCNICAS PARA LA OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS.

Protozoos <100 micras. Cel animal 10 micras Bacteria 1-2 micras. Virus 50-100 micras.

• MICROSCOPÍA.

Es un sistema que proporciona una amplificación aparente de los objetos. Podemos encontrar;

• Ópticos que se basan en la proyección de un haz de luz sobre lentes.

• Electrónicos que posee un haz de electrones sobre lentes electromagnéticas.

• MICROSCOPIO ÓPTICO.

Tiene una lente con 1 o 2 superficies iluminadas por un foco y cuando se coloca un objeto se crea una imagen de este al otro lado de la misma. Tendremos dos distancias. Distancia focal y distancia del punto focal al objeto

F*F` = A * A`

El aumento de la lente es f/a y cuanto más aproximemos al punto focal mejor será la ampliación. El ojo humano es como una lente que modifica sus distancias focales pero no más próximos de 25 cm pudiendo detectar un objeto de 0`1 mm de diámetro.

En el siglo XVII comenzaron a desarrollarse los microscopios.

Simples como Lieverhov.

Compuestos que tienen tres sistemas de lentes como son:

• Condensador.

• Objetivo.

• Ocular.

Normalmente los microscopios tienen tres tipos de objetivos y estos multiplicados por la amplificación que consigue el ocular. Este es el esquema de un microscopio de campo claro. También nos tenemos que fijar en;

• El poder de resolución.

• Y en el grado de contraste de la muestra.

• El poder de resolución es distinguir dos imágenes diferentes de dos objetos que están muy juntos. El límite de resolución es la distancia mínima a la cual puede resolver.

D= 0`5 landa/ N sen alfa.

N es el índice de refracción de material que hay entre la lente y la muestra.

Landa es la longitud de onda de la luz que estamos usando.

Al producto de N * sen alfa es la apertura numérica donde alfa es el ángulo que forma la vertical a la lente con el rayo de luz más externo que entre a la lente.

Cuando menos distancia, mayor poder de resolución. Para bajar la distancia haremos:

• Podremos subir N*sen de alfa le podemos poner aceite de inmersión ya que N es de 1`5 ( N del aire =1)

• Si bajamos landa usando microscopios de luz ultravioleta que tiene menor longitud de onda. Solo subiendo dos veces el poder de resolución. Debemos verlos con cámara fotográfica. También debemos usar lentes de cuarzo.

• Grado de contraste de la muestra viene dado por que las células dejan pasar menos luz que el medio oscuro en el que están. El que deje pasar menos luz puede ser debido a que absorba dicha luz si el compuesto está coloreado.

También puede ocurrir que las muestras refracten la luz.

EL MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO.

Aprovecha la luz refractada, con un disco opaco entre la fuente de luz y el condensador, este disco es opaco excepto en una ranura central. Su función es dejar pasar solo los haces con una inclinación determinada, para que cuando pasen sin incidir en células de la muestra se saldrán.

Las que si son refractadas se desvían y ya si son recogidas por la lente del microscopio.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE.

La luz sabemos que es una radiación electromagnética que forma ondas. Estas ondas pueden estar en fase cuando coinciden sus crestas y valles y no fase.

Con diferente índice de refracción se modifica la fase por tanto diferente velocidad. Estas diferencias de fase pueden crear el fenómeno de interferencia haciendo que las ondas alcancen tipos altos y bajos de intensidad magnificando las diferencias de contrastes. Para eso usamos:

• Un disco situado en el condensador.

• Placa de fase entre el ocular y el objetivo.

MICROSCOPIO DE NORMASKY.

Se llama de contraste de interferencia diferencial. Aporta imagen tridimensional.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.

Absorbe luz ultravioleta pero emite luz visible. Solo se necesita que el condensador sea de cuarzo. No precisa cámara fotográfica. No hay demasiados compuestos fluorescentes en la naturaleza pero se les puede añadir unos colorantes a los que llamamos fluorocromos.

Dentro de la fluorescencia tenemos la inmunofluorescencia por ejemplo para localizar la distribución de una proteína en la célula adicionando anticuerpos fluorescentes contra es proteína y así aparecerá fluorescentes esa zona.

PREPARACIONES.

En fresco ponemos una suspensión celular en medio acuoso. Luego se cubre con un cubrebojetos.

Para teñir debemos:

• Extender la muestra hasta obtener un frotis

• Se fija la muestra con calor o con agentes químicos.

• Se añade colorante a los que llamamos

Hay colorantes:

• Básicos como el azul de metileno

La safranina. Son de carga positiva y se unen a ácidos nucleicos

Y a polisacáridos.

El cristal violeta.

- Ácidos como la eosina o el rojo congo. Son de carga neta negativa y se usan para

teñir proteínas de carga positiva.

• Neutras que obtenemos con la mezcla de los dos anteriores.

En ocasiones es necesario añadir un mordiente que se echa para favorecer la unión del colorante a una determinada estructura.

TIPOS DE TINCIÓN.

• Simple :

Solo sirve para aumentar el contraste de una muestra. Se usa para ver la morfología externa y las agrupaciones que pueden formar las cels.

El procedimiento para preparar es el ya citado.

• Hacemos un frotis.

• Fijamos.

• Añadimos el colorante.

• Lavamos y secamos la muestra.

• Negativa :

Se deja sin teñir las cels, se tiñe el medio se usa nigrosina o tinta china. Se parece a la microscopía de campo oscuro.

Vale para ver el perfil de la cel. Las cels no se fijan y por ello no se produce distorsión de la morfología cel. El procedimiento simplemente es el de echar el colorante en la suspensión cel.

• Tinciones diferenciales:

Se usan para distinguir los diferentes tipos bacterianos. La más conocida es la tinción de Gram 1884.

Para agrupar las bacterias en dos grupos G+ G- debido a la naturaleza de su pared.

Se pone cristal violeta.

Luego se añade el mordiente, en este caso lugol. Que produce cristales.

Posteriormente lavamos la muestra con etanol y las bacterias G- pierden el colorante.

Luego se añade safranina para dar un color de contraste.

G+ pared gruesa que se deshidrata cuando se añade el etanol. Se compacta la estructura y no deja

salir el colorante.

G- pared con muchos lípidos en la pared, con el etanol desorganizamos y pierden el colorante

debido a la porosidad.

• Tinción de ácido alcohol resistencia:

Se usa para identificar la posible presencia de bacterias del género, Nicobacteriun y Nocordia.

Estas esp tienen una pared con un alto contenido en lípidos.

Procedimiento:

• Tinción primaria con fusina y presencia de calor.

• Se lava con ácido-alcohol para decolorar.

• Se añade un azul de metileno para dar contraste y que todas las cel se vean azules excepto las nicobacterium y las nocordia resistentes al ácido-alcohol.

TINCIONES ESPECIALES.

• Tinción de cápsula.

Son posibles indicadores de patogeneidad. Son cubiertas polisacarídicas altamente hidratadas no fijan bien el colorante.

Hay dos técnicas:

• Tinción negativa seguida de una simple. Se ve fondo oscuro y cápsulas como un alo.

• Tinción simple con cristal violeta y se lava con sulfato cúprico que es azul turquesa y las cels salen violetas y alrededor un alo claro azul.

• Tinción de endospora:

Formas de resistencia con pared muy gruesa. Shaeffer-Falton.

Es una tinción diferencial que sigue este procedimiento:

Tinción primaria con verde de malatita aplicando calor para que penetre el colorante.

Lavado con agente decolorante en este caso H2O.

Tinción secundaria con safranina que es colorante de contraste.

• Tinción de flagelos:

Son de locomoción. Se les echa mordiente que se une al flagelo engordándolo anormalmente.

Luego se tiñe normalmente con fusina.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.

Consta de dos partes importantes:

• Haz de electrones dirigidos por un cañón electrónico.

• Sistema de lentes electromagnéticas.

Y todo se proyecta sobre una pantalla fluorescente que se observa através de un visor. Tiene un altísimo poder de resolución. La longitud de onda de un electrón es de 0.04 nm y el micro tiene una resolución inferior a 1 nm. Y unos aumentos de 200.000 veces.

Microscopio electrónico de transición.

Columna del microscopio en vacío y con muestra deshidratada debido al vacío y asi loas estructuras aveces se pueden presentar distorsionadas.

Los electrones tienen un poder de penetración débil no penetran objetos del tamaño de una célula y por eso hay que hacer secciones celulares.

El contraste en la micro electrónica se debe a la diferencia de masa atómica de sus elementos de la muestra. La masa atómica de los componentes cel es baja y no hay contraste y para subir el contraste se incrementa la masa atómica de esa muestra añadiendo sales de metales pesados pudiendo ser:

• Tinción + cuando se fijan los metales a las estructuras celulares.

• Tinción - cuando se aumenta la opacidad del medio fijándole los metales.

Se usan para virus e incluso macromoléculas.

Preparación:

Deshidratamos en material plástico que sustituye el agua y se queda como un bloque plástico.

Se realizan secciones de las muestra de grosor menor a 1º nm con un ultramicrotomo.

Luego se aplica la tinción. También aquí podemos realizar tinciones especiales como puede ser la de sombreado metálico donde se usan sales de Au y Pt. Se hace emitiendo un chorro de sales oblicuamente a la muestra. Así obtenemos imágenes en 3D.

La criofractura o el criograbado consiste en congelar la muestra y fragturarla. Se rompe por los orgánulos quedando expuestas la superficie del núcleo.

El criograbado es cuando se añade un chorro de carbono y se forma una máscara sobre la fragtura y asi se observa luego estas máscaras.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO.

Aporta imágenes en 3D prácticamente perfectas. Son muestras intactas y se liofilizan con Au o Pt. Tienen gran profundidad de campo de hasta mm y un límite de resolución de hasta 20 nm. De 20-10000 aumentos.

Su función consiste en un barrido con un haz muy fino de electrones que arranca electrones de la muestra que son recogidos por un receptor.

El contraste va a depender del número de electrones secundarios arrancados y también va a venir dado por el ángulo del haz que se incide y la superficie de la muestra.

TEMA 4: CULTIVO DE MICROORGANISMOS.

Es necesario estudiar poblaciones muy grandes para que nosotros veamos un efecto medible. Definidos en condiciones por parte del investigador.

Mixto cuando hay varios organismos.

Puro o axénico cuando solo hay un tipo.

Los microorganismos tienen gran diversidad y la composición de la cel es idéntica. Los componentes de cualquier cel son:

-H, O, N, C, P, S, en un 95% del peso seco.

-K, Ca, Fe, Mg, Mn, Co, Cu, Mo, Zn en bajas concentraciones.

Todos los medios de cultivo tienen que aportar estos elementos para el crecimiento de la cel. Elementos imprescindibles para la elaboración de un medio de cultivo son:

• Agua.

• H y O se saca del agua.

• Fuente de energía adicionable o no, si son fototrofos o quimiotrofos que hay que echársela.

• Fuente de C dependiente si lo necesitan o no será C ora o inorgánico heterótrofo y autótrofo.

• Fuente de N los hay que los usan orgánico e inorgánico o atmosférico N2.

• S orgánico e inorgánico o azufre elemental.

• El fósforo será en forma de sales inorgánicas.

• Oligoelementos Ca, K, Mg ... Se necesitan en trazas. En forma de sales o como contaminante de las sales anteriormente mencionadas.

• Factores de crecimiento son los compuestos orgánicos esenciales para un organismo y que no puede sintetizar.

Así Prototrofo puede crecer sin un factor determinado

Auxótrofo cuando necesita que se le añada (auxótrofo para leucina necesitará que le añadan la leucina.)

• Precisa de una disolución tampón que controle el PH.

Hay que hacer un crecimiento controlado del cultivo es decir por medio de un factor limitante que es uno de los nutrientes ya que los metabolismos de desecho pueden ser tóxicos y así lo controlamos.

Luego esterilizamos por calor y se inocula con el microorganismo que queramos crecer.

La incubación se hace a Tª constante. Hay tres tipos dependiendo de la Tª óptima.

• Psicrófilos que crecen mejor a baja temperatura de 10 a 15 ºC

• Mesófilos intermedios 30-40ºC

• Termófilos que crecen por encima de 40-50ºC.

Hay algunos que a más de 100ºC también viven y son los hipertermófilos.

También nos debemos fijar si el microorganismo es anaerobio o aerobio y si es anaerobio debemos eliminar el O2. Si es aerobio hay que moverlos constantemente para que el O2 este disuelto.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Composición químico: - sintéticos cuando el medio se puede reproducir una y otra vez.

- complejos cuando no se conoce su composición exacta y

y ningún medio es igual al anterior.

Estado físico:

• Líquidos.

• Semisólidos. Se obtienen adicionando + o - agar, este a menos de 45ª ya es sólido.

• Sólidos.

Los líquidos se inoculan en tubos o matraces. Los sólidos en placas de petri o tubos laminados.

Finalidad:

• Selectivos cuando se selecciona un tipo de organismo.

• Enriquecidos si hay un compuesto que favorece un organismo.

• Diferenciales cuando tienen alguna característica que permita diferenciar los microorganismo que crecen en ellos. Indicadores de PH.

Si trabajamos con líquidos usamos pipeta, con sólidos se usa el asa de siembra o de vidrio o de Digralsky.

MÉTODOS PARA CULTIVOS PUROS.

Obtención de colonias aisladas en placas.

*Siembra en estrías: se extiende en extrías por toda la placa y así las células van quedando aisladas.

*Siembra por extensión: se vierte la suspensión y se extiende bien por la placa. Aveces hay que recurrir al:

Método de diluciones seriadas.

Ya que al extender en placa habrá mucha población así que se va diluyendo y cuando se pasa a la placa cada vez tenemos menos colonias hasta que los conseguimos tener aisladas.

*Siembra por vertido: en vez de echarlo en la placa tras las diluciones mezclamos con medio sólido caliente aún fundido y luego se vierte en una placa.

Hay otras veces que el método de las diluciones se hace ya que los microorganismos solo crecen en medio líquido y que al final solo haya 1 microorganismo en el último de los tubos. Un problema es que con los cultivos se seleccionan poblaciones más abundantes. Para solucionarlo hay que usar combinando técnicas selectivas y de enriquecimiento.

Micromanipulaciones.

Permite aislar células individuales. Se toma con una aguja la célula que queramos y así lo traspasamos al otro sitio.

Si lo que queremos cultivar son anaerobios debemos fijarnos en la tolerancia que tengan al O2. A unos les da igual y otros se mueren.

• Si son anaerobios estrictos hay que usar cámaras selladas en las cuales se coloca dentro la muestra y desde fuera se manipula.

• Si son estrictos se hace en placas y se quita el O2 con bombeo de CO2 o N2.

• También se puede hacer con diluciones seriadas pero en medio sólido al principio fundido aparecerán las colonias.

CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS.

• Refrigeración: a 4ºC si se usa frecuentemente hay que hacer siembras periódicas.

• Sellado con aceite mineral. Es a largo plazo.

• Liofilización se congela la muestra y se seca al vacio.

• Congelación a 80ºC o 196ºC se consigue con CO2 sólido y con N2 líquido y es necesario añadir glicerol para que no cristalicen las proteínas y destruyan la estructura interna.

TEMA 5: ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCÍÓN.

• Esterilización: tratamiento que elimina cualquier forma de vida.

• Desinfección solo elimina formas vegetativas,

• Antisepsia desinfección sobre tejidos vivos.

• Germicida es un agente que provoca efecto irreversible o muerte.

• Microbiostático detiene el crecimiento pero su efecto es reversible.

Muerte de un microorganismo es la pérdida irreversible de su capacidad de reproducción. La cinética de la muerte de una población es exponencial. Si representamos el Log N con respecto a el T se obtiene una recta con pendiente igual a la tasa de mortalidad.

Eliminación de población: - Nº de células iniciales

- Tasa de mortalidad.

Efecto de los agentes antimicrobianos.

• Que provoca daño en la pared celular, protoplastos y lisis celular.

• Alteración de la permeabilidad de la membrana celular.

• Desnaturalización de proteínas o ácidos nucleicos.

• Inhibición de encimas específicos.

Factores que modifican la acción antimicrobiana.

• Características biológicas de los microorganismos.

• Tipos celulares.

• Estado fisiológico. Ya que en crecimiento son más sensibles.

• Condiciones ambientales.

• Ambiente ácido si se trata con calor es más eficiente.

• Con alta concentración de hidratos de carbono hay alta resistencia térmica.

• Con alta concentración de materia orgánica resisten mejor a desinfectantes.

Existen compuestos que son microbiostáticos a baja concentración y germicidas a alta concentración.

AGENTES ANTIMICROBIANOS FÍSICOS.

Temperatura.

La temperatura óptima de un microorganismo es aquella a la que presenta una mayor tasa de crecimiento. Límites de permisividad son la Tª máxima y la Tª mínima que soporta un microorganismo. A temperatura máxima es letal y a mínima detienen el crecimiento.

• Punto térmico letal es la Tª mínima que es capaz de matar a una población en 10 minutos.

• Tiempo térmico letal es el tiempo para matar a una población a una Tª cte.

• Reducción decimal del tiempo que es el tiempo necesario para matar al 90% de la población a una determinada Tª.

Tratamiento con calor húmedo. (Provoca la desnaturalización de las macromoléculas de la célula.)

Se usa el método de Vapor a presión con un autoclave que es una cámara cerrada donde sustituimos el aire por vapor de agua sometiendo al material a una presión extra de 2 atmósfera de presión con Tª superiores a los 120ºC durante 15 minutos. Así conseguimos la esterilización del medio. Se usa para medios de cultivo y soluciones acuosas no siendo recomendable para esterilizar recipientes vacíos y sustancias grasas ya que no toman bien la temperatura.

• Ebullición es de desinfección ya que no mueren las formas vegetativas.

• Tindalización esterilización por calentamiento discontinuo para sustancias que no soporta más de 100ºC.

• Pasteurización este es el que se aplica a la leche y bebidas. Elimina sustancias patógenas. Proceso 30` a 62ºC en la actualidad son 5`` a 72ºC. Se eliminan los más frecuentes como Nicobacterium tuberculosis y Coxiella burneti.

Tratamiento por calor seco.

Produce la oxidación de los componentes químicos celulares.

• Flameado de asas de siembra.

• Incineración de los desechos de hospitales.

• Esterilización por aire caliente en los hornos a 160º y 170ºC dos horas.

Tratamiento por frío.

Este se da en ocasiones. Es menos eficiente y depende del tipo de microorganismo que se quieren eliminar y es bacteriostático, no provoca la muerte y solo mata cuando se forman los cristales proteicos debido al frío.

Desecación: es bacteriostático y de poca utilidad con endosporas y virus. Pero hay microorganismos patógenos muy sensibles a la desecación.

Cambios de presión osmótica: efecto similar a la desecación. Se producen varios efectos:

Plasmolisis.

Se usa en salazones con concentración de sal del 10 al 15% o con concentraciones de azúcar como en mermeladas (70-50%).

Hongos y levaduras son muy resistentes.

Radicaciones.

• No ionizantes; luz ultravioleta.

• Ionizantes; rayos X.

• Luz ultravioleta.

Provoca mutaciones en el DNA y tiene poco poder de penetración.

Vale para la esterilización de salas y superficies. (Quirófanos y plantas de envasado.)