-INMUNOLOGIA

TEMA 1

Immunologia: Ciència que estudia la immunitat; és un estat de protecció front a les malalties, i més concret front a malalties infeccioses.

Tots els òrgans i teixits implicats en eixa immunitat es coneixen com a sistema immunitari o immunològic. La resposta global i coordinada que es posa en marxa després de l'entrada en l'organisme d'un component extern és la reacció immune o immunològica.

Tradicionalment s'associa la resposta immune a microorganismes patògens, la resposta immune dona també front a altres substàncies no reconegudes per l'organisme.

Resposta immune: Reacció de l'organisme front a substàncies estranyes, incloent microorganismes i altres substàncies o molècules estranyes, sense que tinga repercussió patològica o fisiològica.

La immunologia és l'estudi de la immunitat en el sentit més ample, i dels esdeveniments cel·lulars i moleculars que tenen lloc quan l'organisme entra en contacte amb altres microorganismes o molècules estranyes. De vegades no és necessària la entrada de organismes o molècules per produir resposta immune.

És una ciència jove, els orígens són els estudis de Jerek, que donaren lloc a la primera vacuna. La immunologia ha avançat pràcticament en els últims 90 anys.

Visió general de la resposta immune

Normalment els individus sans estan protegits per la resposta immune, i són capaços de destruir, neutralitzar o aïllar les molècules estranyes i fer fora el microorganisme.

El fonament de la resposta immune és el reconeixement com a estrany de un org, per fer això, els vertebrats han desenvolupat dos mecanismes, els específics, i els inespecífics.

Cada molècula de reconeixement estranya es diu antigen. No reconeixen tot el org com a tal, sinó menudes molècules d'aquest:

La resposta serà igual per a tots els antígens. Constitueixen una primera línia defensiva de l'organisme front a org

Una vegada es reconeix l'antigen, es posen en marxa mecanismes per eliminar-lo, i poden ser

• Cel·lulars. Mecanismes per a destruir l'antigen està basat en les relacions entre cèl·lules.

• Humorals. Formada per molècules, fonamentalment anticossos o Ig, que interaccionen amb els antígens.

Segons el tipus d'antigen predomina una o altra, però les dues naixen del reconeixement específic.

Dividim el sistema immune en tres parts:

• Els òrgans i teixits: Es coneixen com a òrgans limfoides.

• Primaris: Òrgans en els quals es formen i maduren totes les cèl·lules del sistema immune, sols són òrgans que tenen com a funció la preparació de les cèl·lules, per una part tenim la medul·la òssia (allí es formen totes les cèl·lules del sistema immune), i el timus (allí madura el limfòcit T)

• Secundaris: Són aquells en que es produeix el contacte entre les cèl·lules del sistema immune i l'antigen, és n es produeix el reactivament de l'antigen i l'activació de la resposta immune. Els ganglis limfàtics són cúmuls de cèl·lules del sistema immune distribuïdes per tot l'organisme, és important que siga així per poder reconèixer qualsevol invasió en l'organisme. Aquestos ganglis filtren tots els fluids extravasculars i reconeixen tots els possibles antígens. Existeix a més un teixit limfàtic associat a mucoses, MALT, que són cúmuls de cèl·lules immunoactives que es troben a les mucoses, com les plaques de Petcher a l'intestí.

També hi ha un sistema immunitari cutani, com les cèl·lules de Languerhans, que estan molt distribuïdes per reconèixer qualsevol antigen per tot l'organisme.

• Cèl·lules del sistema immunitari: Es divideixen en 2 grups, però tenen origen comú.

• Limfoide: Bàsicament els linfòcits B i T i les cèl·lules NK. Els linfòcits són de dos tipus, són les úniques cèl·lules de l'organisme que poden reconèixer antígens específicament, i ho fan gràcies a la presència en la coberta de receptors per a antígens.

• Els linfòcits B són capaços de reconèixer antígens lliures (sense processar per altres cèl·lules), i ho fan gràcies als anticossos de la seua membrana; com a resposta a eixe estímul, produeixen anticossos.

• Els linfòcits T també reconeixen antígens, però no en la forma nativa, sinó que prèviament han tingut que ser processats per altres cèl·lules i presentats als linfòcits associats a unes molècules que són les del complex principal de histocompatibilitat. Sols reconeix l'antigen si abans ha entrat en contacte amb altra cèl·lula i aquesta l'ha codificat presentant-lo a la superfície de la membrana.

Els linfòcits T expressen clusters de diferenciació (CD), hi ha 2 molt característics:

• CD 8: Linfòcits T citotòxics. La principal funció és la lísis de cèl·lules infestades.

• CD 4: Linfòcits T cooperadors. Representats per Th, aquestos tenen una funció reguladora de la resposta immune, per això produeixen les anomenades citoquines de naturalesa proteica. En funció del tipus de citoquina que produeixen aquesta Th es poden agrupar en:

• Th1: Produeixen les citoquines de tipus 1, que afavoreixen les respostes de tipus cel·lular.

• Th2: Produeixen citoquines de tipus 2, que afavoreixen la producció d'anticossos (resposta humoral).

• Les cèl·lules NK, són indiferenciades morfològicament dels linfòcits, la seua funció és molt semblant a la dels linfòcits T citotòxics, lisen cèl·lules sobre les quals s'ha dirigit la resposta immune.

• Mieloide: La principal característica és que al seu citoplasma tenen grànuls amb elements importants per a la resposta immune, les més importants són:

• Monòcit/macròfag: Es formen a la medul·la òssia, ixen a la circulació i migren a diferents teixits, en aquestos es diferencien a macròfags, i poden rebre noms diferents segons el teixit en que es troben. Els macròfags:

• Produeixen citoquines de tipus 1.

• Són els principals fagocits de l'organisme.

• Són les cèl·lules més importants en la presentació d'antígens als linfòcits T.

Les cèl·lules dendrítiques també ajuden als macròfags a presentar antígens als linfòcits T. De normal es coneix a les cèl·lules dendrítiques i macròfags com a cèl·lules presentadores d'antígens (APC).

• Granulòcits: Poden ser de 3 tipus:

• Neutròfils: Important perquè tenen capacitat fagocítica, igual que els macròfags.

• Eosinòfils: Important en processos al·lèrgics, o en la resposta immune front a helmints.

• Basòfils: Són importants en al·lèrgies.

• Mastòcits: Són cèl·lules presents en teixits, són molt importants en processos de inflamació o en al·lèrgies i en la resposta front a helmints. Tenen als grànuls substàncies com el factor quimiotàctic de anafilaxia (ECF-A) que atrauen quimiotàcticament a eosinòfils, afavorint respostes de tipus al·lèrgic.

• Molècules del sistema immunitari:

• Citoquines: Proteïnes produïdes per diferents cèl·lules, i alliberades a l'exterior de la cèl·lula, i que regulen la producció i la funció de les cèl·lules del sistema immune. Poden actuar activant la funció o la producció d'aquestes cèl·lules. Ex.: IFN-, IL-10.

• Anticossos o Ig: Són unes proteïnes sèriques produïdes o generades pels linfòcits B. Es formen per un procés que comença amb el contacte per l'antigen, però altres vegades cal la participació de citoquines com la IL-4 o la IL-10. Les funcions principals són:

• Actuar com a receptors dels antígens en linfòcits B.

• Destruir antígens per diferents mecanismes.

Les Ig estan composades per 4 cadenes polipeptídiques, 2 d'eles pesades (H), i 2 lleugeres anomenades L. Aquestes cadenes estan unides entre elles per ponts disulfur.

Desde un punt de vista funcional, un anticòs es pot dividir en 2 regions, la posterior, que és la fracció constant (Fc) i la anterior, que és la fracció cristalitzable (Fab).

La Fc és igual per a totes les Ig de un mateix tipus, per eixa fracció és per on s'uneixen a diferents components del sistema immune per tal d'activar mecanismes efectius contra l'Ag.

La Fab és diferent per a cada Ig, perquè és específica per a l'Ag que l'ha generat, per això es diu regió variable, i és per la qual s'uneix la Ig al Ag.

La unió de la Fc a la cèl·lula la activa. Totes les cèl·lules del sistema immune tenen diferents receptors per a fraccions constants de diferents tipus de Ig.

En funció de les diferències en les cadenes pesades es poden definir 5 isotipus de Ig.

• Ig G: Més abundant al sèrum. Hi ha 4 subtipus, de Ig G1 a Ig G4.

• Ig M: És pentamèrica, formada per 5 unitats d'anticòs, i en un procés infecciós és la primera que apareix. Els linfòcits la produeixen com a Ig de superfície.

• Ig A: És molt habitual en secrecions i mucoses en la forma dimèrica.

• Ig E: Té una concentració sèrica molt baixa, encara que està augmentada en determinats processos al·lèrgics i en la defensa de patògens de gran tamany.

• Ig D: És la menys habitual en sèrum.

• Molècules del complex principal de histocompatibilitat: Són importants en els processos de reconeixement dels antígens. Els linfòcits T sols reconeixen Ag. presents per les molècules del MHC. Aquestes s'expressen en la coberta de determinats tipus de cèl·lules. Hi ha dos tipus de molècules del MHC:

• 1: En els linfòcits T citolítics.

• 2: S'expressen tan sols en aquelles cèl·lules que actuen com a cèl·lules presentadores de Ag. com els macròfags i les cèl·lules dendrítiques. Estan implicades per part dels linfòcits T cooperadors.

La cèl·lula que actuarà com a presentadora de Ag. té que endocitar l'Ag, el següent pas és una degradació enzimàtica d'aquest en pèptids menuts. A continuació i al sistema retículo-endotelial es produeix l'associació dels pèptids amb molècules del MHC, i finalment el complex pèptid-molMHC és transportat a la membrana del macròfag, desde on pot contactar amb el limfòcit. Si són:

• De classe 1, la troba un Tc i lisa la cèl·lula.

• De classe 2, la troba un Th. Aquesta pot evolucionar a Th1 o Th2.

ESTRUCTURA DE LA RESPOSTA IMMUNE FRONT A PARÀSITS

La primera capa són els epitelis, es pot considerar com específica o inespecífica, i els patògens que la superen activaran primer la resposta inespecífica, i després la específica. Tipus de defensa que suposen els epitelis:

• Són la primera barrera que troba un agent infecciós extern per entrar en l'organisme.

• Suposen una barrera física.

• Barrera química per les substàncies i secrecions que poden afectar a l'agent patògen, com l'àc. làctic, la lisozima o les proteïnes de fase aguda.

• Constitueix una barrera biològica per la presència de una flora microbiològica normal que competeix amb l'agent infecciós pels recursos.

• Els que superen aquesta barrera causen la resposta immune.

RESPOSTA INESPECÍFICA

Els mecanismes que es generen inespecíficament són:

• Sistema del complement: Són un conjunt de 20 proteïnes sèriques, aquestes tenen la capacitat de interactuar entre elles o amb altres components per a dotar a la resposta immune de certes funcions. Aquest complement es pot activar de forma inespecífica per la via alternativa del complement, i s'activa per la presència en la coberta de les cèl·lules de molècules com lipopolisacàrids, o polisacàrids com la manosa. O per la absència de determinats factors que són necessaris per inactivar el

complement.

La conseqüència són tota una sèrie de reaccions en cascada que activen efectors front a antígens.

La C3b activa el complex d'atac a membranes, i lisa la paret cel·lular dels org.

Hi ha molts productes intermedis del complement que tenen altres característiques, com: augmentar la inflamació (que millora la resposta humoral), o fabricació de complexes immunoactius.

• Fagocitosi: Procés d'ingestió de partícules per part de cèl·lules del sistema immune que s'anomenen fagocits, i que són fonamentalment macròfags i neutròfils. Aquestos reconeixen inespecíficament els orgs a fagocitar per la presència de lipopolisacàrids, manosa o fragments del complement en la coberta d'aquestos.

Emeten pseudopodes que envolten el org, i l'engloben en l'anomenat fagosoma, a aquest se li uneixen lisosomes, que vessen dins del fagosoma els enzims que degradaran les proteïnes i destruiran el org. El org de dins del fagolisosoma es destrueix tant per enzims com per substàncies tòxiques com el H2O2, els radicals OH- o el òxid nítric, que són conseqüència de un augment de l'activitat respiratòria que té lloc als fagocits com a conseqüència de la fagocitosi.

• Cèl·lules NK: Tenen 2 funcions bàsicament

• La primera és la capacitat de lisar cèl·lules infectades o tumorals, en general cèl·lules que expressen antígens estranys. El reconeixement es produeix de forma inespecífica, perquè aquestes cèl·lules no expressen molècules del MHC.

• La activació dona lloc a la producció de citoquines (com l'interferó ), i és important als processos de retroalimentació i amplificació de la resposta immune.

• Inflamació: Mecanisme que té com a finalitat amplificar la resposta immune, i per altra assegurar la arribada de cèl·lules immunoactives a les zones on es troba l'Ag, a més d'afavorir el contacte amb aquest.

En ella participen cèl·lules tisulars com els macròfags o els mastòcits, que al activar-se alliberen:

• Substàncies vasoactives com la histamina, els leukotriens, les prostaglandines

• Citoquines de la inflamació i el factor de necrosi tumoral (TNF).

Es produeix vasodilatació de la zona afectada, s'indueix l'expressió de les anomenades molècules d'adhesió en les cèl·lules endotelials.

Aquestes molècules d'adhesió fixen diferents tipus cel·lulars. Seguidament hi ha un augment de la permeabilitat que permet el pas de cèl·lules immunoactives a través del teixit.

Després està la quimiotàxia, amb la qual, aquestes cèl·lules tisulars amplifiquen la resposta immune fent que s'acosten més macròfags, i augmenten la quantitat de factors actius a la zona.

Els macròfags tenen la capacitat de produir fibrosis al teixit al voltant de l'Ag, i l'aïllen de l'organisme.

RESPOSTA ESPECÍFICA

Es genera per l'activació de la resposta inespecífica. Els mecanismes que fa servir aquest tipus de resposta són els mateixos que empra la inespecífica; però en aquest cas està amplificada, i en segon lloc, produeix una focalització sobre els antígens que generen la resposta. Els dirigeix sobre Ag. específics.

La resposta immune específica és un procés complex, però podem diferenciar tres fases:

Els cooperadors produiran citoquines, aquesta part és fonamental per al desenvolupament de la resposta, perquè l'organisme ha de poder diferenciar entre cèl·lules pròpies i Ag.

Hi ha molts tipus de linfocits, però en relacio al tipus de resposta que provoquen es parla de:

• Ag inmunoINdependents: polisacarids i proteines amb epitops molt repetitius. Tenen capacitat per activar linfòcits B fins la producció final de Ig sense la ajuda de Linfocits T.

• Ag timodependents: activen elslinfocits B.però per poder produir Ig requereixla presencia de linfòcits Th.

Aquesta fase és fonamental per a determinar la resposta immune. Quan més linfocits es diferencien en Th1, menys ho faran en Th2, açò depen deles poblacions de citoquines presents:

• citoquines tips I! produccio de Th1

• citoquines tipus II!predomini de Th2.

També depèn del tipus de cèl·lules presentadores d'antigen, el tipus de antigen, el lloc on es produeix la presentació, o els factors genètics de l'hoste.

Els Th2 produeixen IL-4 i IL-10, que activen els Linfòcits B que han contactat amb antígens, augmenten la producció de anticossos, que poden tenir diferents isotipus en funció de les citoquines presents.

Per la fracció cristalitzable de les IgG i IgM s'uneixen a components de la resposta immune, activen els mecanismes efectors com el complement, que actuaran contra l'antigen, desgranularan les cèl·lules mieloides fent que el seu contingut actue sobre l'antigen, afectant-lo. Són les anomenades reaccions de toxicitat cel·lular mitjada per anticossos (IgG, A, M), i és molt important en antígens de gran tamany.

TEMA 2

El sistema immune és el conjunt de òrgans que participen a la resposta immune. Els òrgans són els sistema limfoide, i les cèl·lules es poden dividir en limfoides i mieloides. Tots actuen de forma coordinada, això exigeix una organització que permeti al sistema immune respondre front a diferents tipus de antígens, i que accedeixen al organisme per diferents vies d'entrada.

El sistema immune ha desenvolupat diferents tipus d'òrgans i de cèl·lules, de forma que es cobreix tot l'organisme. L'objectiu és per una banda respondre a antígens de les diferents vies, la resposta és diferent i específica per a ell, totes les cèl·lules del sistema immune tenen funcions diferents, però interrelacionades entre elles, be siga per contacte directe, per factors solubles o per molècules que secreten un tipus cel·lular que actua sobre altra cèl·lula.

Moltes d'aquestes cèl·lules són indiferenciades morfològicament, però poden ser-ho per la presència a la seua membrana de determinades molècules, a més, també serveixen per determinar certs estats d'activació o de maduració. Els CD no defineixen un grup de molècules, sinó aquelles de la coberta que han sigut identificades.

• Els T citolítics es diu que són CD4-, CD8+, CD3+

• Els T cooperadors són CD4+, CD8-, CD3+

Hi ha mes de 120 CDs, alguns sols serveixen per caracteritzar l'estadi evolutiu de la Cèl·lula. Moltes cèl·lules presenten receptors en superficie, bé per cèl·lules, bé per mol·lècules;aquests recepors s'anomenen: “mol·lècula -R”

Totes les cèl·lules del sistema immune són leucòcits, i totes tenen un origen comú, la medul·la òssia, i provenen del mateix tipus cel·lular, que és la cèl·lula mare pluripotencial present a la medul·la. El que es diferencien en un o altre tipus de cèl·lula, depen dels estimuls i necessitats de l'organisme, cosa que ve reguladaper factors de diferenciació, a saber: Factors estimuladors de les colònies (CSF).

Aquesta es diferencia al llinatge limfoide o mieloide; a més, entre elles trobem les cèl·lules accessòries:

• Cèl·lules limfoides: formen el 99% de les cèl·lules del timus. Poden ser linfòcits B, T o cèl·lules NK. Els linfòcits són el tipus cel·lular més important de la resposta immune, per què és l'únic capaç de reconèixer Ag. específicament i respondre front a ells. Hi ha 2 poblacions bàsiques, la B i la T:

• B Acaben la maduració a la bolsa de Fabricio en les aus, però en l'home ho fan a la medul·la òssia.

• T: Acaben la seua maduració al timus.

• Cèl·lules NK: Pertanyen a un grup de cèl·lules limfoides que no estan molt ben identificades, i no expressen ni CD4 ni CD8, les més ben identificades són les que expressen CD16 i es dediquen a lisar cèl·lules infectades o defectuoses.

Les cèl·lules limfoides es poden trobar a la sang perifèrica, i abans de contactar amb l'Ag es coneixen com a linfòcits verges. Fan de 8 a 10 m i tenen un nucli molt gran. Quan prenen contacte amb un Ag per primera vegada, la cèl·lula s'activa i comença la transformació blàstica, en eixe moment augmenta de tamany, i passa a ser de 12-13 m, i deixa més part de citoplasma lliure, i s'anomena linfoblast. A partir d'aquest punt s'arriba a una fase cel·lular, en la qual comença a dividir-se, i les cèl·lules limfoides es transformen en cèl·lules efectores o de memòria (viuen uns 2 mesos).

Ex: Linfòcits B es transformen en cèl·lules plasmàtiques i produeixen anticossos; i les t es transformen en Tc o Th, però una part es queden com a cèl·lules de memòria, i que no són funcionalment actives, però poden viure molts anys i preparen al sistema per a un nou contacte amb l'antigen que les ha generat, donant lloc a la resposta secundaria, que es molt mé ràpida i enèrgica degut a que ens estalviem tota la fase de diferenciació blàstica i proliferació; aquest és el fonament de la vacunació)

Hi ha altres cèl·lules linfoides anomenades Cèl·lules nul·les, de les quals les mes importants son les NK, amb capacitat per a lisar. El seu marcador principal es el CD16 i també tenen receptors per IgG, (açò últim les dona importància a les reaccions de citotoxicitat mijançant IgG!!!!)

• Cèl·lules mieloides: Les principals són el sistema fagocític mononuclear monòcit/macròfag. Inclou cèl·lules circulants (monòcits) i tisulars (macròfags), totes procedeixen de la medul·la òssia. Estan caracteritzades per tenir un nucli molt gran i nombrosos grànuls citoplasmàtics, fan més de 15µm.

A la seua superficie expresen receptors per IgG, per complement i LBP (receptors per lipopolisacàrid), aquesta última es la responsable de la capacitat de reconeixement inespecifica el macròfag.

Els macròfags reben noms diferents en funció del teixit on es troben: Al fetge cèl·lules de Küpffer, al pulmó macròfags alveolars, al sistema nerviós cèl·lules de microglia, als ossos osteoclasts.

Són el segon tipus de cèl·lules més importants de la resposta immune, perquè, a banda de complir moltes funcions, són molt importants coma nexe d'unió entre la resposta immune específica i la inespecífica.

Els macròfags tenen diferents funcions.

• FAGOCITOSI:

• A la inespecífica: mijançant LBP1 i complement.

• A la específica:per IgG, complement per via classica.

• Actuen com a presentadors de Ag, ja que expressen molècules del complexe d'histocompatibilitat I i II., produeixen IFN-, i també són els principals fagòcits.

• Són els principals fagocits i productors de citoquines de la inflamació(IL12) i de les que augmenten la producció de cèl·lules immunoactives. Estimulen l'hematopoesis.

• Produeixen determitats enzims(peroxidases), i factors del complement.

Alguns linfòcits en lloc de diferenciarse en macròfags ho fan en cèl·lules dentritiques, molt abundants als ganglis linfàtics, que actúen com presentadores d'Ag.

• Granulòcits: Grup de cèl·lules mieloides que contenen nombrosos grànuls citoplasmatics amb substàncies que no són immunoactives en la resposta immune; són els neutròfils, eosinòfils i basòfils. La diferenciació es fa per afinitat als diferents colorants.

• Neutròfils també s'anomenen polimorfonuclears (PMN) es així, perquè tenen nucli lobulat. Tenen capacitat fagocítica per la via específica o inespecífica, i la participació en la resposta inflamatòria. Tenen receptors perla IgG, factors del complement i citocines com la Interleukina8.

• Eosinòfils, tenen receptors per a Ig E, i participen a tots els processos de la resposta immune citotoxics als que participel'Ig, com les al·lèrgies. Tenen capacitat fagocítica, pero com son pocs no es molt important.

• Basòfils, també tenen receptors per a Ig E, i quan es desgranulen alliberen substàncies vasoactives com la histamina alèrgies i inflamació. Actuen en processos al·lèrgics o en la resposta front a helmints.

• Mastòcits: de funcio i caracteristiques similars als macròfags. Són cèl·lules tisulars, per això no és normal trobar-les en circulació. També tenen receptors per a Ig E, i per això són importants contra les al·lèrgies i front als helmints. En aquest cas, el contacte de la Ig E provoca el desgranulament, alliberant substàncies vasoactives o quimiotàctiques (ECF-A) que atrauen als eosinòfils.

Mort cel·lular programada i Apoptosi:

Totes les cèl·lules del sistema immune es produeixen per hematopoesis. Aquest procés té lloc de forma continua, de manera que es fa necessari un mecanisme que controla les poblacions cel·lulars, aquest és la apoptosi. Ex: Fent referència al concepte de que diferents tipus cel·lulars tenen programada la mort si no són salvats per factors de creixement i supervivència (Ag, citoquines...).

Totes les cèl·lules del sistema immune estan preparades per a morir d'apoptosi, excepte quan són salvades específicament. Ex: El contacte amb un Ag. Els linfòcits defectuosos, els que no contacten amb l'Ag, o aquells que han estat estimulats fa molt de temps i no contacten amb nous Ag. moren per apoptosi, ja que aquest procés salva específicament a les cèl·lules del sistema immune que són útils.

PROCÉS D'APOPTOSI

• Disminució del volum cel·lular

• Debilitament de la membrana

• Condensació de la cromatina i degradació del DNA.

• Mort cel·lular.

Mort cel·lular induïda per activació

És fonamental per al manteniment de la tolerància, per la qual les cèl·lules del sistema immune no poden reaccionar front a Ag comuns o front al propi organisme. Per a que es genere tolerància ´se fonamental la mort cel·lular induïda per activació, que indueix la mort cel·lular d'aquelles cèl·lules que reconeixen autoantigens, o aquells estimulats repetitivament per un Ag.

ORGANS LIMFOIDES

La resposta immune està basada en la interacció entre cèl·lules i molècules, però calen uns òrgans que asseguren la formació i el contacte entre ells. Ací es formen i concentren les cèl·lules del sistema immune, i on són transportats els Ag.

• Òrgans limfoides primaris: Es formen i maduren les cèl·lules del sistema immune, i són : la medul·la òssia i el timus.

• Medul·la óssia: Ací es formen totes les cèl·lules del sistema immune als adults; en els xiquets, participen a més el fetge i la melsa. Es troba principalment al esternó, a les costelles i als òssos iliacs, i en ells es formen totes les cèl·lules a partir de la cèl·lula mare pluripotencial. L'hematopoesi i el ritme de producció depèn directament de la presència de factors estimuladors de colònies (CSF), que són les citoquines produïdes per alguns tipus cel·lulars del sistema immune, que el propi sistema pot controlar. Els CSF més importants són:

• IL-3 (multifactor estimulador de colònies=multiCSF) ! estimula l'ematopoiesi general. Està produïda per linfòcits T activats.

• GM-CSF ! Estimulador de granulòcits i macròfags. Produït per linfòcits T, macròfags i neutròfils.

• G-CSF ! estimulador de granulocit.

• M-CSF ! estimulador de macròfags.

• Timus: Es considera primari, perquè en ell maduren els linfòcits T. Podem diferenciar:

• la medul·la interna: rica en en cèl·lules epitelials del propi organisme i cèl·lules presentadores d'Ag.

• la externa, rica en timòcits (Linfòcits T immadurs).

Al madurar, els timocits van desplaçant-se cap a la part interna i travessen una malla de cèl·lules presentadores d'Ag (cèl·lules epitelials, macròfags i cèl·lules dendrítiques). Els linfòcits que reaccionen amb la malla són eliminats, i a la circulació sols arriben aquells que no reaccionen amb autoantigens. Els que superen el procés aniran als òrgans limfoides per a establir contacte amb l'Ag.

• Òrgans limfoides secundaris: Es produeix el contacte i reconeixement dels Ag per part de les cèl·lules del sistema immune, són: ganglis limfàtics, melsa i teixits distribuïts per tot l'organisme, com els teixits limfàtics perifèrics.

• Ganglis limfàtics: Són agregats nodulars que es disposen al larg del sistema limfàtic. La funció d'aquest òrgan és recollir fluids i teixits que s'han extravassat, aquestos ganglis els filtren i els retornen cap a la sang.

Dins d'aquestos ganglis trobem molt linfòcits T i B, al filtrar residus es produeix el contacte entre Ag i linfòcits, de forma que es produeix reconeixement dels Ag que entren per via respiratòria, gastrointestinal o subcutania.

• Melsa: Té una funció similar, però ací es filtra la pròpia sang. Es produirà el reconeixement dels Ag presents a la sang.

• Teixits limfoides distribuïts per l'organisme: Així assegurem el contacte Ag-Linfòcits. Encara que els conformen agregats de cèl·lules immunoactives, són vertaders òrgans limfoides. En totes les mucoses trobem teixit limfàtic associat a mucoses (MALT), al tracte gastrointestinal les Plaques de Peyer i a la pell els sistema immunitari cutani format per cèl·lules de Languerhans.

TEMA 3. ANTIGENS

El sistema immune té la funció de la defensa de l'organisme front a microorganismes i altres substàncies de l'exterior. La resposta immune sols s'activa després d'un contacte amb els agents de l'exterior, i qualsevol d'aquestos que siga capaç de desencadenar resposta immune s'anomena immunògen.

La immunogènia es defineix com la capacitat d'una substància per generar una resposta humoral o cel·lular.

Un immunògen és la substància que activa la resposta. Antigen és la substància que és capaç de unir-se específicament als receptors dels linfòcits o a les Ig formades, independentment de que genere resposta. Ex: els haptens són agents que s'uneixen al receptor , però no generen resposta.

Moltes vegades els haptens estan units a un transportador (carrier) amb el suficient tamany per a que es desencadene la resposta. L'hapté seria el Ag, i el conjunt l'immunògen.

El conjunt de Ag que presenta un immunògen es diu mosaic o repertori antigènic.

La unió que s'uneix al Ag és l'epítop o determinant antigènic, de forma que un Ag pot tindre molts epítops, i cadascun d'ells activar diferents clons limfocitaris, així es produeix l'activació policlonal.

El Ac monoclonal té especificitat per un sol epítop. Un microorganisme és un conjunt molt gran de Ag, és el mosaic antigènic, i com a conseqüència un únic microorganisme és capaç de generar l'activació de molts clons diferents de cèl·lules immunoactives.

• Antígens d'excreció-secreció metabòlica. Hi ha que pensar que el microorganisme és un conjunt de molècules vives, que produeix substàncies que al ser expulsades dins de l'organisme, aquest les considera Ag, i que provoquen resposta antigènica.

• Estructurals, són components de la pròpia estructura del microorganisme.

Com que un microorganisme està compost de tantes molècules, no totes generen resposta, i per tant es parla de epítops immunodominants quan generen una major resposta.

No totes les molècules generen la mateixa resposta, sinó que la immunogènia d'un Ag varia en funció de diferents factors, que són :

• Naturalesa del Ag: Les més immunògenes són les proteïnes macromoleculars. Normalment, quan parlem de Ag es tracta de una proteïna, encara que poden hi haure Ag formats de polisacàrids.

• La immunogenia depén del tamany de la molècula, cal un tamany del almenys 5 KD per a produir una resposta, i com major siga major resposta hi haurà, perquè hi hauran més epítops.

• La composició de la molècula també influeix, i com més complexa és la composició, major resposta

• La susceptibilitat del Ag a ser processat. Ex: els Ag insolubles són més antigènics, etc…

La estructura del Ag és molt important, tant la primària com la terciaria. La estructura del Ag ve determinada per una cadena lineal de aminoàcids, i aquestos ja representen un Ag; però existeix a més un altre tipus de Ag, el conformacional, que són els Ag formats per les series de aminoàcids allunyades del nucli de la molècula i que donen lloc a la conformació espacial del Ag. Aquestos epítops es perden al desnaturalitzar-se la proteïna.




• Mode d'exposició a l'Ag:

• La dosi del Ag: Cada Ag presenta una corba dosi-resposta. Hi ha concentracions de llindar màximes i mínimes, per dalt o per baix d'aquestes no hi ha resposta.

• La via d'administració de l'Ag és molt important, ja que en funció d'aquesta, el reconeixement es produirà en un òrgan limfoide o en un altre, i com a conseqüència la resposta serà diferent.

• La pauta d'administració també s'ha de tenir en compte, ja que el contacte amb l'Ag de forma sovint millora la resposta.

• Una administració conjunta de immunògens i adjuvants milloren la resposta, ja que són substàncies que junt amb l'immunògen augmenten la immunogènia de l'Ag, degut a que:

• Augmenta la persistència de l'exposició

• Provoca la formació de granulomes induint una resposta inflamatòria.

• Estimulació inespecífica

• Augment de la senyal coestimuladora. Per activar-se el limfòcit, cal una senyal de coestimulació.

• Factors dependents del receptor:

• Edat: Com més jove és el pacient, i gual que si és molt vell, la resposta és de baixa intensitat.

• Estat nutricional o fisiològic

• Consum de fàrmacs que augmenten o disminueixen la resposta immune.

• Factors genètics, etc…

EPÍTOPS: Els epítops que reconeixen uns i altres Ag són diferents, i es parla de :

• Epítops de cèl·lules B: En aquest cas han de ser reconeguts per Ig, be de superfície o produïdes per les cèl·lules B. En qualsevol cas l'Ag ha de ser reconegut en la seua forma nativa, sense processament, i per tant ha d'acomplir unes condicions:

• Accessibilitat: L'estructura és molt important, perquè han d'estar exposats a l'exterior de la cèl·lula B, ja que la Ig no pot entrar dins del Ag.

• Tamany: Ha de ser l'adequat per a que l'Ig puga unir-se a l'epítop. HA de ser de almenys 700Å

La zona complementaria a la que s'uneix és el paratopo. Els més senzills poden tenir de 3 a 6 aa, però poden arribar a tenir-ne 20, però en el cas de les cèl·lules B no és tan important el nº de aa com l'espai que ocupen.

• Epítops de cèl·lules T: Les condicions de accessibilitat i tamany ja no es tenen en compte, perquè l'Ag ha de ser processat, cosa que inclou la degradació del Ag en pèptids molt més menuts. Per tant, les cèl·lules T no van a mostrar afinitat per epítops presents a les superfícies dels Ag, i molt poques vegades, les cèl·lules T són capaces de diferenciar característiques conformacionals del Ag. Els epítops de cèl·lules T no sols actuen com a blancs del T citolítics, sinó que també activen T cooperadors, en concret Th2 que generaven resposta humoral.

Per a que un limfocit T genere anticossos, cal que un limfocit T reconega un epítop de cèl·lula B.

És la senyal coestimuladora. El T i el B han d'estar activats pel mateix Ag.

• Mitògens: substàncies que indueixen de forma nespecifica la proliferació de linfocits. També sonanomenats activadors policlonals perque creen una proliferació policlonal de linfocits.

• LPS

• Lectines: CARCANAVALINA A (CoA).que acceleren la mitosi.

No es coneix masa bé el seu mecanisme d'acció, però espensa que la prliferació ve quen contacten amb la membrana dels linfocits.

• SuperAg: substàncies que activen inespecificament els linfòcits que s'uneixen a una cadena del seu receptor per Ag que no es la regió d'unió amb l'Ag. Són importants perque son la causa de la patogenia de molts organismes, com la SEA SED (enterotoxina s'estaphilococcus que actuen com Ag) que activen inespecificament els linfocits T provocant superproducció de citoquines, que son la ppal causa de la patologia en infeccions per Staphilococcus.

Hi ha moltes altres toxines bacterianes que poden actuar com superAg.

TEMA 4. GENERALITATS DE LA DIFERENCIACIÓ CELULAR DELS LINFÒCITS

Els linfòcits són la població cel·lular més important de la resposta immune que poden reconèixer específicament Ag, però no constitueixen una població homogènia, sinó que es poden diferenciar en subpoblacions segons els mecanismes de reconeixement del Ag:

• Linfòcits B: Tenen com a receptors Ig de membrana BCR. Són capaços de reconèixer Ag lliures, i com a conseqüència produeixen i secreten Ig.

• Linfòcits T: Tenen com a receptors de membrana els propis de les cèl·lules T: TCR. Sols reconeixen Ag processats per altres tipus cel·lulars, i presentats en associació a les molècules MHC. Les conseqüències d'aquest reconeixement són diferents per a cada limfòcit, una d'elles és prendre la capacitat de lisar cèl·lules (cas dels T citolítics); altres alliberen citoquines (tipus 1) i afavoreixen la resposta cel·lular; i els de tipus 2 que augmenten la producció de Ig.

En el procés de diferenciació cel·lular, tots els linfòcits són molt semblants, però realment hi ha diferències molt específiques.

• Tots els linfòcits es formen a la medul·la òssia a partir de la mateixa cèl·lula mare troncal o pluripotencial. Una part dona lloc al llinatge limfoide (limf T, B i cèl·lules NK):

• La maduració dels B es produeix completament a la medul·la òssia.

• Els precursors dels T han d'emigrar al timus per a madurar

• Les primeres etapes de la diferenciació dels linfòcits estan caracteritzades per l'expressió dels gens, sobretot expressen:

• receptors per a factors de creixement.

• factors de transcripció.

• Els precursors es caracteritzen per estar dividint-se per mitosi contínuament, i garanteix el repertori de especificitat dels linfòcits.

• Cada receptor té una especificitat diferent, un pas molt important és que aquesta s'ha de definir abans dels contacte amb l'Ag.

• El contacte amb l'Ag no produeix l'especificitat, aquesta es fa abans del contacte amb l'Ag.

RECOMBINACIÓ SOMÀTICA

En una persona hi ha un total de 109 especificitats diferents, aquestes no poden estar escrites al ADN, i es produeixen per la recombinació somàtica. Una cèl·lula normal té uns gens dedicats a l'expressió d'eixos receptors, el que fa és que retalla trossos d'eixe gen, els uneix i els transcriu.

Això s'aconsegueix gràcies a l'enzim recombinasa, un aspecte important de la recombinació somàtica que es produeix a l'atzar, i això dona lloc a un pool important de linfòcits amb especificitats diferents,

• reconeixeran Ag.

• reconeixeran autoantigens.

• No reconeixeran res.

Els dos últims s'han d'eliminar, i es seleccionen els que poden ser útils, i això es realitza en els processos de selecció limfocitaria (que serà positiva) i es conservaran les especificitats útils. En la selecció negativa s'eliminen els que no són útils i els que reconeixen autoantigens.

Després de la selecció, els linfòcits adquireixen competència funcional, ho fan acoblant-se molècules que participaran en la resposta immune, i que permetran al limfòcit activar-se quan contacta amb l'Ag.

Aquestos processos tenen lloc tant en la diferenciació de B com de T.

LINFÒCITS T

Aquestos són capaços de reconèixer específicament Ag per la presència del receptor TCR. Aquest receptor té la capacitat de reconèixer Ag associats a mMHC, però no pot reconèixer Ag lliures. Els linfòcits T són un grup molt heterogeni de cèl·lules que comparteixen una forma similar de reconèixer Ag i un receptor de reconeixement antigènic semblant.

El TCR és un conjunt de proteïnes que estan presents en la membrana dels linfòcits T. Hi ha 2 versions d'aquest receptor: T i T




• T : Aquest és el més important. És un conjunt de molècules:

• Monomòrfiques: Iguals en tots el TCR. Aquestes no poden participar al reconeixement dels Ag, sinó que participen a la unió o ancoratge de cèl·lules diana, o be a la transducció de senyals posteriors al contacte amb l'Ag. Els CD3 i les cadenes  produeixen senyals que tenen com a conseqüència l'activació d'una sèrie de gens.

• Polimòrfiques: Són diferents en cada limfocit, i determinants de l'especificitat.

• T :Aquest està present en molt pocs linfòcits, i no es coneix be la funció que tenen aquestos, però es pensa que està relacionat amb la lisis cel·lular o la diferenciació entre Ag extra o intracel·lular per a dirigir la resposta.

Un limfòcit tan sols pot tindre un d'aquests receptors.

A més hi han una sèrie de molècules accessòries a la coberta dels linfòcits T que ja no formen part del receptor, i poden unir-se a molècules del MHC o a altres molècules presents a la cèl·lula presentadora de Ag o a la cèl·lula diana, i així, poden participar en la transducció de senyals que condueix a l'activació dels linfòcits T. Altres molècules poden fer que els linfòcits T queden retinguts en determinats teixits participant al procés d'inflamació. Són molt variades (CD 28, CD 45, etc…) que participen a la transducció de senyals, però les més importants són la CD 4, i la CD 8. Aquestes molècules permeten diferenciar 2 poblacions de linfòcits T:

• CD 4: Característica dels T cooperadors. És monomèrica i s'uneix a les mMHC de classe II.

• CD 8: Característica dels T citolítics. És dimèrica, i s'uneix a mMHC de classe I.

La seua funció principal és unir-se a les molècules del MHC (són molècules de la superfamilia de les Ig).

La trasduccio del senyal dels receptors fins el nucli es fa mijançant fosforilacions/-->desfosforilacions[Author:A.T.B.]

Diferenciació dels Linfòcits T:

Les cèl·lules T es formen a la medul·la óssia, encara que abans de que expressen CD 4, CD 8 o TCR, han d'emigrar al timus, on té lloc la maduració d'eixes cèl·lules, al llarg d'aquesta maduració passa per diferents estats de maduració, en aquesta fase van expresant-se diferents marcadors de superficie que poden ser molècules accesories, o el mateix receptor.

• Cèl·lula pro-T, que es troba al timus, no expressa CD 4, CD 8 ni receptor.

• Celula Pre-T, que comença a expressar un prereceptor, i també s'anomena cèl·lula T doblement negativa, perquè no expressa ni CD 4 ni CD 8.

• Cèl·lula T doblement positiva, ja que expresa el receptor, i a més, CD 4 i CD 8; ací començen els processos de selecció del limfocit T(positius i negatius).

• Cèl·lula T de una única positivitat, perquè expressa tan sols CD 4 o CD 8. Ací acaba la selecció

• Cèl·lula T madura, abandona el timus i va a la circulació i als òrgans limfoides.

Els passos més importants són els processos de selecció. Poden hi haure especificitats autoreactives, abans que surten a la circulació, per això han de ser seleccionats. Aquesta selecció pot fer-se de forma:

• Positiva: Aquesta promou la supervivència dels linfòcits T amb un TCR restringit per mMHC

• Negativa: S'eliminen els linfòcits que s'uneixen a mMHC amb massa intensitat.

S'eliminen el 99% de lers especificitats que es produeixen, però aquest procés de selecció planteja un problema. El que no pot fer l'organisme és presentar tots els autoAg al timus, però ací es defineix si el limfocit T evoluciona cap a Th o Tc.

La diferenciació es fa per contacte amb les cèl·lules epitelials del timus.

TEMA 5. LINFÒCITS B

Els linfòcits B són el segon tipus de linfòcits implicats en la resposta immune, i poden reconèixer específicament els Ag, però de forma diferent als linfòcits T.

A nivell de reconeixement:

• Els linfòcits B no estan restringits al MHC, ja que no sols reconeixen Ag lligats a mMHC, sinó també a Ag lliures, i que no hagen estat processats per altres tipus de cèl·lules.

• El receptor per a Ag és diferent, BCR, ja que en realitat és una Ig.

A nivell de conseqüències del reconeixement:

• El limfocit produeix i secreta Ig front, o específiques per al Ag reconegut.

• És una Ig amb les mateixes característiques que les de secreció, sols hi ha una diferència estructural en l'extrem carboxiterminal de la fracció constant que li permet fixar-se a la membrana.

Normalment es tracta de una Ig M o una Ig D amb modificacions a l'extrem -COOH terminal, és la part del receptor conegut com a regió polimòrfica. És diferent per a cada limfocit, a més, al receptor de les B hi ha una regió monomòrfica composada per dímers de 2 cadenes  i 2 que tenen un domini d'Ig, i s'anomenen CD97. Són iguals per a tots els linfòcits, i no participen al reconeixement del Ag, perquè no contacten amb ell. La seua missió és participar en la transmissió de senyals que condueixen a l'activació del limfocit.

Tots els linfòcits B expressen a la superfície Ig M (en aquest cas no es pentamèrica), i molts també Ig D, no hi ha altres que s'expressen en la superfície dels linfòcits; sols quan han sigu estimulats pot ocorrer que canvien l'Ig de superficie per una IgA, IgE...

A més expressen en superficieb tota una sèrie de molècules accesòries com el CD 19, el CD 20, CD 40, CD 25, MHCII, i majoritàriament, eixes molècules són receptors per a IL encarregades de la transmissió de senyals de la superficie fins al nucli.

També expressen molècules que ajuden a fixar la cèl·lula diana o cèl·lula presentadora de Ag, perquè no hi ha cèl·lula diana, ja que s'enfronten amb Ag lliures.

DIFERENCIACIÓ DELS LINFOCITS B

Tota la evolució té lloc a la mèdul·la òssia on es formen els progenitors limfoides, i depén dirèctament de l'acció de determinades citoquines, i és molt important que el limfocit expresse receptors per a eixes citoquines durant la maduració.

Les citoquines més importants són les SCF (Factor Estimulador de Cèl·lules troncals Pluripotencials), aquesta és la primera citoquina que intervé. L'acció d'aquesta és l'expressió en el limfocit B dels receptors per a IL 7R, que és la segona citoquina que activa el limfocit, iafavoreix l'evolució del linfocit de cèl·lula pro B a pre B, i així continua una cadena de activació de les citoquines que acaben activant el limfocit.

En la seua carrera, el limfocit B passa per diferents estats evolutius:

• Cèl·lules proB: No expressen receptor per Ag (Ig), però si per a citoquines.

• Cèl·lules preB: Es comença a expressar un prereceptor de Ag.(la cadena pesada d'IgM)

• Cèl·lula B immadura: que expressa exclusivament IgM en la seua superficie.

• Cèl·lula B madura: Expressen IgM i IgD a la coberta, son les anomenades IgM+, D+.

Al final d'eixa evolució hi ha processos de selecció negativa,: a la medul·la òssia contacten amb moltes cèl·lules presents en condicions normals que expressen Ag propis. Aquells linfocits que reconeguen aquestos Ag seran eliminats. Tan sols els linfocits Bque no reconeguen cap Ag sortiran a la periferia, complint les seues funcions pròpies:

• producció d'Ig per neutralitzar Ag.

• Presentar Ag (APC).

El pas més important d'eixa evolució són la fase final de proB i la preB, perquè en eixes dues etapes es produeix el reordenament de les Ig, que dona lloc a les diferents especificitats de les Ig dels linfòcits B, en aquest procés es produeix un reordenament de gens per tal de donar diferents recombinacions per poder-se cobrir un espectre de Ag molt gran.

RECOMBINACIÓ SOMÀTICA:

La diversitat contra Ag no pot estar codificada al genoma, i s'explica degut a que a les cèl·lules B hi han gens que es troben relativament prop, i son barrejats per una RECOMBINASA de forma aleatòria. Els gens que codifiquen per les cadenes lleugeres s'anomenen gens J, V, i C, s'ha d'afegir uns gens de tipus D(sols per cadenes lleugeres), que són de diversitat.

• V: variabilitat

• J: unió.

• C: constatnt

El resultat final és una Ig amb una especificitat diferent per a cada limfocit B, i el procés es produeix tant per a cadenes pesades com per a lleugeres.

La fracció constant determinarà el tipus d'Ig: !A, !E, !G.

No es coneix be el mecanisme que regeix el procés de regulació gènica, però es creu que el procés de regulació somàtica es produeix abans del contacte amb l'Ag. A pesar d'això no es possible justificar la gran varietat de Ig que es produeixen, perquè hi han més processos implicats en eixa variabilitat, principalment:

• Diversitat d'unió: Els processos de mutació somàtica no són precisos, i en cas de que eixe tall es produeixca un nucleòtid abans o després és important, perquè el marge de lectura d'eixe gen canvia. Degut al sistema de lectura per triplets, hi ha tres possibles marcs de lectura.

• Hipermutació somàtica: té lloc després de la recombinació gènica. Implica la introducció de mutacions puntuals tant en cadenes lleugeres com en les pesades.

Es generen gran quantitat de linfòcits T específics front autoAg, i per això han d'estar sotmesos a processos de selecció. En el cas del B, la selecció comença a la medul·la òssia, i de forma negativa; al cas de Ag més menuts, el estímul no és suficient, i simplement les torna anèrgiques (no reactives).

Els que no reaccionen front a Ag propis passaran a la circulació perifèrica, on continuaran els processos de selecció i als òrgans limfoides.

Alguns autors reconeixen 2 subpoblacions de linfòcits B,

• els B1, que expressen CD 51. Són pocs i restringits a la cavitat peritoneal, sols expressen IgM, però les produeixen molt ràpidament (possible causa que justifica la ràpida formació de IgM)degut a que són poliespecífics (reconeixen diferents Ag).

• B2, no expressen CD 51. Són els linfòcits normals, als que ens referirem d'ara en avant.

TEMA 6. CARACTERÍSTIQUES DE LES IG

El fonament de la resposta inespecífica és el reconeixement inespecífic del Ag. Les Ig són els principals responsables de la immunitat humoral, i eixes Ig que són glucoproteïnes sèriques poden trobar-se en forma soluble al sèrum (participant a processos de neutralització de l'Ag) o presents a la memebrana de les cèl·lules T. Es parla de Ac quan són les formes solubles i secretades pels linfòcits B. Eixes Ig tenen la funció de contactar amb un Ag, i posar en marxa tota una sèrie de mecanismes biològics, que poden ser:

• Activació de cèl·lules B

• Posada en marxa de mecanismes efectors de la resposta immune sobre l'Ag per a destruir-lo.

Estructura de les Ig:

Totes les Ig tenen una estructura semblant. Una Ig està formada per 4 cadenes polipeptídiques iguals 2 a 2. 2 cadenes pesades (H) de 55 a 77 kD unides entre elles per ponts disulfur.

Les altres cadenes, anomenades lleugeres (L) s'uneixen a les pesades també per ponts disulfurs.

Quan es tracta la Ig amb una proteasa (papaïna), aquesta la talla per la zona de la bisagra permetent diferenciar 2 regions,

• Fab: Extrem N terminal, de l'anglés “antigen binding”, és la regió per la qual es reconeix i s'uneix l'Ag.

• Fc: Regió que pot cristalitzar, és la responsable de la funció biològica de les Ig. Açò és perque hi ha moltes cèl·lules amb receptors per la Fc, que al reconeixer una Ig unida a l'Ag, s'activen front eixe Ag.

Fc és identica per a tots els isotipus d'Ig; mentre que Fab es diferent per a cada clon linfocitari, però igual entre la descendencia de cadascún dels clons.

L'estructura de la Ig està constituida per una estructura bàsica que es repiteix:

• 4 vegades a les cadenes pesades.

• 2 vegades a les cadenes lleugeres.

És el domini de Ig, eixos dominis són en realitat dobles cadenes  de polipèptids, cadascuna d'elles formada per 4 hèlix antiparaleles. Aquestos estan presents també en altres proteïnes, i totes aquelles que presenten eixos dominis pertanyen a la superfamilis de les Ig.

Els dominis de Ig poden ser de 2 tipus, constants (C) o variables (V). Les cadenes lleugeres i les pesades presenten únicament un domini variable, que es troba sempre a l'extrem N-terminal de les cadenes (VL, VH). Aquest determina l'especificitat d'eixa Ig, per això se l'anomena lloc d'unió amb l'Ag.

En aquest extrem es concentra la variabilitat de la Ig, però no és uniforme, ja que les cadenes formen bucles, de forma que deixen 3 seqüències de 10 aa cadascuna exposades al Ag.. Cada regió s'anomena CDR (regió determinant de la complementarietat); també s'anomena regió hipervariable. La resta d'eixos bucles s'anomenen regió marc o FR, aquesta pot aportar flexibilitat a la regió hipervariable, de forma que es pot unir a seqüències més o menys properes, segons la flexibilitat que li done eixa regió.

La resta de les cadenes està composada pels dominis constants, que són iguals per a cada classe de Ig.

La regió bisagra formada per 10-50 a.a. entre CH1 i CH2 també dona flexibilitat, i és molt important per a la Ig ja que é la que premet l'unió a 1 o 2 Ag.

Classes i sub-classes d'Ig:

Hi ha 2 tipus de cadena lleugera, les  (60%del total de les cadenes lleugeres)i les , la presència d'un o altre tipus de cadena lleugera no pareix traduir-se en diferències funcionals. Cada tipus de Ig tindrà una sèrie de característiques diferencials.

Hi ha 5 tipus de Ig, diferenciades per la regió constant:

• Tipus  ! Ig G: És la Ig sèrica més abundant. Hi ha 4 tipus de cadena , i per tant 4 subclasses:

• G1.

• G2.

• G3.

• G4.

• Tipus  ! Ig A: Molt poc abundant en sèrum, però molt en mucoses i secrecions, té cadena J al final de la Fc, i sol formar dímers. En eixa regió d'unió hi ha altra cadena que s'anomena component secretor, molt important per a l'activitat de la Ig a les mucoses. Hi ha 2 subtipus:

• Ig A1 (es troba al sèrum en forma monomèrica).

• A2 (es troba a mucoses i secrecions en forma dimèrica).

• Tipus  ! Ig M: Presenta en l'extrem C-terminal una cadena J, responsable de la polimerització de la Ig en forma de pentàmer.

• Tipus  ! Ig D: Molt poc habitual en sèrum, es troba en forma estable a la superfície de les cèl·lules B, actuant com a receptor. És monomèrica.

• Tipus  ! Ig E: Monomèrica, molt poc habitual en sèrum, encara que té importants funcions en al·lèrgies o defensa front helmints.

Totes les Ig es produeixen al S.R.E., però l'ensanblatge es fa a l'aparell de golgi. Després d'açò seran secretades o be retingudes a la coberta dels linfocits B.

Funcions de les Ig:

• Receptors de coberta per a Ag: en els linfòcits B. Els B immadurs expressen Ig M, i els madurs, a més, Ig D, i els efectors de memòria , o de qualsevols altre tipus.

• Neutralització o destrucció de Ag.una volta pren contacte l'Ig amb l'Ag , pot produïrse:

• Precipitació: si el complexe Ig-Ag és soluble.

• Aglutinació: si es insoluble.

Aquest procés es pot dur a terme per diferents mecanismes:

• l'activació del complement:

• Una Ig s'uneix al Ag, i una proteïna del complement (C1) s'uneix a la Ig i posa en marxa el complement, donant lloc al CAM.

• Determinades Ig com la Ig M, la Ig G1, i la Ig G3 activen el complement per la via clàssica.

• Opsonització, facilita la fagocitosi. Pot ser directa o indirecta:




• DIRECTA: mijançant IgG1 i IgG3. els neutrofils i basòfils tenen receptors per a cadenes  (Fc III R, Fc I R). L'Ig s'uneix a l'Ag per la part variable, i a questos receptors per la part cte. Aquesta unió fa que s'afavorisca la fagocitosi i activa al macròfag. El fagocit s'activa per ingerir la partícula, i a més es produeix la explosió respiratòria i augmenta la formació de productes tòxics per a l'organisme ingerit.

• INDIRECTA:,. Aquest el produeixen la IgM, Ig G1 i la Ig G3. La IgM no és opsonitzant per si mateixa, però pot afavorir específicament la fagocitosi, perquè activa el complement, i els productes de la reacció (C3b) poden produir opsonització.

• Citotoxicitat, mitjada per cèl·lules dependents d'anticossos.

• Afavoreixen la lisis extracel·lular de microorganismes i cèl·lules. Les Ig G, A i M s'uneixen a la cèl·lula diana per la Fab, i per la Fc s'uneixen a receptors per a eixes fraccions, eixa unió té com a conseqüència la desgranulació de les cèl·lules, que poden ser NK, eosinòfils, basòfils, mastocits, neutròfils, e inclòs macròfags. En contacte amb el complexe Ag-Ig aquestes cèl·lules es desgranul·len i aboquen el seu contingut de productes citotòxics a l'exterior

Els receptors per a Fc són de baixa afinitat, si la Ig no està unida a un Ag, no s'unirà i no produirà desgranul·lació.

• HIPERSENSIBILITAT INMEDIATA:els receptors dels mastòcits si son d'alta afinitat, i circulen pel torrent amb IgE unides; quan contacten amb un Ag es desgranul·len ràpidament.

• Immunitat de mucoses: Normalment els Ag no entren a la circulació, i és molt important que hi hagen Ig en aquestes àrees, la més important és la IgA, i va a ser la més abundant en les mucoses, no sols actuarà allí, sinò que també accedirà a la llum del tracte gastrointestinal.

• Immunitat neonatal: participen:

• IgG !prenatal. Els nadons no tenen desenvolupat el sistema immunitari, però les mares passen aquestes Ig als fills a través de mucoses i secrecions, ajudant-los a regular la flor abacteriana. Poden travessar la barrera transplacentaria perquè no són massa grans, i a més existeixen receptors neonatals que faciliten el trànsit de l'intestí cap al sistema circulatori, de forma que al moment de nàixer, el nadó té una dotació de Ig G.

• IgA ! neonatal: Si un neonat presenta Ig M a la sang, és perquè ha sofert una infecció. Després del naixement, la mare encara pot transmetre Ig al fill, per la llet, que passa IgA, que serà molt important per a la regulació de la flora intestinal.

-->

Una de les caract[Author:A.T.B.]erístiques de la resposta immune és que és autolimitada, això es coneix com a inhibició per retroalimentació.

Determinats linfòcits tenen un receptor per a Ig, i en eixe cas, la funció de la Ig és inhibir la resposta d'eixos linfòcits.

Unió Ag-Ac

El fonament de l'acció dels Ac és l'unió als Ag. D'eixa unió pot dependre l'eficiència dels Ac. És una unió complexa, que a més és reversible (s'estableix per mitjà de forçes molt diferents,hidrofòbiques, VandeerWals, ponts de H)Es pot representar com un equilibri químic, semblant a l'afinitat d'un enzim pel seu sustrat:

K1

Ag + Ac AgAc

K2

K1: Constant d'associació proporcional a la quantitat i estabilitat d'unions que s'estableixen entre Ag i Ac.

K2: constant de dissociació. Inversament proporcional a K1.

Del valor d'eixes constants depèn l'eficiència dels Ac front a un determinat Ag. El valor d'eixes constants està determinat per tota una sèrie de paràmetres que caracteritzen eixa unió, aquestos són:

• L'especificitat: Els Ac són molt específics, i sols són capaços de unir-se als Ag que els han generat, però en ocasions es poden unir a alguns molt semblants: és la reacció creuada.

Quan el mateix Ac serveix per 2 Ag, es pot parlar de:

• Immunitat homòloga: Induïda pels Ac que es formen front a una Ag determinat.

• Immunitat heterologa: Induïda per un Ac produït per un Ag diferent al que està neutralitzant.




• Afinitat: Força d'unió entre un únic punt de un Ag i un Ac; és proporcional a la K1, i depén també de la complementarietat entre un Ag i un Ac. Quan un Ag genera l'Ac, l'afinitat és molt gran; però si un Ag s'uneix a un Ac que no ha provocat, l'afinitat és menor.




L'afinitat no defineix completament la força d'unió de un Ag a un Ac, sinò que considera un únic lloc d'unió.

• La valència de un Ac serà molt important per definir l'estabilitat d'unió AgAc. És el nombre d'epítops als que pot unir-se un Ac.En unions multivalents es molt important la regió bisagra. Un Ac pot tenir diferents punts d'unió, i la suma d'ells és el que s'anomena valència. LA zona d'equivalència és el punt en que les concentracions de Ag i Ac són les adequades per a formar una complex que precipita el Ag, (precipitació o aglutinació).

• Avidessa, és la força total d'una unió Ag-Ac, considerant tots els punts d'unió simultàneament. LA força d'unió augmenta geomètricament amb la València, no es la suma de totes les interaccions per separat.

Anticossos anti Ig

Una Ig és una proteïna, per tant, és immunogènica, i pot provocar reaccions immunitàries. Si purifiquen Ig de humà i les inoculem a un conill, aquest les reconeixerà com a antigens, i formarà Ac anti Ig humanes.

Actualment són molt importants, perquè s'empren en investigació, terapèutica i diagnòstic. Ex: ELISA, WESTERN BLOTT...

Les AntiIG es poden produir front diferents epítops de una Ig. S'anomena:

• Halotop: cadascún dels epítops de l'halotipus situats a la regió constant o variable de la Ig.

• Idiotops: epítops de la ragió hipervariable que també generen resposta inmune.

• Halotipus conjunt d'halotops. Serveixen per determinar quin tipus de Ig es tracta.

• Idiotipus, conjunt d'idiotops. Utilitzat per a malalties autoimmunes, bloquejant receptors de Ac.

Anticós monoclonal i policlonal:

Quan un Ag accedeix a un organisme, es generen una sèrie de Ac, en realitat els Ac són una barreja d'Ac front a diferents epítops d'eixa mateixa molècula, cadascun d'ells té especificitat diferent i procedeix d'una línia cel·lular B diferent, açò és, anticossos policlonals.

Un Ac monoclonal és aquell específic front a un únic epítop, o que està produït per un únic clon de cèl·lules B.

Avui en dia s'empren molt els Ac monoclonals, es podrien obtenir agafant sang de un individu immunitzat, i anem diluint fins trobar una sola cèl·lula B per dilució, però com els linfòcits B no creixen en cultiu, s'han desenvolupat mètodes per obtenir Ac monoclonals:

• El més usat és el descobert per Colon i Milltein als anys 70. Fusionen les cèl·lules B amb altres cèl·lules que si que creixen en cultiu (normalment cèl·lules de mieloma, que són tumorals i creixen indefinidament), però per si mateixa no poden produir Ac, i a més tenen un defecte en la via de recaptació de la purina, ja que els falta l'enzim HRPT. S'anomenen hibridomes.

• Immunització de l'animal de laboratori amb un Ag, així, l'animal produirà el Ac que volem.

• Extraurem la melsa de l'animal i li extraiem les cèl·lules B.

• Per facilitar la fusió per formar hibridomes es barreja amb polietilenglicol. Usarem el medi de cultiu HAT (L'aminopterina segresta la purina, i les cèl·lules que no poden sintetitzar purina moren), així moren les cèl·lules B sobrants i sobreviuen els hibridomes.

• Tenim la dissolució amb els hibridomes, i d'aquest farem les dilucions necessàries fins obtenir una única cèl·lula en suspensió, aquesta proliferarà, i produirà els mateix Ac. D'ací s'agafa el sobrenadant, que és on estan els Ac.

APLICACIONS:

• L-->a identificació de marcadors fenotípics de diferents [Author:A.T.B.]tipus cel·lulars.

• També s'usen per al diagnòstic; la prova és més específica, però es perd sensibilitat.

• Per al tractament de tumors, que s'usen Ac dirigits a cèl·lules tumorals

• Actuen com a tractament de tumors actuant al punt vital de la reproducció de la cèl·lula, és la immunoterapia.

• Anàlisi funcional (-receptors i -citoquines) de les proteines de superfície de les cèl·lules, i de proteïnes secretades per diferents cèl·lules.

• Anàlisi de localitzazió de proteïnes secretades.

TEMA 7. COMPLEX PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILITAT

El MHC és un conjunt de gens molt polimòrfics, amb molta variabilitat, situats en una regió molt menuda del genoma, que als humans es troba al cromosoma VI. El producte d'eixos gens són les molècules del complex principal de histocompatibilitat (mMHC), aquestes són molt importants:

• Processos de presentació de Ag proteics als linfòcits T.

• S'uneixen al PCR.

Eixes molècules són necessàries per a generar la resposta immune front a proteïnes. Al MHC es poden diferenciar 2 zones:

• Gens classe I: Codifica per les mMHC de classe I que s'expressen en totes les cèl·lules nucleades de l'organisme. Estan implicades en el reconeixement antigènic per part dels linfòcits Tc (CD8+) . Presenten una mostra de les proteïnes que se formen a l'interior cel·lular.

• Gens classe II: Codifica per les mMHC de classe II. S'expressen únicament en les cèl·lules presentadores de Ag professionals (macròfags, cèl·lules dendrítiques i linfòcits B, i altres que en condicions especials poden expressar-les). Estan implicades en el reconeixement dels Ag per part dels linfòcits Th (CD4+). Presenten proteïnes extracel·lulars i provoquen resposta humoral.

El reconeixement antigènic no és la única funció d'eixes molècules, però si la més important. Es descobriren pels problemes que donaren certs trasplants i transfusions, degut s les reaccions antigèniques que presentaven certs linfòcits, i s'anomenaren haloAg o HLA( Human Leucocyte Antigen), perquè en aquell moment es creia que eixe Ag era el responsable del rebuig a les transfusions i trasplants, i de fet és així.

Les HLA tenen la funció de que un organisme reconega una cèl·lula com a seua, o com a antigència..

GENERALITATS ESTRUCTURALS

Tant les molècules de classe I com les de classe II estan formades per cadenes polipeptídiques  i , es pot distingir, de fora cap endins:

• Un domini de unió al pèptid que és variable (40 a.a.) o l'Ag que estiga presentat.

• Un domini tipus Ig constant, que té com a principal funció unir-se als correceptors CD4 o CD8.

• Després ve un domini transmembrana (25 a.a.) pel qual està unit a la membrana de la cèl·lula.

• Un domini intracitoplasmàtic, (30 a.a. en MHC-I i variable en MHC-II) les funcions del qual són la fixació a la cèl·lula presentadora, i la unió al correceptor.

Al mateix temps, aquesta estructura presenta dues regions definides:

• Regió polimòrfica: extracelular. Amb composició d'a.a. variable. S'encarrega de presentar l'Ag.

• Regió monomòrfica: a la qual s'uneix l'Ag.

En mMHC-I la -monomòrfica vé d'un gen diferent: -2microglobulina.

Una mateixa cèl·lula pot presentar diferents isotipus d'eixes molècules, que es diferencien segons els al·lels:

• CLASSE I:

• HLA-A

• HLA-B

• HLA-C

• CLASSE II:

• HLA-DR

• HLA-DQ

• ¿falta un?

No hi ha cap mMHC que no estiga unida a pèptid. La seua funció es eixa. Si no hi ha cap Ag captat, els macròfags expressaran molècules pròpies, que no seran reconegudes per cap Linfocit T.

La presentació al timus es fà en linfocits T inmadurs, per fer la selecció + i -.

FUNCIÓ:

• Són necessàries per a la generació d'una resposta immune front a proteïnes, perquè eixes molècules presenten els Ag per a que puguin se reconeguts pels linfòcits T, ja que aquestos sols reconeixen pèptids i seqüències linials de pèptids, que no es troben en forma lliure.

• Si l'Ag son sols cadenes peptidiques, la respoosta serà fonamentalment celular ( linfòcits T).

• Si a més hi ha polisacàrids, la resposta pot ser humoral. (linfòcits B).

• Els linfòcits Th CD8 reconeixen pèptids units a molècules de classe II, i la font d'eixos Ag per a eixes molècules són proteïnes extracel·lulars.

• Els linfocits Tc, reconeixen pèptids de mMHC-II (oritge intracelular).

• Les vies de reconeixement són diferents, encara que hi ha característiques comunes, ja que els pèptids que es generen provenen de proteïnes lisades en l'interior de la cèl·lula.

• La unió entre pèptid i molècula del MHC és prèvia a la presentació de la molècula a la superficie cel·lular.

• En les dues vies serveixen organuls que no són exclusius al sistema immune.

• Aquestes vies no diferencien entre proteïnes pròpies i estranyes, sinó que presenten una mostra de totes les proteïnes que troben.

• El reconeixement no es fa en la via, sinó que ho fa el limfocit T. Si són pròpies les reconeix, si no ho són , no les reconeix i activa la resposta.

Processament: Presentació d'Ag per les molècules del MHC classe 1

Les mMHC de classe i les presenten qualsevol tipus cel·lular, i presenten Ag intracel·lulars; per això és important que totes les cèl·lules siguen capaces de presentar eixos Ag (així, altres mecanismes cel·lulars destruiran la cèl·lula o inhibiran la reproducció).

No sols es presenten pèptids estranys, sinó una barreja, i si entre tots ells hi ha algun estrany, el Limfocit T el reconeixerà.

A les mMHC de classe es presenten proteïnes de qualsevol virus, microorganisme, paràsit, etc… a més d'una sèrie de Ag conseqüència de l'expressió defectuosa dels gens de la mateixa cèl·lula. D'aquesta manera es poden controlar tumors i mutacions de cèl·lules normals.

Fases en la presentació

• Síntesi de polipèptids (Ag): de la pròpia cèl·lula o d'un patògen alié.

• Degradació proteolítica: Ocorren al proteosoma. Aquest és un complex multi-enzimàtic no exclusiu del sistema immune, encara que algunes unitats estan codificades per gens del MHC. A més l'expressió de les unitats del proteosoma estan induïdes per citoquines del tipus 1 com l'IFN-.

• Transport de pèptids al reticle endoplasmàtic: Es fa per dos transportadors associats a la paret del R.E.. Són el TAP-1 i el TAP-2. Ambdós són dependents de ATP.

• Acoblament pèptid-mMHC classe 1: En la formació d'aquest complex participa la calnexina (chaperona), que fixa la mMHC al R.E i bloqueja el punt d'unió fins que arriba el pèptid.

• Expressió del complex: Es transporta fins a l'aparell de Golgi on les vesicules es fusionen amb la membrana.

• Reconeixement: Pels Fc

Aquest procés te lloc a quasi totes les cèlules nucleades, per tant totes elles son succeptibles de convertir-se en diana de la resposta inmune.

Presentació de molècules del MHC de classe II:

En casos especials ho poden fer cèl·lules endotelials per mitjà de citoquines. Aquest receptor sols l'expressen cèl·lules que actuen com a presentadores de Ag: Linfòcits B, macròfags i cèl·lules dendrítiques. La diana no és la pròpia cèl·lula sinó Ag extracel·lulars.

El pèptid serà reconegut per linfocits Th (CD8).

Etapes del procés

• Endocitosi de polipèptids (Ag) per l'APC: Es forma un endosoma amb l'Ag. Pot ser de varies formes, quasi totes elles mediades per receptors de superficie: BCR.

• Processament de polipèptids en endosomes o lisosomes. Aquest pas es produeix a l'endosoma (amb àcid, catexina, NO, H2O2, que degraden els Ag).

• Unió de pèptids a mMHC de classe II. L'endosoma transporta els pèptids al R.E, i s'uneixen a les mMHC de classe II.

• Expressió del complex pèptid-mMHC a la superfície. El complex es transporta en vesicules de Golgi a la membrana cel·lular.

• Reconeixement. Reconegut el Ag pels Th.

La transformació de Th ! Th1 (productors de la resposta celular) serà provocada per les citoquines que produeix els Tc.

TEMA 8. CITOQUINES

La connexió entre cèl·lules i components del sistema immune es produeix per:

• Contacte directe: que afavoreix la interconexió.

• Proteïnes secretades per cèl·lules del sistema immune. Ex: Citoquines que són proteïnes secretades en les primeres fases d'una resposta immune, i així es transmeten senyals a distància.

Citoquines : Conjunt de proteïnes de baix pes molecular, i normalment glicosilades que sintetitzen les cèl·lules del sistema immune i algunes altres cèl·lules en resposta als patògens i als seus productes o altres senyals relacionades. Hi ha una terminologia molt variada:

• Segons la funció:

• Factor de necrosi tumoral (TNF)

• Interferó (IFN)

• Interleuquina (IL)

• Factors estimuladors de colònies (CSF)

• Factor estimulador del creixement (TGF)

• Segons l'origen:

• Limfoquines ! produïdes pels linfòcits

• Monoquines ! produïdes per macròfags

• Quimioquines ! Amb propietats quimiotàctiques.

Els principals productors de citoquines són els linfòcits T i els macròfags, malgrat que totes les cèl·lules del sistema immune tenen capacitat per a produir-ne algun tipus, altres cèl·lules que de normal no les produeixen també poden fer-ho en algunes ocasions. En funció de la cèl·lula sobre la que actua les podem diferenciar en:

• Autocrines: Acció produïda sobre la mateixa cèl·lula que ha produït la citoquina.

• Paracrines: Acció produïda sobre cèl·lules properes a la que ha produït la citoquina.

• Endocrina: L'acció es produeix sobre cèl·lules llunyanes a la que ha produït la citoquina. En aquest cas es produeix un efecte sistèmic, i les citoquines estan actuant com a hormones.

-->Estructura[Author:A.T.B.] :

La seua estructura és molt diferent depenent de la funció de la citoquina, però tenen algunes característiques peculiars comunes a totes:

• Baix pes molecular

• Són produïdes quan la cèl·lula productora s'activa.

• Tenen una vida molt curta.

• Sempre actuen per mitjà de receptors.

• Actuen sobre cèl·lules que tenen receptors per a eixa citoquina.

Hi ha diferents receptors (un per a cada tipus de citoquina) que transformen la senyal extracel·lular en una senyal intracel·lular, la qual per fosforilació-defosforilació activarà un enzim o un gen.

Funcions de les citoquines: Molt variables, i no es poden generalitzar, ja que cada citoquina té una funció determinada. Però hi ha característiques generals pel que fa referència a l'activitat de les citoquines. Actuen com mediadors de la informació. Quan una cèl·lula s'activa com a resposta d'un estimul inmunològic produeix citoquines que contacten amb el receptor present en eixa altra cèl·lula la qual s'activa i produeix una sèries de reaccions en cadena( mijançant quinases) que traslladen la senyal al nucli de la cèl·lula on s'activen els factors de transcripció (STAT).

L'activacío pot tenirdiferents conseqüencies en funció de la cèl·lula activada, però eixa activació te tota una sèrie de factors comuns:

• És un procés molt breu. Una citoquina es produeix en un moment donat, fa la seua funció i no es torna a produir fins altra resposta immunitaria.

• Una mateixa citoquina la poden produir diferents cèl·lules. Una citoquina pot actuar sobre diferents cèl·lules, i produir un efecte diferent sobra cadascuna d'aquestes cèl·lules. Aquesta capacitat d'acció es coneix com a pleiotropisme.

• El efecte de una citoquina pot ser el activar la producció de altra citoquina.




• Hi ha moltes citoquines l'efecte de les quals és l'activació de la divisió cel·lular afavorint la proliferació d'un tipus cel·lular.

La classificació de les citoquines és difícil de fer per diferents qüestions, però el més normal és fer una divisió en 3 grups:

• Citoquines que regulen la resposta innata o inespecífica.

• Citoquines que regulen la resposta específica.

• Citoquines que regulen la proliferació i divisió cel·lular.

La divisió entre resposta específica e inespecífica no és tan clara, i encara que algunes CK es produeixen per reconeixement inespecífic, poden servir per a diferents fins.

Altra classificació més natural és la divisió entre:

• Ck1: Aquelles que afavoreixen les respostes de tipus cel·lular com el IFN-, etc…

• Ck2: Afavoreixen les respostes de tipus humoral, com la IL 4 (que afavoreix la proliferació i diferenciació dels linfòcits B)

Aquesta classificació deixa fora moltes CK com els factors estimuladors de colònies, etc…, per això emprarem la primera classificació.

• CK que regulen la resposta innata: Les que s'inclouen a aquest grup són CK en les que el caràcter més comú és estar produïdes per un reconeixement inespecífic. Però també tenen funcions en la resposta específica. Aquesta resposta es pot produir :

• Pel reconeixement de LPS, manosa... a la membrana del microorganisme

• Per l'acció de altres citoquines.

• Activació inespecifica del complement.

• Cèl·lules NK que reconeixen especificament cèl·lules infectades i produeixen a conseqüencia interferó .

• En cèl·lules infectades per virus, degut a que hi ha cèl·lules capaces de detectar al nucli àcids nucleics aliens no associats a la divisió cel·lular o a sintesi de proteines.

El resultat net de la producció de les citoquines són les respostes inflamatories amb producció i activació de macròfags i cèl·lules NK. Les cèl·lules implicades son:

• IFN-1:  i . Produides pels mateixos macròfags. Funcions principals:

• Inhibeixen la proliferació cel·lular, ja que la seua actuació interfereix a la síntesi de aa a la cèl·lula. És important en virosis i en cèl·lules neoplàsiques.

• Activen les cèl·lules NK augmentant el seu potencial lític i la seua capacitat de produir citoquines com IFN-.

• Tenen capacitat de modular l'expressió de mMHC, augmentant les de classe I e inhibint les de classe II

• Facilita l'activació dels T citolítics, així s'afavoreixen els processos de lisis cel·lular i a més amplifica la resposta cel·lular.

• IL-12: Produïda per macròfags i cèl·lules dendrítiques, el paper d'aquesta citoquina és molt important a la resposta immune. Afavoreix el desplaçament de la resposta cap a mecanismes cel·lulars.

• Actua sobre els linfòcits T CD4 afavorint la diferenciació cap a TH1.

• Activa els linfòcits Tc i les cèl·lules NK, augmentant la capacitat citolítica.

• Producció de IFN-.

• TNF: El produeixen fagocits, cèl·lules NK i mastocits. Junt amb l'IFN-, és la CK més important en la resposta inflamatòria, i totes les seues funcions tenen com a conseqüència afavorir aquesta resposta.

• Afavoreix l'expressió de molècules d'adhesió en cèl·lules endotelials.

• Afavoreix la producció de quimioquines pels fagocits.

• Afavoreix la remodelació tisular (producció de granulomes per aïllar organismes grans, dona lloc a la fibrosi).

• Formació de pirògen endògen i vasodilatació (afavoreix la producció de PG).

• IL-1: La produeixen les mateixes cèl·lules que el TNF. És reguladora de la resposta inflamatòria. Normalment eixa CK es produeix a les primeres fases de la resposta.

• IL-6: Produïda per fagocits, linfòcits T, cèl·lules endotelials i altres que no tenen a veure amb la resposta inmunitària com els fibroblasts. El seu paper més important és actuar com a factor de creixement de les cèl·lules B. Afavoreix la seua diferenciació i també participa a la resposta inflamatòria.

• Quimioquines: Són un grup complex de citoquines que estimulen la quimiotaxis de les cèl·lules del sistema immune. Son importants a la resposta inflamatòria.

• IL-10: Produïda per macròfags i linfòcits T. Inhibeixen la producció de Ck per macròfags i cèl·lules T, produeix una polarització de la resposta cap al Th2 (humoral).

• CK que regulen la resposta específica: Cap CK actua en un sol tipus de resposta.

• IL-2: Produïda per Limf.T.

• Actua com a factor de creixement autocrí i paracrí de cel·lules T, afavorint la seua pròpia proliferació i diferenciació.

• Proliferació i activació de cèl·lules NK.

• Afavoreix de forma indirecta la producció especifica de determinats isotipus de Ac.

• IL-4: La produeixen els linfòcits Th, però pot ser produída per mastocits, basòfils i altres tipus cel·lulars no identificats encara.

• Actua com a factor de diferenciació de T CD4 a Th2.

• Afavoreix el canvi a isotipus Ig E en casos de respostes llargues.

• Pot estimular la formació de molècules d'adhesió en cèl·lules endotelials.

• IL-5 IL-10: La produeixen Th2 i mastocits. Les IL-5 afavoreixen l'evolució de les cèl·lules B; les IL-10 ihhibeixen la diferenciació cap a cèl·lules Th1.

• TGF-: Factor transformador del creixement . És produït per Th2 i macròfags quan ja s'ha destruït l'Ag. És un inhibidor dels linfòcits i de la resposta immune, essent necessari per a la regulació d'aquesta.

• IFN de tipus 2 o IFN-: NK, Tc, Th1, macròfags. És la CK1 més important, sobretot front a patògens intracelulars (hepatitis..) :

• Activa als fagocits (macròfags), augmentant la capacitat fagocítica i de producció de citoquines.

• Augmenta l'expressió de mMHC de classe I.

• Actua com a factor de diferenciació de T CD4 a Th1.

• Activa a altres cèl·lules implicades en la resposta cel·lular com les NK i els Tc.

• El resultat net és la producció de resposta inflamatòria amb infiltració de macròfags i predomini de resposta cel·lular.

• CK que regulen la divisió i la proliferació cel·lular:

Bàsicament els factors estimuladors de colònies (CSF), que es classifiquen en tres tipus:

• CSF

• GM-CSF

• G-CSF

• M-CSF

• IL-7: proliferació de cèlules linfoides.

La seua funció era afavorir la proliferació de tipus cel·lulars a la resposta immune.

• IL-3: És un exemple de factor estimulador de tot tipus de colònies.

TEMA 9. RECONEIXEMENT ANTIGÈNIC I ACTIVACIÓ DELS LINFÒCITS T

Quan un limfocit contacta amb un Ag es posen en marxa uns processos diferents per als B i per als T; així com les conseqüències d'aquestos. En els dos casos hi ha característiques comunes:

• El contacte amb l'Ag inicia un procés de proliferació cel·lular que dona lloc a una expansió clonal (cèl·lules amb contingut genètic idèntic complementaries amb l'Ag).

• Diferenciació cel·lular. Dona lloc a cèl·lules efectores que neutralitzaran l'Ag i les cèl·lules de memòria (romanen latents fins a un nou contacte amb l'Ag que les ha produït).

La resta de processos és diferent per a B i per a T.

Característiques generals de l'activació dels linfòcits T

Sols s'activen amb Ag units a mMHC. Quan contacten comencen la proliferació per via autocrina mitjançada per IL-2 (la cèl·lula genera IL-2 i presenta receptors per a aquesta a la coberta).

Aquesta CK participa a la diferenciació dels linfòcits T:

• Th: Formació de CK

• Tc: Lisis de cèl·lules infectades i formació de CK.

També es produeixen cèl·lules T de memòria (dels dos tipus) que no tenen caràcter efector (resposta secundaria).

Senyal d'activació per als T

La senyal que l'inicia és el contacte del receptor TCR amb un Ag unit a una mMHC. Aquesta unió del receptor amb una mMHC-Ag no és suficient, i necessita senyals addicionals, principalment:

• Unió TCR i mMHC-Ag

• Senyal coestimuladora: Correceptors del TCR. Aquesta senyal l'aporta la cèl·lula que presenta l'Ag i es imprescindible per a estimular el linfocit. Es pot produir per CK com IL-1, o per la unió d'una molècula present en quasi totes les cèl·lules que poden presentar Ag:

• B7: En quasi totes les cèl·lules presentadores de Ag.

• B28: en Linfòcits. No forma part del receptor per a l'Ag.

Quan es donen les dues senyals es posen en marxa reaccions bioquímiques en cascada que condueixen a l'activació de factors de transcripció, aquestos expressen gens que codifiquen per a proteïnes que acaben formant els receptors per a IL-2. Les reaccions bioquímiques són:

• -->Reaccions [Author:A.T.B.]de Fosforilació-defosforilació: Hi ha enzims que s'activen/desactiven per l'addició/eliminació d'un grup fosforil o fosfat (quinases=PTK/fosforilases). Moltes d'elles estan associades a receptors lligats al receptor TCR, i que li provoquen un canvi estructural que l'apropa a les kinases. Actuen sobre la ZAP-70 que està associada a les cadenes Z del TCR i el que fa la ZAP-70 es activar la fosfolipasa....

• Hidròlisi de fosfolípids de membrana: Activa les fosfolipases de la membrana dels linfòcits T. La fosfolipasa immunitza fosfolípids de la membrana dels linfòcits, i com a conseqüència de la lisi s'allibera trifosfat inositol que s'uneix als canals del Ca+2 de la coberta de totes les cèl·lules. La fosfolipasa hidrolitza part dels lípids de la membrana dels linfòcits T. La unió permet l'entrada de Ca+2 a l'interior de la cèl·lula augmentant la concentració de Ca intracel·lular.

• Augment de la concentració citoplasmàtica de Ca+2: El Ca és capaç d'activar kinases, amplificant la senyal. Degut a l'acció del Ca s'activa la calcimurina, un enzim que activa una sèrie de factors de transcripció (NFAT)per a la síntesis de IL-2, responsable de la diferenciació en cèl·lules efectores o de memòria

Via de diferenciació dels linfòcits Th

Són cèl·lules efectores amb la funció de la regulació de la resposta immune per mitjà de la producció de CK. Hi ha dues subpoblacions que es diferencien exclusivament per les CK que produeixen:

• Th1: citoquines tipus1! IFN-, TNF, IL-2 (afavoreixen la resposta cel·lular)

• Th2: citoquines tipus2! IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 (afavoreixen la resposta humoral).

Via de diferenciació de les Th1

És una resposta antigènica intracel·lular o activadora de macròfags. La unió amb el receptor allibera IL-12. Aquesta actua sobre les T CD4 afavorint l'evolució cap a Th1, pot activar les cèl·lules NK i Tc, i les TCD8 produint totes elles IFN- que reestimularan als macròfags (retroalimentació positiva).

Aquest mecanisme es efectiu per la cèl·lula front Ag extracelulars. En Ag intracelulars, l'Ag serà resentat per mMhC1 i el procés es completarà igualment.

Via de diferenciació de les Th2

La diferenciació a Th2 és una resposta front a Ag extracel·lulars que estimulen molt poc als macròfags. El responsable d'aquesta diferenciació és la IL-4, produïda per les Th2.

No es coneix be quí produeix la IL-4, però es sap que hi ha mastocits que poden produir-la. Però també pot ser que la IL-4 estiga produïda per un tipus de cèl·lula limfoide. Aquesta té marcadors típics de cèl·lules NK, i aquesta podria ser la font.

Un dels aspectes més importants de l'evolució de la resposta immune és que, degut a que la quantitat de Th0és limitada, l'evolució de Th1 i Th2 és polar (L'evolució cap a Th1 inhibeix la de Th2 i viceversa), així es pot determinar la eficiència de la resposta immune, ja que és important conèixer els valors que determinen que la resposta evolucione cap a Th1 o Th2. Els factors que determinen l'evolució cap a un o altre tipus són essencialment:

• Dosi/Ag.

• Via d'entrada del Ag.

• Cèl·lula que presenta el Ag.

• Perfil de citoquines presents a l'organisme al moment de l'activació.

• Factors genètics.

Quan hi ha predomini de IFN- o IL-12, evoluciona cap a Th1.

Si predomina la IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, IL-13 cap a Th2. (IL4 i IL10 inhibeixen la formació de CK tipus1 per macròfags.

Les dues respostes són antagòniques, i les citoquines que afavoreixen el desplaçament cap a un dels tipus inhibeix el desplaçament cap a l'altre.

Funcions efectores de Th1 i Th2

Les dues tenen la funció fonamental de regular la resposta immune, i ho fan per mitjà de la producció de citoquines.-

• Th1: Afavoreix la resposta cel·lular. Aquestes produiran CK com el

• IFN-: Activa els macròfags augmentant la seua capacitat fagocítica, augmenta la explosió respiratòria. També pot activar les cèl·lules B, i es poden promoure l'activació d'alguns tipus de Ac com la IgG. S'incrementa la expressió de receptors per a fraccions constants per a Ig opsonitzants.

• IL-12: Participa a la maduració dels linfòcits Tc.

• TNF: Activa fagocits i la resposta inflamatòria, també la amplifica.

El resultat net és un augment de les respostes cel·lulars, com la lisis cel·lular per linfòcits Tc i resposta inflamatòria.

• Th2: Produeixen:

• IL-4: Que inhibeix la diferenciació a Th1, augmenta la resposta Th2, inhibeix els macròfags, i a més de atraure quimiotàcticament a linfòcits i basòfils, estimula als eosinòfils i la producció de IgE.

• IL-5: Estimula als eosinòfils.

• IL-6 i IL-10: Estimulen el creixement de cèl·lules B, afavorint la producció de Ig.

• IL-13: Té nu paper molt semblant a la IL-4.

El resultat net és un cúmul de cèl·lules immunoactives i productores de Ac sobre l'Ag. D'aquesta forma es destrueixen Ag extracel·lulars massa grans com per a ser destruïts per fagocitosi.

Diferenciació dels Linfòcits T citolítics

Els Tc procedeixen dels linfòcits T CD8. Aquestos s'activen pel contacte amb Ag presentats per una mMHC de classe I, a més, estan activades per la producció de IL-12 pels macròfags.

Moltes vegades aquesta senyal d'activació no és prou potent i necessita l'ajuda dels Th1, degut a la capacitat d'aquestes de produir:

• IFN-, que activen els macròfags

• unir-se a la mateixa cèl·lula presentadora de Ag, fent !la senyal.

• IL-12 i que activa de forma paracrina Tc afavorint la seua diferenciació.

La cèl·lula està doblement estimulada, però això sols ocorre a les cèl·lules presentadores de Ag (classe2).

La seqüència de reaccions que tenen lloc per activar el Tc són les que activen els linfòcits, provocant:

• S'expressen gens que conduiran a la formació de grànuls citoplasmàtics que contindran enzims com perforina, granzima, etc, que són lítics i lisaran les cèl·lules diana dels Tc.

• També produiran IFN- o TNF, que amplificaran la senyal.

A més dels Th1 i Tc, una part dels linfòcits T activats es transformaran en linfòcits T de memòria; aquestos són acapaços de viure fins a 20 anys, i seran responsables de les respostes secundaries. El que no es coneix molt be són els mecanismes de supervivència ni el percentatge de cèl·lules que guarden la memòria. Fenotipicament so molt semblants a les celules efectores.

Al cas dels T, es sap que les cèl·lules de memòria expressen a la superfície marcadors com CD44, o integrines, que afavoreixen la migració a la perifèria, perquè així és més fàcil contactar amb el Ag.

TEMA 11. RECONEIXEMENT ANTIGÈNIC I ACTIVACIÓ DELS LINFÒCITS B

Són els responsables de la resposta humoral, de la producció de Ac, la missió fonamental dels quals és la neutralització dels Ag. El linfòcits B madurs reaccionen front Ag sense processar, i que no són presentats associats a mMHC.

Després es posen en marxa reaccions que donen lloc a la proliferació, i diferenciació d'eixos linfòcits.

Els linfòcits B:

• La majoria es diferencien a limfoblasts.

• Altres a cèl·lules plasmàtiques, responsables de la producció dels Ac.

El Ac són diferents per a cada Ag, perquè cada resposta humoral és diferent de l'altra, però hi ha una sèrie de característiques generals:

• Els Ag proteics no produiran resposta d'Ac en absència de linfòcits T, per això es parla de ls proteïnes G d'Ag T dependents. Poden donar respostes diferents amb diferents isotipus de Ac. Es generen cèl·lules de memòria.

Lip-Sac Ac IgM

B

Prot Ac " Ig

• Els Ag no proteics són capaços de produir resposta humoral de Ac sense la participació dels linfòcits T. Aquesta és fonamentalment de IgM, aquesta és la causa principal de que les fases inicials de qualsevol malaltia infecciosa estiguen caracteritzades per una alta producció de IgM. NO es generen cèl·lules de memòria.

• Les respostes primàries front a un Ag són quali i quantitativament diferents a les respostes secundaries, ja que aquestes són responsabilitat dels linfòcits B de memòria, i són molt més ràpides e intenses que les primàries.

-->Activació dels linfòcits B[Author:A.T.B.]

Es produeix al contactar amb Ag natius, part es diferencien a limfoblasts (precursors de cèlules plasmàtiques efectores), i altres a linfòcits B de memòria. La primera senyal per a que es produeixi l'evolució l'aporten els Ag que contacten amb els receptors dels Limf B. Això posa en marxa dos mecanismes:

- Reaccions intracitoplasmàtiques mitjades per quinases i fosforilases. La conseqüència final de totes les reaccions és l'activació de factors de transcripció per mecanismes semblants als dels linfT.

- A més, els linfòcits B internalitzen el complex Ag-receptor, el processen, i el presenten a la coberta amb una mMHC II, així actuen com a cèl·lules presentadores de Ag, que és important per a la producció de Ac en alguns casos.

El procés d'activació dels linfòcits T condueix a la selecció clonal. De tot el pool de especificitats es selecciona la correcta per a eixe epítop, i és la que prolifera i es diferencia. Totes les cèl·lules filles són clons de la inicial, i una petita part pasarà a cèl·lules de memòria. Les conseqüències seran diferents en funció del tipus de Ag, així es parla de:

• Ag timoindependents: Són aquells capaços de activar linfòcits B fins a produir Ac sense la participació dels linfòcits T. Bàsicament són lípids, polisacàrids i proteïnes amb epítops molt repetitius. És molt important en Ag tegumentals, o en la coberta dels Ag. El primer efecte que s'observarà es la producció d'IgM (caracteristica de qualsevol infecció). Es poden dividir en dos categories:

• Tipus 1: Es grans concentracions tenen la capacitat de induir la producció de Ac per activació de linfòcits inespecificament. Indueixen la producció policlonal dels linfocits independents de BCR. També es coneixen com a mitògens, un dels més coneguts és el LPS (lipopolisacàrid). Actualment s'empra a nivell experimental.

• Tipus 2: Més important a nivell clínic, són aquells Ag que sense la participació de linfòcits T, són capaços d'activar específicament els linfòcits B. Bàsicament són proteïnes amb epítops molt repetitius, i s'uneixen a diferents receptors de cèl·lules B, aportant la senyal suficient per activar-la.

• Ag timodependents: La major part dels Ag, i són aquells que encara que siguen reconeguts pels linfòcits B no són capaços de activar-los fins la producció de Ac sense la participació del linfòcits T, i més concretament de Th2. Es tracta de proteïnes sense epítops repetitius. La unió del Ag al receptor de la cèl·lula B aporta la primera senyal d'activació, però es necessita una coestimulació provocada pels Th2.




• Contacte del linB amb un Ag: l'Ag serà internalitzat per la cèl·lula, on s'unirà a mMHC-2 i serà presentat en superficie.

• Eixa unió de la mMHC2-Ag amb el receptor de la cèl·lula T per IL-4 i junt a la unió del CD 40 (aquest últim dona la 2ª senyal, la de coestimulació i obliga a que sols s'uneixin a TH2) amb el seu receptor en la mateixa cèl·lula T produeix l'activació del limfocit T. Si no hi haguera limfocit T, no hi hauria activació, és un procés de selecció negativa.

• activació del linfocit Th2: l'activació del linfocit Th2 provoca la producció de CK com la IL-4 que activen els linfB. Aquest procés es veu potenciat si els linfB han estat prèviament per altra cèl·lula presentadora d'Ag (la resposta secundària sempre es molt més àmplia).per incrementar les probabilitats de que el linfT trobe el linf B que ha d'activar, els macròfags expressen en sperficie Ag per estimular linT.

Cal dir que els linB no sofreixen cap procés e selecció negativa, ja que com els linT ja han estat seleccionats, no és possible que hi haja coestimulació front Ag propis.

Com a conseqüència de la col·laboració es produeix una resposta humoral en que es produeixen Ac. L'afinitat dels Ac no és constant, sinò que creix al llarg del temps per un procés de maduració.

Per recombinació somàtica es produeixen linfòcits amb especificitat semblant, encara que després tindrà lloc el procés de maduració de l'afinitat: aquest és un procésde selecció de totes les cèl·lules plàsmiques produides, aquelles capaces de generar Ac d'alta afinitat. Aquest grup torna als òrgans limfàtics secundaris, donant lloc als centroblasts (de ràpida divisió cel·lular). D'aquestos són seleccionats aquells que presenten una major especificitat per l'Ag que l'ha activat, a partir d'aquest moment s'anomenen centròcits. Aquestos van a la perifèria i es transformen en cèl·lules plasmàtiques.

Al llarg de la resposta humoral no sols canvia l'afinitat dels Ac per l'Ag, sinó que també ho fa el tipus de Ig que es genera. Inicialment sols es produeixen IgM, però despres produiràn altres isotipus depenent del perfil de CK present. Amb la mateixa especificitat es poden fer diferents combinacions amb diferents fraccions constants. El canvi d'un isotipus a altre sols implica modificacions de la fracció cristalitzable:

• IgM: IL-4, 5 o 2

• IgG: IL-4, 5 o 2 + IL-6 o IFN 

• IgA: IL-5 + TGF 

• IgE: IL-4

Que es produeixca un isotipus o altre depèn de:

• Tipus de microorganisme

• Dosi de l'Ag

• Factors genètics depenents de l'hoste. Ex: Al·lèrgies, amb superproducció de IgE

• Via d'entrada del Ag.

Timoindependents: No hi ha participació dels T, no hi ha citoquines, no hi ha canvis en la producció del isotipus d'Ig (serà IgM). Açò justifica que una malaltia infecciosa està caracteritzada per una elevada IgM,i més tard elevada IgG.

La quantitat de Ac produït al llarg del temps no és constant.

Resposta primària:

• Període latent: No hi ha producció de Ac, es correspon de l'activació dels linfòcits B, fins que el limfocit es transforma en cèl·lula plasmàtica funcional.

• Període de creixement logaritmic: La concentració de Ac creix molt ràpidament.

• Fase de meseta: La producció de Ac s'estabilitza.

• Fase de declinació: La concentració de Ac disminueix molt a conseqüència de l'eliminació del Ag. Generalment sol quedar una tasa residual d'Ac, o pot ser eliminada totalment segons les circumstàncies.

Linfòcits B de memòria

No es poden diferenciar fenotípicament dels B efectors, o en tot cas, sols una, i és en el cas dels B no activats s'expressa en la superfície IgM, i en els de memòria qualsevol isotipus de Ig.

Poden viure fins a 20 anys, no es coneixen els factors que determinen eixa longevitat ni els que determinen quines cèl·lules B es diferencien a efectores o a de memòria. Els B de memòria són els responsables de la resposta secundaria.

La resposta secundaria és més ràpida, perquè el clon ja està activat; i és més enèrgica, perquè hi ha moltes més cèl·lules de memòria i això fa que siga més específica. A més ell periode de latencia es ++ curt i la meseta i declinació permaneixen durant més temps

Una cèl·lula plasmàtica viu uns 2 mesos.

-->PROCESSOS DE CITOTOXICITAT[Author:A.T.B.]

El sistema immune destrueix tant cèl·lules pròpies com externes a l'organisme. Són molt importants en el control de microorganismes intracel·lulars, i també en el control de cèl·lules defectuoses o que expressen Ag estranys. També és important en el control de cèl·lules alienes introduïdes a l'organisme. Hi ha 3 etapes:

• Unió a la cèl·lula diana

• Reordenament dels grànuls citoplasmàtics i alliberament del contingut d'aquests.

• Mort de la cèl·lula diana per lisis o apoptosi.

Les principals responsables de la citotoxicitat són els Tc, les cèl·lules NK i altres cèl·lules que poden donar lloc a citotoxicitat amb el Ac (mitjada per cèl·lules depenents de Ac).

Linfòcits T citotòxics:

Són una població de linfòcits T que:

• Tenen capacitat per a lisar tipus cel·lulars en condicions determinades.

• L'activitat d'eixos Tc es produeix com a conseqüència del reconeixement de Ag presentats en superfícies cel·lulars associades a una mMHC de classe I.

• L'activitat d'aquestos també s'afavoreix per l'acció de la IL-12 produïda per macròfags.

• S'aconsegueix que els mecanismes de citòlisi puguen estar dirigits front a qualsevol tipus cel·lular.

• La cèl·lula que expressa Ag estranys es transforma en el blanc dels Tc, i pot ser lisada de dos maneres:

• Per grànuls citoplasmàtics: Quan un limfocit Tc s'activa, la conseqüència és l'activació d'una sèrie de gens, que produeixen uns grànuls citoplasmàtics que contenen substàncies actives com:

• Perforina: Té capacitat de foradar membranes cel·lulars.

• Granzima

Els grànuls es reordenen, s'acumulen a la zona de contacte entre les dues cèl·lules. Aquestos es fusionen amb la membrana de la cèl·lula T i alliberen les enzimes cap a la cèl·lula diana. La perforina provoca porus de 10-20 nm a la cèl·lula diana, però aquestos encara que no són prou grans per a matar a la cèl·lula, si que permeten que entre la granzima, produint-li la apoptosi.

• Per la via del ligando “Fas”: És un mecanisme de control de cèl·lules T defectuoses, i té lloc quan un limfocit Tc s'activa, a més de formar grànuls, s'expressa a la superfície la molècula Ligando Fas, que es pot unir a una altra molècula amb moltes cobertes cel·lulars anomenada Fas.

La unió d'eixe ligando a la cèl·lula Fas activa la via de l'apoptosi.

Els Tc són molt importants al cas de tumors, als trasplants i als processos de infecció intracel·lular de cèl·lules no fagocítiques, o en aquelles infeccions intracel·lulars de cèl·lules fagocítiques no controlades. Hi ha infeccions que sense IFN-, els macròfags no poden actuar front al patògen.

Cèl·lules NK

Aquestes cèl·lules són linfòcits que constitueixen el 15 % de les cèl·lules limfoides en sang. Són indiferenciables morfològicament dels altres linfòcits, encara que les seues característiques funcionals són molt diferents, ja que no tenen capacitat per a reconèixer específicament, sols de forma inespecífica.

Les seues funcions eren la producció de CK (IFN-) i lisar determinades cèl·lules. El mecanisme pel qual actuen és per grànuls citoplasmàtics que contenen perforina i granzima.

És diferent el mecanisme pel qual reconeixen l'Ag i s'activen. Es sap que les cèl·lules NK presenten 2 tipus de receptors:

• Desencadena l'activitat citolítica, Rastreja la coberta de les cèl·lules buscant determinats polisacàrids. És igual a altres cèl·lules, i si els troba envia senyals que activen la via de la citòlisi. Reconeixement inespecífic.

• Reconeix mMHC I, e inhibeix l'activitat citolítica de les cèl·lules NK. Aquest receptor s'anomena KIR. Rastreja la coberta buscant mMHC, i si la troba envia una senyal de inhibició de la citòlisi.

• Les cèl·lules NK destrueixen cèl·lules que presenten certs Ag a la coberta i no presenten mMHC.

• Són importants en la defensa front a infeccions virals, perquè molts virus poden inhibir l'expressió de mMHC I com a mecanisme d'evasió de la resposta immune.

• En la defensa front a cèl·lules tumorals, ja que moltes inhibeixen selectivament la expressió de mMHC I. Això fa que puguen ser destruïdes.

• Constitueixen el punt d'unió entre les respostes específiques e inespecífiques, ja que participen als primers passos de la resposta immune.

Citotoxicitat mitjada per cèl·lules dependents de Ac

Participen cèl·lules que per elles mateixa no tenen capacitat per a lisar altres cèl·lules, però que si que ho poden fer en col·laboració amb Ac.

Ocorre que s'uneixen diferents tipus cel·lulars, i la unió provoca la desgranulació d'eixes cèl·lules. Les cèl·lules que poden participar ho fan en funció dels isotipus de Ig que hi hagen:

• IgG: NK, Neutròfils, Monocits i macròfags.

• IgE: Eosinòfils, que contenen proteïnes com la proteïna principal bàsica, molt important en la destrucció d'helmints, ja que aquestos són resistents als productes de les altres cèl·lules.

Tenen receptors de baixa afinitat, i sols s'uneixen a Ig unides a Ag, per això no es produeix la desgranulació si contacten sols amb Ig lliures. Aquest tipus de reacció és fonamental per a la defensa front a Ag de gran tamany i per a la destrucció de cèl·lules infectades.

TEMA 13. SISTEMA DEL COMPLEMENT

El sistema del complement és un conjunt de més de 20 proteïnes sèriques i de la superfície que interaccionen entre si, i amb altres components del sistema immune de forma controlada amb la finalitat de dotar de determinades funcions efectores a la resposta tant humoral com cel·lular.

L'activació d'eixes proteïnes posa en marxa una sèrie de reaccions en cascada, en que el producte de una és el reactiu de la següent, i tant els productes finals de la sèrie de reaccions com els intermediaris poden actuar directament i eliminar l'Ag o bé indirectament afavorint processos com la inflamació.

• El complement pot provocar lisis cel·lular. El producte final del complement és el CAM, aquest està fixat a la membrana, bé de cèl·lules estranyes de un microorganisme, o be cèl·lules pròpies que expressen Ag estranys. El CAM té capacitat citolitica.

• Capacitat d'opsonització, alguns productes intermediaris del complement són opsonitzants, ja que els fagocits hi ha receptors per a eixos components del complement.

• Capacitat d'activar la resposta inflamatòria, alguns productes intermedis del complement poden actuar com a mediadors de la inflamació.

• El complement afavoreix l'eliminació dels complexos Ag-Ac. La resposta immune té mecanismes per eliminar o destruir els complexos Ag-Ac, un d'ells és aquest, que els elimina afavorint la fagocitosi, o unint-se a ells i solubilitzant-los. Els productes del complement s'uneixen als complexes i als receptors dels eritrocits i s'eliminen per via renal.

Els components del complement són molts, i reben una nomenclatura molt variable.

• Normalment s'anomenen amb una C seguida d'un nombre, que no té relació en l'orde de participació del complement, sinó del descobriment (CX). Normalment la conseqüència de l'activació del complement és la hidròlisi en dues parts de una molècula CXa + CXb.

• Moltes de les reaccions que tenen lloc a la formació del complex son de proteolisi i es denominen amb la lletra B o A.

• De vegades podem trobar iCXa, que indica que el producte és inactiu.

• Altres podem trobar CXbBb, aquest és el producte de la fusió de 2 components, eixa línia superior significa que té activitat enzimàtica.

• Altres components del complement i que reben nomenclatura diferent són els factors, són proteïnes que actuen sobre un component del complement tornant-lo actiu o inactiu (factor B, D, H, I, …)

Vies d'activació del complement

Per a que siga actiu, li cal activar-se, aquesta es pot produir:

• Inespecífica: No ve mitjada per Ac. Pot seguir 2 vies:

• Via alternativa: Aquesta activació té lloc perquè determinats components del complement s'uneixen a lipopolisacàrid i altres polisacàrids presents a la coberta del microorganisme.

Un factor del complement anomenat C3, està present a la sang de forma normal, i dividint-se en C3a i C3b, quan C3b contacta amb superfícies cel·lulars o altres elements reconeguts inespecíficament, es fixa a la coberta,

Aquesta unió esta condicionada per la presència de Polisacàrid a la pared del microorgaisme i l'absencia de Factors (els factors es troben a celules pròpies i eviten que C3b provoque autoinmuninitat.

El complexe estabiltza la seua unió i viatja pel torrent circulatori unint-se a latres factors del complement, primer amb un factor B, i després amb el factor D, per a donar lloc a C3bBb, que té:

• Activitat enzimàtica. Aquesta és una convertasa de C3, i actua sobre la present en suero catalitzant la hidròlisi de C3b en C3a i C3b. Açò amplifica la senyal.

• A més el C3b que s'està produint interactua amb el C3bBb per a donar lloc a C3bBb3b, aquest és convertasa de C5. Així fixa aquest factor del complement, l'hidrolitza i fixa C5b, alliberant al suero C5a i C5b.

El C5b s'uneix al complexe format.

...al que s'uneixen altres components del complement com [C6, C7, C8, C9]. Aquest últim conjunt s'anomena proteina anfipàtica: amb capacitat per implicar-se a les membranes celulars provocant la formació de canals pels quals entra Na; la cèl·lula mor per presió osmòtica.

A partir de una molècula de C3bBb, als pocs minuts hi ha milers de C3b.

El producte final és el CAM, el C3a i el C5a són productes intermedis amb diferents funcions, entre altres, activen la resposta inflamatòria.

Altre aspecte important és que la producció de C3b és continua, i pot ser nociva per a l'organisme, ja que si es forma C3, en quant hi haja factor B i D, es formarà la convertasa de C3 activant la cascada.

Però el factor H dissocia C3bBb ja que aquest és molt inestable mentre no estiga unit a les polisacàrids de la membrana del Ag, i el C3b interactua amb I per a donar iC3b.

**El C3a és una anafilotoxina, i pot produir al·lèrgies.

• Via de les lectines: S'ha descobert fa poc. El seu fonament és el de reconeixement de polisacàrids de manosa en la coberta del microorganisme. Eixa activitat és depenent d'una proteïna del complement anomenada MBL (lecitina binding manosa), quan aquesta i reconeix la manosa en una superfície cel·lular es transforma en una enzima anomenada MASP, amb una activitat molt semblant a la via clàssica: C1, que actua sobre C4 i C2...

La manosa també es troba a celules pròpies, però l'acció del complement sobre elles la inhibeixen factors inactivadors.

• Específica (clàssica): Mitjada per Ac. És l'anomenada via clàssica, perquè fou la primera en descobrir-se. L'activació es produeix perquè les IgM, G1, G2 i G3 tenen capacitat de fixar el complement (açò és, activar-lo). Aquesta via d'activació és depenent de Ac, quan un IgM, o un IgG es fixa a un Ag, pot fixar-se pel Fc a un fragment del complement anomenat C1. Aquesta fixació l'activa i li proporciona activitat enzimàtica, així pot dissociar altres dos components del complement, C4 i C2, i donar C4a, C4b i C2a, C2b; dels quals C3b i C2a queden units a la coberta de la cèl·lula formant el complex C4b2a, que és una convertasa de C3, i el dissociarà en C3a i C3b. S'uneix a C3b per a donar C4b2a3b que és convertasa de C5 i segueix la resta de reaccions fins formar CAM. Els productes son guals que a l'anterior cas: CAM, C3a i C5a.

-->Les funcions del complement [Author:A.T.B.]

S SSon les mateixes, independentment de la via d'activació, aquestes depenen sols del producte final (CAM) que és en realitat un compost multiproteïc de caràcter anfipàtic capaç de lisar antigens extranys; però hi ha determinats productes intermedis també actius i molt importants, i les funcions del complement dependrà de com actue tot en conjunt.

OPSONITZACIÓ: afavoreix la fagocitosi. El fagocits (macrofags i neutròfils), expressen en superficie receptors per a determinats factors del complement (C3b). Quan es reconeixen, s'activen i fagociten les cèlules que tenen units eixos factors.

A la superfície de la cèl·lula hi ha components biològicament actius, però a la majoria de reaccions (dissociacions de proteïnes), una de les dues parts sempre es queda fixada, però l'altre producte queda lliure. Eixos productes també són biològicament actius; Ex: C5a i C3a, que actuen com a mitjadors de la inflamació:

Determinades cèl·lules del sistema inmune (mastocits) tenen receptors per C3a i C5a. Quan s'uneixen als seus receptors, indueixen la desgranulació d'eixes cèl·lules (els mastocits alliberen leucotriens, histamina i determinades prostaglandines). Per aquesta raò C3a i C5a s'anomenen anafilotòxics, ja que per aquest mateix mecanisme produeixen reaccions alèrgenes.

• La majoria de les inflamacions es deuen a aquestos dos components

• Són la primera senyal d'amplificació de la resposta

• Són anafilotoxines.

• Poden desgranular mastòcits i basòfils, importants per a la inflamació.

• Eliminen els comlexes Ag-Ac. A la resposta inmunitària és un problema important, ja que poden obstruir conductes naturals: aqestos complexes Ag-Ac s'uneixen a eritrocits circulants i quan es produeix la seua destrucció fisiològica, també s'eliminen els complexes.

• Poden donar lloc a moltes reaccions al·lèrgiques.

• Poden afectar a cèl·lules i tenir efectes sistèmics.

CONTROL DEL COMPLEMENT

El complement és un dels mecanisme efectors potencialment més nociu per a l'organisme, i ha de ser absolutament regulat per a evitar-los. S'han de controlar sobretot les vies d'activació inespecífiques.

Per a eixe control hi ha tota una sèrie de proteïnes (s'han descrit més de 20) que inhibeixen el complement. El resultat net és que el complement s'està activant contínuament, però també desactivant-se. Això es deu a proteïnes que poden estar lliures (proteïnes sèriques) o fixades a la superficie cel·lular:

• DAF: Factor accelerador de la declinació. Es troba a la superfice de molts tipus de cèl·lules. Inactiva les convertases de C3, dissociant-les al moment de la seua formació; (recordem que la C3 es una d les primeres proteïnes que ocasionen l'activació del complement) evitant així tota la reaccio en cascada. Hi ha fagos que expressen una proteïna pareguda en superficie per inhibir el complement.

• HRF: Factor homòleg de transcripció. Bloqeuja el punt d'inserció de C8 i C9.

• CD59 o Protectina: Junt amb la HRF inhibeixen la unió de C8 i C9, de forma que no s'arriba a formar el CAM.

TEMA 14. FAGOCITOSI

La fagocitosi és el procés de digestió e ingestió de partícules amb un tamany comprés entre 0'5 a 100 m per part dels fagocits. Aquests comprenen dos tipus cel·lulars:

• Monòcits-macròfags: Es troben al teixit conectiu, i són molt abundants als pulmons, fetge, ganglis limfàtics. Són els fagocits més importants, i participen en processos com la presentació de Ag, la generació de resposta inflamatòria o la producció de citoquines.

Els macròfags procedeixen de la diferenciació dels monòcits, i són els que trobem a la circulació.

• Neutròfils: Cèl·lula circulant més abundant (65% dels leucòcits). Es tracta de una cèl·lula de vida curta, no es divideix, i té el nucli multilobulat, a més presenta tota una sèrie de grànuls que es tenyeixen amb colorants hemàtics clàssics com la toxilina fèrrica. Els grànuls poden ser de dos tipus:

• Primaris: Apareixen en primer lloc, contenen peroxidases, i altres proteïnes microbicides com les defensines, BPI o el factor estimulador de la permebilitat.

• Secundaris: Peroxidasa negatius, contenen enzims com la lisonzima, lactoferrina, fosfatasa alcalina i altres enzims que participen a la destrucció de microorganismes.

Hi ha altres tipus cel·lulars com els eosinòfils que poden tenir cert paper fagocític. La fagocitosi és un dels principals mecanismes de la resposta inespecífica, ja que:

• Els fagocits reconeixen inespecíficament determinats productes i fragments del complement que puguen estar units a eixos Ag a fagocitar i que es poden formar via inespecífica (C3b).

• En la resposta específica perquè tenen capacitat per a reconèixer determinades fraccions constants de Ac units a Ag i productes com el C4B.

• Poden reconèixer fraccions constants de Ac units a Ag o fragments del complement formats via específica.

• Per a l'eliminació de complexos Ag-Ac. El procés d'eliminació és el mateix que per a un Ag actiu, i els degrada per evitar que s'acumulen.

Etapes de la fagocitosi:

• Contacte entre fagocit i Ag, es pot produir de forma:

• inespecífica:

• Receptors per a molècules típiques de superficie: LPS, manosa...

• Receptors per a C3b que fan que el complement s'active inespecificament.

• Específica: mijançada per Ag: els macròfags tenen receptors èr a Ig A1 i A3 de gorma que quan contacta amb els Ac units a Ag, fagocita el comlexe. La IgM també pot estar imlicada: comque es pentamèrica, té bloquejat el punt d'unió, però e capacitat per activar el complement i, de forma indirecta, activa la fagocitos i sobre la partícula reconeguda.

• Fixació del Ag a la membrana del fagocit, el citoesquelet d'aquest va embolcallant al Ag, de forma que finalment el Ag queda inclòs en una vacuola, el fagosoma.

• Unió dels lisosomes al fagosoma, també se li uneixen grànuls citoplasmàtics. Tot el contingut dels grànuls queda a l'interior del fagosoma, que ara s'anomena fagolisosoma.

• Destrucció del Ag dins del fagolisosoma gràcies a l'acció del enzims lisosomals, i per una sèrie de reaccions que acompanyen al procés, com la formació de radicals lliures i altres productes tòxics, conseqüència de la degradació del Ag.

• Expulsió a l'exterior dels productes de degradació del Ag.

Els mecanismes de destrucció del fagolisosoma poden actuar de 3 formes:

• Enzims proteolítics del lisosoma: Hi ha molts amb caràcter proteolític, aquests són vessats a l'interior del lisosoma quan s'uneix al fagosoma. Els pèptids actius s'agrupen en 3 catergories:

• La que afecta la permeabilitat de la membrana

• Catepsina

• Defensines: proteïnes de baix PM.

• BPI: proteïnes bactericides, augmentadores de la permeabilitat de membrana dels microorganismes.

• Els que trenquen la membrana dels microorganismes

• Lisonzima

• Formen complexes amb el Ferro, alterant el creixement microbià.

• Lactoferrina.

• Producció de intermediaris reactius del O2: Depèn de la oxidasa fagocítica, aquesta està present a la coberta dels fagocits, de manera que queda a la paret del fagosoma quan es forma, i és capaç de reduir l'O2 molecular a ions superòxid O2-. Aquest és molt inestable, i dona per una banda H2O2 (amb aquest les peroxidases formen OH-), i complexes amb elements presents al a cèl·lula, com la Cloramina (molt tòxica). S'activa quan hi ha una exposició a la IFN mentre fagocita.

• NO i derivats: La fixació dels productes es deu a la òxid nítric sintetasa induïble, aquesta enzima produeix citrulina a partir de L-arginina, alliberant NO, aquest, el que fa és que reacciona amb l'ió superòxid que s'ha produït a conseqüència de l'oxidasa fagocítica, i done lloc a l'ió peròxid nítric ONOO·, que és molt tòxic.

En condicions normals l'enzim és inactiu, i s'activa quan es produeix l'explosió respiratòria, que és un increment del consum de O2 de la cèl·lula, la conseqüència del qual és l'augment de la producció de H2O2 i dels seus productes, i a més activa la òxid nítric sintetasa.

L'explosió respiratòria es produeix quan els fagocits estan activats. Molts microorganismes sols es destrueixen per l'explosió respiratòria, i aquesta es produeix per IFN-, lipopolisacàrid, Ac opsonitzants, C3a i C5a del complement, etc…

Regulació de la fagocitosi: Es pot regular per diversos mecanismes

• Molècules de membrana que tenen els fagocits. Bàsicament tot el procés de fagocitosi depèn de aquestes molècules.

• Per una banda uneixen al fagocit la partícula a fagocitar

• Algunes com la proteïna G participen en la remodelació de la membrana que porta el procés de ingestió.

• Són les responsables de transmetre la senyal que activa la capacitat microbiocida dels fagocits

• Hi ha molècules que no són dels fagocits i participen a la regulació, com el C3b i C4b, que són opsonitzants (els fagocits tenen C3b-R); C3a i C5a que indueixen l'explosió respiratòria, CK que participen en l'activació i regulació de fagocitosi com el IFN-.

• Determinats Ig participen a la fagocitosi afavorint-la, són la IgG1 i la IgG3.

• Aquestes Ig estan induïdes per IFN-, que a més indueix l'expressió dels receptors per a cadenes 1 al macròfag, afavorint el contacte.

• Al cas de l'opsonització mitjançada per Ac, hi ha un efecte de bonificació. Quan un Ac contacta amb el receptor ho fa amb determinada avidesa, si ho fa amb diversos Ac units, l'avidesa augmenta exponencialment.

Altres funcions de la fagocitosi:

• Activació de la resposta específica: on el tipus cel·lular més important és el macròfag, ja que produeix IL12.

• Eliminació d'inmunocomplexos: si s'acumulen els compexosAg-Ac poden arribar a ser tòxics. Si son fagocitats, encara que la IgG no estiga inactivada, sèvita l'acumulació.

Una altra via d'eliminació d'inmunocomplexos formats per IgM és l'activació del complement.

TEMA 15. RESPOSTA INFLAMATÒRIA

No és un mecanisme efector sinó de amplificació de la resposta, ja que posa en contacte els Ag amb les cèl·lules del sistema immune. És necessari per a que la resposta immune siga efectiva, i per aconseguir-ho, aquesta no es limita a una sèrie de contactes e interaccions entre cèl·lules presentadores i Ag, sinó que els contactes venen acompanyats de alteracions fisiològiques que afecten cèl·lules i òrgans que no formen part dels sistema immune.

Són la sèrie de reaccions que condueixen a les cèl·lules i a les molècules del sistema immune al lloc d'infecció o lesió, determinat per :

• Augment del flux sanguini.

• Augment de la permeabilitat vascular

• Migració transendotelial de teixits.

La resposta inflamatòria es pot generar per altres mecanismes no relacionats amb la resposta immune, encara que la resposta serà igual als dos casos, sols varia en la forma d'iniciar-se. Quan la resposta inflamatòria està generada pel sistema immune, la finalitat és amplificar la resposta, e induir aquesta al lloc d'infecció, per assegurar el contacte entre les cèl·lules del sistema immune i les cèl·lules que han originat la resposta.

A nivell macroscòpic està caracteritzada per dolor, rubor, hipertèrmia, i tot això és conseqüència de les alteracions fisiològiques i cel·lulars que tenen lloc:

• Vasodilatació.

• Expressió de molècules d'adhesió en cèl·lules endotelials.

• Encrement de la permeabilitat vascular.

• Quimiotaxis que provocarà que acudeixen cèl·lules del sistema immune a la zona de la infecció.

La conseqüència és la eliminació o l'aïllament del Ag, però en algunes ocasions, la resposta inflamatòria és perjudicial per a l'organisme, a més depèn de moltes cèl·lules i molècules que són els mitjadors de la inflamació.

Cèl·lules de la inflamació: Són moltes, i es troben tant a nivell circulatori com tisular.

• Circulants:

• Eosinòfils: Nucli bilobulat i grànuls citoplasmàtics que contenen substàncies com peroxidases, proteïnes de cristalls de Charcot-Leyden (fosfatasa) i altres com la proteïna principal bàsica (MBP). Aquestes seran importants a la generació de resposta quan els eosinòfils es desgranulen, i ho faran quan contacten amb IgE, encara que també tenen receptors per IgG i per determinats productes del complement (C3a i C5a). També poden expressar molècules que les permeten unir-se a cèl·lules endotelials i molecules d'adhesió. Els eoxinòfils, però, sols tenen importància en reaccions inflamatòries per alèrgia, ja que en condicons normals el seu normbre es prou baix.

• Basòfils: En condicions normals estan en molt baixa concentració (menys del 1 %), són molt importants per 2 raons:

• Tenen receptors per a cadenes  (IgE) i per a anafilotoxines (C3a i C5a). La generació d'eixos productes provoca la desgranulació. Als grànuls dels basòfils la substància més general és la histamina, que és el mitjador de la inflamació més important, és un vasodilatador molt potent i per això és el principal responsable de la vasodilatació que caracteritza la inflamació.

• La heparina que contenen evita que actuen els mecanismes de la coagulació tapant els llocs de trànsit de les cèl·lules del sistema immune.

• Plaquetes: Són fragments citoplasmàtics de megacariocits de la medul·la òssia. Són les cèl·lules més menudes presents a la circulació, ja que fan sobre 2 m de diàmetre. Participen als processos de coagulació. Tenen capacitat per alliberar prostaglandiens com la G2 i H2, o tromboxà, que són mitjadors de la resposta inflamatòria. Factors de creixement (CK que acceleren el factor hematopoietic), i el factor activador de plaquetes (PAF). Les plaquetes també tenen receptors per a cadenes .

• Tisulars:

• Macròfags: Indueixen o produeixen IFN- o TNF

• Mastocits: Intervenen bàsicament en les reaccions mitjançades per IgE. Quan s'uneixen a aquestes es desgranul·len i alliberen histamina, heparina, CK inflamatòries com TNF. El seu paper és el mateix que el dels basòfils però a nivell tisular. També tenen receptors per a fragments del complement com C3a-R i C5a-R.

• Cèl·lules endotelials: Encara que no són cèl·lules pròpiament del sistema immune són molt importants en la generació de respostes, ja que poden promoure la migració cel·lular, i modular l'activitat de les cèl·lules migratòries.

Les cèl·lules endotelials poden quedar adherides a l'endoteli. Un segon factor, és que en presència de IFN-, les cèl·lules poden expressar mMHC de classe II. Poden produir IL-1 i factors de creixement de granulocits i macròfags

Hi han molècules que participen en la inflamació i s'anomenen mediadors de la inflamació, i poden ser produïdes per diferents tipus cel·lulars. Hi ha més de 200, així que les agrupem segons la funció, les característiques o la funció a la resposta. Es poden agrupar en 4 categories:

• Mediadors vasoactius i de la contracció del múscul llis: Les funcions que acompleixen són:

• Vasodilatació

• Augment de la permeabilitat

• Contracció del múscul llis. Augment del nº de cèl·lules en sang.

• Quimiotaxi (algunes d'elles). Permet arribar més cèl·lules

El resultat és un augment del flux de sang, i augmenta la permeabilitat, cosa que afavoreix el pas de cèl·lules cap a l'Ag. Les més importants són:

• Histamina: Es troba en basòfils i mastòcits, fonamental en reaccions mitjades per IgE, IgG i anafilotoxines (C3a i C5a). La funció fonamental és la vasodilatació.

• Metabolits de l'àcid araquidònic: Produïts per la ciclooxigenació de l'àcid araquidònic, que dona lloc a les prostaglandines, i són les responsables del dolor que es produeix en la resposta inflamatòria. També es pot lipoxigenar dnant leucotriens.

• PAF:

• Aquest desgranula neutròfils i eosinòfils

• Pot induir la producció de PG i activar el complement.

• Participa als processos d'extravasació circular.

• Quimioquines: CK produïdes per diferents tipus cel·lulars que produeixen quimiotaxis dels diferents tipus de cèl·lules del sistema immune. Es classifiquen en 2 grups:

• C-X-C: (C=Cys; X=aa quaslevol) IL-8, ENAC-78, atrauen neutròfils, macròfags i linfòcits.

• C.C: MIP, RANTES. Atrauen monocits, cèl·lules NK, basòfils i eosinòfils.

• Mediadors enzimàtics: s'alliberen a l'exterior al desgranular-se la cèl·lula. Hi ha molts, però el més important és la bradiquinina, que produeix vasodilatació, augmenta la permeabilitat, la contracció del múscul llis; és responsable del dolor que caracteritza les reaccions inflamatòries.

• Proteoglucans: Són complexos de proteïnes i polisacàrids, són molt abundants en mastocits i basòfils. El més important és la heparina, un anticoagulant que assegura el flux sanguini.

Inici de les respostes inflamatòries:

Poden ser conseqüència d'una resposta immune o d'altres orígens. S'inicia per un reconeixement d'un Ag, i pot ser:

• Inespecífic: S'activa per la presència d'un Ag que activa el complement via alternativa, produeix C3a i C5a. Moltes cèl·lules del sistema immune són desgranulades, així s'activa la resposta inflamatòria. L'altra via és la lesió que pot provocar el Ag directament sobre el teixit. Al activar-se la coagulació s'activa el complement. Es produiran C3a i C5a, anafilotoxines que desgranulen mastòcits, basòfils, eosinòfils. Induirà l'alliberació de mediadors de la inflamació (histamina i bradiquinina) produint resposta inflamatòria.

• Específic: Els Ag activaran els linfòcits B, produiran Ac. Si es produeix IgG o IgM s'activarà el complement, es produeix C3a, C5a i es desgranulen cèl·lules inflamatòries produint la inflamació.

També es pot produir IgE que no activa el complement, però es produeix la desgranulació dels mastocits.

La conseqüència final és l'alliberament de mitjadors de la inflamació en la zona d'atac de l'Ag. Es produirà vasodilatació, augmenta la concentració de cèl·lules del sistema immune per la quimiotaxis que es produeix per la producció de CK IL-6, IL-2, així com de INF- i TNF.

Les cèl·lules endotelials expressaran molècules d'adhesió, i al augmentar la permeabilitat a causa de les molècules anteriors, l'espai intracel·lular s'incrementarà, permetent a les cèl·lules travessar l'endoteli i contactar directament amb l'Ag per quimiotaxi (diapèdesi).

Arriba un moment en que ja no és necessària la resposta inflamatòria, disminueix la producció de quimioquines i factors de inflamació, no s'activa el complement, tant les cèl·lules endotelials com els teixits dels voltants del capilar tornen a l'estat normal, però s'han produït ferides entre les cèl·lules, i el sistema de coagulació les repara.

Es produeix un cúmul de cèl·lules inflamatòries i de productes de degradació del Ag i del propi teixit, es tracta del pus.

Regulació de la resposta inflamatòria:

Com en tots els processos de la resposta immune, aquesta també ha d'estar regulada, perquè podria ser molt perjudicial per a l'organisme. En aquest cas la regulació està basada en la presència de determinades molècules que inhibeixen alguns passos de la resposta. Poden actuar a nivell del complement o cel·lular:

• A nivell del complement: Inhibeixen la generació de la resposta inflamatòria. Les molècules són el factor HRF, DAF (eviten la formació de la convertasa de C3), la proteïna inhibidora de C1. Qualsevol proteïna que inhibeixca el complement, i principalment les dels passos inicials, també inhibeix la inflamació.

• A nivell cel·lular: Moltes molècules poden inhibir la resposta inflamatòria:

• PG F2, que inhibeix l'activació de linfòcits.

• Els glucocorticoides que inhibeixen l'expressió de molècules d'adhesió en cèl·lules endotelials, e inhibeixen la resposta inflamatòria.

• TGF que inhibeix la macròfags, cèl·lules NK. I la diferenciació de linfocits.

• IL-10 que inhibeixen les respostes cel·lulars.

Inflamació crònica:

Hi ha ocasions en que el Ag resisteix a la resposta inflamatòria, i aquesta no acaba mai, aquest procés seria molt nociu per a l'organisme. En eixos casos, el caràcter de la resposta inflamatòria canvia, per una estimulació molt persistent es produeix un cúmul de macròfags al voltant del Ag, que canvien per formar una cèl·lula epitelioide (gegant) per una hiperactivació d'aquestos que es la fusió de varios macròfags.

A la zona afectada hi ha molts macròfags al voltant del Ag, i com l'estan reconeixent, es convertiran en diana dels linfòcits T citotòxics i cèl·lules NK provocant-los la desgranulació. Així s'alliberen substàncies que atrauran cap a la zona fibroblasts, que embolcallaran tot el complex, produiran fibrosis i necrosis al voltant del Ag, i així es formarà un granuloma, que aïllarà al Ag de la resta del organisme.

TEMA 16. ANATOMIA FUNCIONAL DE LA RESPOSTA IMMUNE

La major part de la informació s'obté d'estudis in vitro, i cal veure com funciona en l'organisme, ja que normalment els Ag entren per la pell o els tractes respiratoris, on la concentració de cèl·lules defensives és molt baixa. La evolució ho ha solucionat amb:

• Mecanismes de recollida de Ag, en que l'organisme porta els Ag del lloc d'entrada fins on poden ser reconeguts pel sistema immune, açò és, els òrgans linfoides secundaris.

• Procés de recirculació limfocitària. Els responsables del reconeixement antigènic tenen un sistema de circulació diferent de les cèl·lules del sistema immune. Aquesta s'ha format perquè calia solucionar altre problema, i és que la representació de cada especificitat és molt baixa, com a conseqüència dels processos de diversitat. El procés es du a terme recollint mostres del Ag i portant-se fins els òrgans limfoides, ja que la concentració de linfòcits no activats en aquest òrgan és molt alta.

Cada teixit té unes característiques diferents que conlleven diferències a la resposta.

Diferències en la recollida dels Ag: Quan un Ag es troba a la sang, el reconeixement no és problemàtic, perquè tota la sang es filtra per la melsa, allí es concentren molts macròfags, cèl·lules dendrítiques i linfòcits, fent que el contacte amb l'Ag estiga assegurat.

Però la majoria de Ag accedeixen a l'organisme a través de la pell, dels epitelis mucoses i dels tractes gastrointestinals i respiratoris.

A nivell de la pell i les mucoses hi ha molts capil·lars limfàtics que drenen els líquids intersticials, aquestos entren al sistema limfàtic i formen la limfa. Aquesta té una mostra de tots els Ag presents a la pell i les mucoses. Una part d'eixos vasos limfàtics, concretament el limfàtic aferent, porta la limfa fins als ganglis limfàtics, on arriben continuament els linfòcits, produint-se el reconeixement per contacte.

Aquest és el mecanisme fonamental de recollida de Ag, però hi ha altres teixits que poden afavorir la resposta immune, com la presència de teixit limfàtic associat a mucoses (MALT).

RECIRCULACIÓ LINFOCITÀRIA

Els processos de recirculació són diferents al T activats dels no activats, degut a les diferents concentracions de cada tipus de limfocit. També es diferent entre efectores i de memòria.

• Els patrons de recirculació són diferents als linfòcits T no activats i en els de memòria o efectors.

• Eixa migració de linfòcits està mitjançada per receptors de assentament expressats a la coberta dels linfòcits i els seus lligams específics a les cèl·lules endotelials.

Els linfòcits T són els principals efectors. La recirculació limfocitaria ha d'aconseguir que la concentració de T activats siga alta als ganglis limfàtics, i s'aconsegueix gràcies a que els T arriben a la circulació i entren en un tipus de venula HEU (la vènula endotelial alta). Aquestes estan presents tant en ganglis limfàtics com en teixit associat a mucoses.

En condicions normals, els linfòcits no queden retinguts al corrent circulatori. En les cèl·lules de les vènules endotelials altes s'expressen molècules d'adhesió (selectines, integrines, dominis d'Ig...) que provoquen la fixació dels T i els permet fins i tot travessar la paret per accedir a l'estroma del gangli limfàtic per un procés paregut a la diapèdesi, que és el lloc on es filtraran els Ag.

El procés de recirculació dura 1 hora, i en qualsevol moment, el 2 % dels linfòcits està present als ganglis.

Una vegada el limfocit està dins del gangli, poden succeir dues coses:

• Que no reconega cap Ag dels que es filtren, i en eixe cas el limfocit torna a la circulació pel conducte toràfic.

• Que reconega un Ag del gangli, i s'active. Primer expressa molècules d'adhesió, fent que el limfocit activat quede fixat al gangli i prolifere allí mateix linfocits clòniscs. La descendència ja no es queda adherida (no resentarà molecules d'adhesió) i surt a la circulació dirigint-se al lloc de la infeccióatrets per quimiotaxi on alliberen mediadors de la inflamació.

Linfòcits B: No es coneix massa be, però es sap que encara que estiguen activats romanen a la melsa, ganglis i teixits limfàtics, perquè no necessiten eixir, ja que ataquen a distància produint Ac. No es dirigeixen directament cap a l'Ag, sinó que van pululant fins el troben per casualitat.

En determinades malalties que cursen a la pell, els nivells de Ac en sang és menut, perquè a més de que la resposta és pràcticament cel·lular, els Ac es produiran al SIC.

Generació de respostes en diferents teixits de l'organisme

• A nivell cutani: SIC (Sistema Immunitari Cutani). Les respostes cutanies són molt importants:

• La pell és l'òrgan més gran de l'organisme.

• És on es produeixen la major part dels contactes amb Ag.

Per això, per generar respostes immunitaries pròpies, la pell té cèl·lules especialitzades que conjuntament s'anomenen SIC:

• Queratinocits: es troben a nivell de l'epidermis, al ser activades per IFN- produeixen citoquines com la IL-1, IL-3, IL-6 IL-8 o el TNF (CK de la inflamació). També poden reconèixer mMHC I.

• Cèl·lules de Languerhans: Són cúmuls de cèl·lules dendrítiques i presentadores de Ag. Després del contacte amb l'Ag, les cèl·lules de Languerhans perden l'adhesivitat, i cauen a vasos limfàtics fins al gangli, a partir d'aquestos es genera la resposta.

A més, tant per la dermis com per la epidermis hi ha linfòcits dispersos.

Les respostes es generen al entrar el Ag i contactar amb cèl·lules de Languerhans que ja poden presentar els Ag als linfòcits presents. Degut a eixa activació, produiran IFN-, que farà que s'activen els queratinocits. Així es produeix la reacció inflamatòria.

A nivell de la pell les respostes són eminentment cel·lulars, encara que hi ha resposta humoral, normalment de IgA, ja que aquesta es pot produir pels linfòcits B presents a la dermis (encara que hi ha pocs); i es pensa que l'activació dels linfòcits es produeix a nivell del gangli limfàtic, i que aquells B que canvien a isotipus A, tenen tendència a migrar cap a eixes zones.

• A nivell de mucoses: Al igual que la pell, les mucoses constitueixen una barrera que separa a l'organisme del medi ambient, i per elles es produeix el contacte amb l'Ag. Per això cal un sistema específic que genere resposta a nivell d'aquestes mucoses. Quan parlem de mucoses ens referirem quasi sempre a mucoses del sistema G.I. En aquestes podem trobar:

• Linfòcits intraepitelials: Intercalats entre les cèl·lules endotelials

• Linfòcits en làmina pròpia: A l'intestí, és la capa cel·lular subepitelial.

En totes les mucoses hi ha folículs limfoides associats a mucoses (MALT). Ex: plaques de Peyer i folículs a altres òrgans, són fonamentals per a la presentació de Ag en eixes mucoses.

D'aquestos es serveix el sistema immune per generar respostes a les mucoses.

Generació de resposta:

Els estudis que s'han fet a nivell gastrointestinal indiquen que l'Ag està separat de l'intestí per les plaques de Peyer, i no es pot fer el reconeixement de forma normal, sinó:

• A nivell de l'epiteli: per la presència de linfòcits intraepitelials, en presència de IFN- expressen mMHC II per presentar l'Ag.

• A nivell de cèl·lules endotelials: Les cèl·lules M intercalades a l'epiteli cel·lular, que atrapen Ag per un procés semblant a l'endocitosi, i el transporten a la làmina pròpia. Allí es fa el contacte i es genera la resposta.

Si l'Ag no es fixa, serà arrossegat i eliminat.

La resposta es caracteritza per un predomini de IgA, degut a que els B que la produeixen tenen tendència a migrar a mucoses. Les CK que es produeixen en eixa zona afavoreix la producció d'aquesta Ig.

Al punt d'unió de dues Ig dimèriques, junt al component J, hi ha un component secretor que fa de receptor de les cèl·lules de l'epiteli. La IgA es produeix i s'uneix al “component secretor”,. El complex s'internalitza a una vacuola i es transportat a l'altra banda de la cèl·lula on s'allibera.

TEMA 17. PROCESSOS DE TOLERÀNCIA IMMUNOLÒGICA: AL·LÈRGIES

La tolerància immunològica es pot definir com el fenomen de inactivació funcional produït per l'Ag, i que dona lloc a la incapacitat d'un organisme per a respondre front a aquest.

El Ag si que és reconegut, però no es genera resposta immune. Els fenomens de tolerància sempre els produeixen Ag després de la seua exposició.

La generació de resposta immune i la tolerància són les dues possibles respostes front a un Ag

• Si genera resposta és un immunògen

• Si no genera resposta és un tolerògen

Però sempre és conseqüència d'un Ag. La tolerància és necessària front a determinats Ag, i particularment front aquells amb que es contacta habitualment (de l'aire, el menjar, etc…) i que no poden generar resposta. Es pot establir a dos nivells:

• Tolerància central: Es dona en linfòcits immadurs, i els processos que condueixen a ella tenen lloc en òrgans limfoides primaris; són els processos de selecció (o educació linfocitària).

• Tolerància perifèrica: És la que es genera als linfòcits madurs (ja han sofrit per tant la selecció positiva) i que ja es troben en teixits perifèrics. Aquestos processos es generen de forma diferent per a T que per a B.

• Per als T: Dels que més es coneix, i es creu que els mecanismes de generació de tolerància perifèrica dels B està mitjada pels T. Es distingeixen 3 mecanismes:

• Anèrgia induïda per dèficit de coestimulació: Consisteix en la manca de senyals de coestimulació que es produeixen en la presentació del Ag, normalment per dèficit d'aquestes molècules en les cèl·lules presentadores de Ag, fent que el limfocit no s'active. S'indueix l'anèrgia del limfocit i d'eixa especificitat. Encara que es torne a trobar amb el Ag presentat per una cèl·lula que sí té molècules de coestimulació, ja no s'activa. Les causes per les que es genera aquesta tolerància no es coneixen, ni tampoc les conseqüències pràctiques d'aquest mecanisme.

• Anèrgia induïda per reconeixement de Ag peptídics alterats: Quan un T es troba amb un APC que presenta una forma alterada de l'Ag peptídic es perd la capacitat de resposta front a la forma nativa d'eixe Ag. No només no genera resposta, sinò que el torna anèrgic a eixa especificitat. No se sap perquè es produeix, però es creu es creu que la unió a l'Ag alterat és de baixa afinitat, i això genera una resposta parcial. És un mecanisme semblant al dels autoAg. Les conseqüències pràctiques no es coneixen, però es sap que el fan servir alguns microorganismes per evadir la resposta immune, i després el canvien per un molt semblant. Aquest mecanisme s'està usant per a tractar malalties autoimmunes, inoculant una forma alterada dels pèptids que causen problemes, així es genera anèrgia front a eixi Ag, i es pot paliar l'efecte de les malalties.

• Eliminació de cèl·lules T per mort induïda per activació: Ocorre als linfòcits T quan hi ha estimulació repetida per un mateix Ag. Eixa apoptosi està mitjada per la unió de la proteïna Fab present a cèl·lules presentadores de Ag amb el lligand Fas de les T. Aquesta unió activa la via de l'apoptosis. No es coneixen els mecanismes ni la funció, però pot ser útil per a evitar respostes front a Ag comuns per un mecanisme de inhibició per retroalimentació.La conseqüència és l'apoptosi de T e inhibició funcional.

• Per als B: No es coneix massa, i probablement siguen conseqüència dels T.

TEMA 18. MECANISMES DE REGULACIÓ NEGATIVA

Són els encarregats de posar fi a la resposta immune, ja que en el moment en que es destrueix el Ag s'ha de posar fi a la resposta immune, de lo contrari podria ser negativa per a l'organisme.

Bàsicament els mecanismes generals de regulació de la resposta immune són 4:

• Citoquines inhibidores: La majoria de les CK activen unes funcions e inhibeixen altres oposades. Ex: IFN-, activa resposta cel·lular, però inhibeix resposta humoral; la IL-10 és una CK que afavoreix les respostes humorals Th2, i h fa inhibint les respostes cel·lulars ja que inhibeix l'activació dels macròfags i la producció de CK de tipus I. Hi ha altres CK com el TGF que inhibeix la proliferació i diferenciació de cèl·lules del sistema immune, i d'aquesta manera s'inhibeix qualsevol tipus de resposta immunitaria.

• Linfòcits T supressors: Durant molt de temps es pensava que a més dels Th1 i Tc, hi havia els T supressors, aquestos inhibien les respostes immunitaries. En l'actualitat ja no es creu que siguen una població diferent de linfòcits, sinó que són els mateixos Th i Tc, però que en un moment determinat actuen com a inhibidors de les respostes immunitaries per la producció de CK.

• IL10: inhibeix la població cel·lular.

• INF-: inhibeix la diferenciació de linf T ! Th1.

• Regulació idiopàtica: És un mecanisme basat en la hipòtesi de que un individu pot generar Ac front als idiotips de un Ac (hipòtesi de Lappek). Quan la concentració de Ac lliures o en superfícies de linfòcits és suficientment alta en l'organisme, eixes regions hipervariables poden donar lloc a Ac antiidiotipus. Per una banda bloquegen els llocs d'unió i els de reconeixement de Ag. Es produiria supressió o inhibició de les respostes humorals. Serveix per a frenar la repsosta humoral, ja que els receptors de cèl·lules T quan la concentració de Ac és prou alta poden donar lloc a Ac antireceptors de antiregió hipervariable de receptor T.

• Retroalimentació per Ac: Els Ac produïts com a resposta a un Ag, no tan sols van a actuar neutralitzant l'Ag, sinó que també actuen inhibint la resposta immune en un moment donat. Es pot produir per diferents mecanismes:

• La pròpia acció dels mecanismes front Ag, determina el fi de l'estimulació antigènica i la fi de la producció de Ac.

• Els complexes entre Ag-Ac poden unir-se a linfòcits B, i li produeix la inhibició d'aquest.

Però encara s'estan produint CK, aquestes s'inhibeixen perquè les cèl·lules T productores de CK també tenen receptors per a Fc de Ig unides a Ag, així s'inhibeix l'activaitat d'eixe T i la producció de CK. La resposta disminueix de forma global.

Citoquines supressores: hi ha moltes CK que inactiven funcions, i d'altres que inhibeixen les respostes inmunes. Eixes CK poden tenir un paper important a l'eliminació de la resposta inmune: TGF, INF-, IL10.

TEMA 19. APLICACIÓ DELS Ac I Ag AL LABORATORI

La unió Ag-Ac és molt interessant al laboratori degut a la seua especificitat . Qualsevol laboratori que treballe amb proteïnes ho ha de fer amb Ac, i per a dur a terme els processos hem de detectar el Ag de la mostra, purificar-lo i localitzar la proteïna.

• És important en investigació

• En tractament de malalties amb seroterapia (les -globulines, que són Ac prefabricats). Així s'ajuda a l'organisme a lluitar contra l'enfermetat. Ex: Tètanus.

• Altra utilitat és que poden convertir en dianes cèl·lules de l'organisme que interessa que ho siguen. Ex: determinats tumors, per als quals es donen Ac que s'uneixen front a cèl·lules tumorals, i les converteixen en diana dels sistema immune.

• I el més important, per al diagnòstic, ja que moltes malalties s'han de diagnosticar per la resposta immune que generen. El fonament és la detecció en suero dels Ac produïts per un agent infecciós. Posem en contacte el suero del pacient amb un Ag prèviament obtés al laboratori, i si al suero del pacient hi ha Ac front a aquest es produirà la reacció, la qual es posarà en evidència per diferents mecanismes

Inicialment l'immunodiagnòstic s'aplicava sols a les malalties d'origen infecciós, però ara ja s'aplica a malalties d'orígens molt diferents, i molts tumors es diagnostiquen gràcies a aquestes tècniques. Ex: Al càncer de pròstata es determina la proteïna P5.

Forcen la unió Ag-Ac, la diferència entre les diferents tècniques està en com posar en evidència la unió.

Obtenció de Ag i Ac al laboratori

• Obtenció de Ag: Podem obtenir-lo de diferents formes, segons el tipus de Ag. Es classifiquen segons el mètode d'obtenció o purificació de l'Ag:

• Ag complets: És una suspensió dels diferents Ag de un agent infecció obteses per lisat d'aquest; provenen del lisat de l'agent infecciós, i podem obtenir-lo de cultius, d'una mostra biològica i aïllar-lo. El lisem posant-lo a un homogeneitzador de teixits, de forma que el resultat final és una suspensió de totes les molècules d'aquest agent.

Aquestos Ag són fàcils i barats d'obtenir, però la barreja antigènica és tan gran que dona moltíssimes reaccions creuades, cosa que aporta poca especificitat al diagnòstic.

• Fraccions antigèniques: són una part d'aquest lisat complet obtés per centrifugació.

• Els Ag d'excreció-secreció provenen del metabolisme d'un agent infecciós viu. S'obtenen posant el agent a un medi tamponat, de manera que va alliberant els Ag al medi, i podem agafar-los d'ahí. L'avantatge d'aquest grup és que no donen tanta reactivitat creuada perquè no són una fracció de l'extracte complet. Solen ser més específiques que els Ag estructurals.

• Les fraccions anatòmiques, concretes, determinades també són efectives, i els mecanismes d'obtenció varia molt segons la fracció anatòmica que es faça servir. Ex: front a determinats Ag s'usen Ag de flagels o de la coberta cel·lular. És molt útil usar fraccions de la mateixa coberta cel·lular (es fa cultivant-les amb detergents: Triton-X, SDS...)

Tots els Ag tenen com a acaracteristica comú ser molècules poc definides.

• Antígen purificat: Són un conjunt de molècules perfectament definides i obtingudes a partir d'extractes de l'agent infecciós. Es poden aïllar per cromatografia, electroforesis, precipitació o altres mecanismes. Ací trobem un sol tipus de molècula en suspensió, per això presenta molta més especificitat, i com que es tracta d'una o poques molècules podem triar entre elles.

Els problemes són que la purificació és molt cara i costosa, i normalment poden aparèixer altres molècules com a impureses de la mostra, ja que és difícil que no comparteixquen una característica fisicoquímica amb altra molècula de la mescla. Per això, actualment no es fan servir Ag purificats, i els d'elecció són els Ag recombinants.

• Antígens recombinants: Són Ag bioquímicament definits, però obtesos per expressió en un vector en què prèviament s'ha clonat el gen que codifica per a eixa molècula.

L'avantatge és que es poden triar les característiques de la molècula que volem. Ex: Si volem que siga immunogènica, la podem aconseguir abans de saber quina és per immunoscreening. Aïllem els clons fent cultius del suero del pacient amb el E. coli mutant. En aquestos podem determinar les condicions que ens interessen, tant la fase d'infecció com altres característiques. Encara que laboriós, a la llarga es barat i molt més pur; a més, si coneguem la molècula qu evolem, es pot fer per PCR.

Les molècules o conjunt de molècules que siguen d'un agent infecciós poden servir de Ag, inclòs poden ser heteròlogues, i si hi ha reactivitat creuada, les molècules del primer agent infecció poden servir per a detectar el segon agent.

Hem de determinar la capacitat que ens dona eixe Ag, i es fa comparant-lo amb un suero d'un individu que sabem que és negatiu, i després amb un positiu.

És molt important determinar el background o soroll de fons, ja que és la senyal que dona eixe Ag de forma inespecífica, i serveix per a saber a partir de quin punt la prova és positiva. Ex: un ELISA que dona un background de 0'2 que s'ha d'afegir a la senyal que dona.

• Obtenció de Ac: El tenir Ac al laboratori dona possibilitat de modificar diferents proves que ens facilitaran la realització de certes tècniques. Hi ha de 3 tipus:

• Ac policlonals: Són aquelles que reaccionen front a un Ag complet, front als diferents epítops que composen un Ag. Són els més fàcils d'obtenir, i el procés comença amb l'obtenció de l'Ag, l'inoculem a un animal d'experimentació (o en el seu defecte a Arturo), que produirà Ac front a eixe Ag (això si no es complen les meues sospites de que Arturo no te sang a les venes...). Després extraiem sang a l'animal i d'ella aïllem l'Ac policlonal. Podem usar directament el suero, o purificar el Ac que ens interessa, però de totes formes quedaran restes de altres Ac que reaccionaran amb el Ag donant el background.

Es poden purificar precipitant-los amb Ag, i ens quedarà al sobrenadant els Ac inespecífics, i al precipitat els que han reaccionat amb l'Ag. El més important per a l'obtenció d'un Ac policlonal és la puresa de l'Ag que inoculem a l'animal, perquè com a conseqüència d'eixa immunització l'animal generarà Ac front a tot el que s'inocule. Com més pur siga l'Ag, més específic el Ac que produirà.

Si no és completament pur donarà major background.

Els Ac policlonals s'empren molt perquè són molt fàcils d'obtenir, però com no son molt específics solen donar reactivitat creuada, depenent de l'Ag de la immunització. El Ac dona major reactivitat creuada que el Ag, perquè estem amplificant la senyal.

• Ac monoclonal: Són aquells que reaccionen front a un únic epítop d'un Ag. Són els generats per un únic clon de limfocit B. Inoculem a l'animal els l'Ag i ens produirà els Ac, que obtindrem per estracció de linfocits B i selecció d'hibridomes en medi selectiu. Aquestos tenen l'avantatge de l'especificitat. Si l'epítop està ben triat poden arribar a ser molt específics.

Els desavantatges són:

• el preu.

• la dificultat d'obtenció.

• Quan s'usen aquestos baixa la sensibilitat.

A més, en aquelles proves en que es requereix desnaturalització de proteïnes, els monoclonals seran inútils si afecta el epítop estructural al que van dirigits.

• Ac recombinants: Són els obtesos per tecnologia recombinant. Aquestos no es fan servir al laboratori perquè són cars i difícils d'obtenir.

TEMA 20. INTRODUCCIÓ AL DIAGNÒSTIC IMMUNOLÒGIC

Al camp del diagnòstic és en el que més s'han fet servir i en el que més han avançat les tècniques immunològiques, però poden usar-se per a qualsevol altre camp.

El diagnòstic de qualsevol malaltia pot fer-se per diferents mètodes, independentment de la etiologia:

• Clínic és la diagnosi feta en funció de la simptomatologia que el malalt presenta. És dificil fe-ne uns, però, quan no hi ha simptomatologia, o aquesta és inespecifica.

• Etiològic o directe: L'anàlisi del quadre clínic pot conduir a etiologies diferents. Es basa en l'aïllament e identificació de l'agent causal de qualsevol malaltia. Per diverses metodologies es veu o identifica la causa que provoca la malaltia. Ex: tècniques de TAC, tomografia, RX, analisi indirecte (sang). El problema és que en moltes malaltiesl'agent pot no sortir per femtes o sang, o trobar-se en un punt de dificil localització radiològica, o en període d'incubació, i no es pot fer el diagnòstic clínic. Aquest no es pot dur a terme quan la concentració de l'agent infecciós siga molt baixa. És necessari un experiència important de les persones que volem diagnosticar.

• En ocasions cal recórrer al diagnòstic indirecte (molecular), que és aquell basat en determinar l'existència de la malaltia per observació o determinació de les conseqüències de l'agent infecciós sobre el pacient. Ex: quan es mesuren les transaminases, sabem que hi ha anomalies a nivell hepàtic. Aquest però, també té l'inconvenient de que l'agent es trobe en teixits interns (quistes).

El diagnòstic immunològic és inicialment indirecte, ja que és l'aplicació de mètodes que posen en evidència una malaltia, be siguen basats en la reacció Ag-Ac o en qualsevol altre tipus de reacció immunològica.

Es determina la conseqüència en l'organisme de l'acció immunològica. La majoria de les tècniques immunològiques determinen la presència de Ac, però també hi ha reaccions basades en immunitat cel·lular que determinen la presència de Ag, però tenen una metodologia diferent, a més, als últms anys s'ha produït un gran avanç amb les tècniques de ADN recombinant, cosa que dona la possibilitat d'aconseguirAc practicament per a qualsevol tipus de molècula.

• Determinació de la presència de Ac: Posar en contacte el Ag amb una mostra de Ac. Són les més tradicionals (per diagnostic de malalties infeccioses), a partir de les quals es desenvoluparan les altres, el fonament tècnic és el mateix, i la diferència entre elles està en la forma en que es posa en evidència eixa unió, que pot ser directa o indirecta (amb Ig antiIg). Tenen, però, problemes com:

• És molt difícil diferenciar entre una infecció present i una passada, ja que sempre queda una tasa de Ac residuals quan es passa una malaltia i fa difícil diferenciar el moment en que es troba de la infecció.

• No es pot aplicar a qualsevol mostra, sols a aquelles que podem trobar Ac inalterats, normalment es poden aplicar a suero.

• Els agents que provoquen IgA seran difícilment diagnosticables.

• En processos de resposta eminentment cel·lular no podrem diagnosticar per falta de Ac. Ex: Leishmaniasis cutania.

• En alteracions de la resposta immune. Ex: Quan hi ha immunodeficiències, la producció de Ac està alterada, i és molt difícil diagnosticar.

• Als periodes inicials, ja que donaria negatiu perque encara no ha comenát a generar-se la resposta d'Ac.

Aquestes limitacions fan que s'haja desenvolupat una sèrie de tècniques Ig que en lloc de detectar Ac detecten Ag.

• Determinació de la presència de Ag: Igual que les anteriors però detectem Ag, es tracta de juntar la mostra on presuntament es troba l'agent infecciós amb un Ac obtingut prèviament al laboratori. En aquest si que determinem l'agent causant de la malaltia. La detecció del complexe Ac-Ag pot ser directa o indirecta (Ac anti Ig).
  Entre els avantatges destaquen:

• La possibilitat de diferenciar entre malalties presents i passades.

• Si el Ag està present, tant si hi ha o no Ac, hi ha malaltia en eixe moment.

• El resultat és independent de la capacitat de fabricar Ac per part de l'hoste i del tipus de resposta que provoque l'agent causal, (funciona inclús en inmunodeprimits).

• Es pot aplicar a tècniques molt diferents, i no depèn d'on es troben els Ac o els components del sistema immune. Ex: El cas de les tècniques que detecten coproAg (a una mostra de femta es fa un frotis i se li aplica el Ac).

• Podem separar la fracció proteïca de la mostra.

Aquestes tècniques es fan servir tant a nivell anatòmic com en diagnòstics d'embaràs o Rh.

Quan anem a posar en marxa una tècnica d'anàlisis immunològics hem de caracteritzar perfèctament la tècnica, i quan tinguem el resultat saber la fiabilitat d'eixe resultat. El primer que es fa és determinar la quantitat de falsos positius o negatius que ens dona la tècnica.

• Fals negatiu: Malalt real que dona negatiu un test diagnòstic concret.

• Fals positiu: Dona positiu al test diagnòstic encara que no estiga realment malalt.

• Sensibilitat: Percentatge de malalts per als quals el test és positiu. Dona la capacitat de diagnòstic que té una tècnica.

• Especificitat: Percentatge de sans per als quals el test és negatiu. Capacitat d'una tècnica per a discernir entre dues malalties diferents.

Aquestes dos s'han de conèixer per a determinar la tècnica. Això es fa agafant mostres que coneixem perfèctament de altra tècnica.

Comparem els resultats obtesos amb la tècnica definida amb els que hem tret de la tècnica nova, i les calculem segons les fòrmules.

No hi ha cap tècnica que siga fiable al 100%, quan fem ! l'especificitat, la sensibilitat ! i viceversa. Per esemple, si usem Ag monoclonals, la especificitat serà molt gran, pero com reconeixeran un nombre molt limitat de molècules la sensibilitt serà baixa. Si usem per contra, Ag que ereconeguen moltes molècules, la sensibilitat serà major, pero tindrem com a resultat molts falsos positius per reaccions creuades ! Especificitat.

La solució passaria per combinar dues tècniques: una que siga molt sensible (ELISA);i d'altra que siga molt específica (western Blott), que ens servirà de diagnòstic de confirmacó.

Les quantitatives determinen, a més de la positivitat de la prova, la quantitat de Ag o Ac de la mostra. Es pot fer de dues maneres:

• . Usar diferents dil·lucions del problema, establir desde quina dil·lució la prova és positiva. És el títol d'una mostra. (ex: en W.B. diluir fins que es borre la banda)

• Tenir solucions patró, i comparar la resposta amb aquestes solucions.Per decidir si és positiu o negatiu hem de determinar el punt de tall o cut off, és el punt numèric a partir del qual una prova es considera com a positiva.

Aquest es calcula provant tota una sèrie de mostres negatives per a cada dil·lució, i es mira la lectura que donen. Després, amb eixos valors es calcula la mitjana i la desviació estàndard. Si el resultat és superior a la mitjana més tres vagades la desviació, serà positiva, si és inferior ´se negativa.

Dona positiu a partir de 1/200.

Cut Off = X ± 3DS

Monitoritzacío de la mostra:

Altra possibilitat dels anàlisis immunològics és la determinació de diferents isotipus de Ig, cos aque ens servirà per saber en quin estat de la malatia es troba l'individu. Podem determinar el isotipus de Ac que hi ha en la mostra, ja que habitualment es fan servir antiIg. Ex: ELISA indirecte.

Posem el Ag i el Ac que li pertoque per capturar-lo, si hi ha Ac fixats s'els uniran altres antiAc amb marcadors. Si el Ac fora IgM, i el antiAc és AntiIgM.

Es determina exclusivament la IgM, perquè es la que permet monitoritzar l'evolució d'una malaltia. Es pot fer per diferents mecanismes:

• Determinció d'Isotipus d'Ag: en primer lloc apareixen IgG. Determinant el isotipus majoritar es pot saber si el pasient es troba a la fase aguda o a la fase crònica.

• Determinar el títol d'Ac: fent dues proves consecutives i segons la segona siga més alta o mes baixa que la primera, podrem determinar si el pacient es troba a la fase aguda de la malaltia. Si les dues son iguals significa que es troba a la fase crònica. Es fà usant Ig anti IgG o Ig anti IgM.

• Determinació de Ag específics d'estat: Un microorganisme evoluciona dins de l'organisme, i porta com a conseqüència que la seua expressió antigènica varia, i determinats Ag que s'expersen en moments puntuals de la malaltia. Si es determina la presència o absència de Ac front aquestos Ag es pot caracteritzar en quina fase de la malaltia ens trobem.

Marcadors inespecífics de malalties: Són tècniques d'origen immunològic que indiquen un problema que genera resposta immunològica, són els marcadors inespecífics, els tres més importants són:

• Eosinofilia e hipereosinofilia: Increment de la quantitat d'eosinòfils en quantitat perifèrica. Normalment és entre 1-4 %, però en determinades ocasions la eosinofilia pot arribar fins al 80 %. No podem dir a que es deu la hipereosinofilis, s'augmenta en processos immunitaris mitjançant IgE. Encara que no podem determinar el procés, ens indica que són reaccions al·lèrgiques i processos infecciosos per helmints.

• Limfocitosi: Increment de la quantitat de linfòcits en sang perifèrica, pot indicar un problema infecciós, però no podem especificar.

• Gammaglobulinemia: Com que es produeixen Ig que són -proteïnes, es produeix un augment de -globulines. No podem especificar l'origen de l'increment de les -globulines.




TEMA 21. EXPLORACIÓ DE LA RESPOSTA HUMORAL

Descripció de les principals tècniques que permeten determinar la quantitat de Ig presents a la mostra. Aquestes tècniques són les més habituals en immunologia, i desde un punt de vista tècnic les proves són molt variades, tenen el mateix fonament, però es força el contacte entre Ag i Ac.

El que és diferent entre les tècniques és la forma de posar en evidència la unió, que serà diferent en cadascuna. Serveixen per Ac i Ag, depenent de l'inmunorreactiu del que partim.

La millor classificació és diferenciar les tècniques en 2 grups:

• Que no usen marcadors: Són aquelles en que la unió es veu a simple vista. Normalment es basen en la formació d'entramats molt grans de Ag i Ac. Són les més classiques, i el problema que tenen és la gran quantitat de immunoreactius que calen per produir els entramats. A més estan sotmeses a efectes de zona. Bàsicament són de precipitació, aglutinació i fixació del complement.

• Si usen marcadors: Són les tècniques que més s'usen pels seus avantatges. Primer, que no estan sotmeses a efectes de zona (no cal altes concentracions per a formar entramats). Tenen molta més sensibilitat, perquè eixe marcador amplifica la senyal. Calen molt menys reactius per fer les proves. Els marcadors que es fan servir són bàsicament 3:

• Enzims

• Isotops radioactius

• Marcadors fluorescents

Reaccions de precipitació

Basades en la capacitat dels Ac de precipitar Ag quan es troben en concentracions adequades. Aquestos precipitats es poden veure a simple vista o després de tenyir-los.

Fou una de les primeres tècniques que es feren servir per al diagnòstic immunològic, encara que tenen inconvenients que fan que no s'usen molt avuí en dia per al diagnòstic:

• Calen altes concentracions de Ag i Ac

• Són poc específiques i poc sensibles

• Efecte de zona: depenen massa de concentracions, ja que no precipiten a menys que es troben al seu punt d'equvalencia.

Però si que s'usen per a la determinació i la caracterització de diferents paràmetres del Ag o l'Ac, així com per a la seua purificació.

Les proves de precipitació es poden fer en:

• Fase líquida: Són les més antigues, i posen en contacte Ag i Ac en suspensió. En cas de reacció es forma un anell de precipitar al tub, per això se les anomena Ring Test, i estan en desús.

• Fase sòlida: Més complexes que les anteriors, però ofereixen més possibilitat. L'Ag o bé l'Ac es posen en una fase sòlida (agarosa) i van migrant fins que es troben i té lloc la reacció. Té diferents modalitats:

• Immunodifusió radial (IDR) o Test de Mancini: És una de les més usades, i permet quantificar el Ag o el Ac d'una mostra. Es prepara agar, i abans de que solidifique se li afegeix Ac. S'excaven pouets, i en ells es posa la suspensió de Ag a investigar. Aquest difondrà per l'agar on està barrejat l'Ac, i en el moment en que les concentracions siguen equivalents es produeix la precipitació en forma d'anell. Fent ús de patrons trobem la concentració de Ag del problema.

Si volem podem afegir Ag al preparat l'Agar i fer la determinació de Ac.

També podem tenyir amb qualsevol colorant de proteïnes com el blau de Conasie, negre amido, etc… tenyim l'agar o posem sobre aquest un paper de filtre de nitrocel·lulosa, les proteïnes es transferiran a aquest i després el tenyim.

• Immunodifusió doble (IDD) o test de Outcherlay: Es fa servir per determinar la relació existent entre diferents Ag i un Ac. Es preparen plaques de agar, però sense afegir Ac. A continuació s'excava un pouet on anirà l'Ac, i s'excaven dos pouets a la mateixa distància, on aniran les diferents mostra de Ag. L'Ac i l'Ag difonen, i al punt on es troben formaran una linia de precipitat. Es poden donar tres situacions:

• Situació d'identitat: Es forma una banda que es fusiona per a cada Ag. Els Ag tenen epítops comuns, que és el que reconeix el Ac dels Ag.

• Situació de no identitat: El Ac no reconeix cap epítop comú als Ag. Es forma una banda per a cada epítop, i no es fusionen, sino que es tallen.

• Identitat parcial: Els Ag tenen algun epítop en comú, però algun d'ells té altre epítop que és reconegut per l'Ac. L'espoló format correspon a l'epítop 2.

• Immunoelectroforesi (IEF): Es combinen l'electroforesi i la precipitació. Normalment es prepara una placa d'agar en que es posa el Ag, i es sotmet a electroforesi, de forma que el Ag és separat en les diferents proteïnes que el componen. Després s'excava un solc que atravessa tota la placa en la que posarem l'Ac, i ho deixem difondre. Al punt en que la concentració de Ag i Ac siga la adequada, es formarà un precipitat. Així s'aconsegueix estudiar la reacció Ag-Ac de cada component de l'Ag.

• Contraimmunoelectroforesi (CIEF): Es prepara una placa d'agar, però amb un pH que Ag i Ac tinguen càrregues diferents. S'excaven 2 pouets, i al primer es posa la mostra de Ag, i en l'altre la d'Ac, i es sotmet a electroforesi; com que les càrregues són diferents, migraran en sentit contrari, fins que es troben en un punt que és on es forma la banda de precipitació. Té el mateix fonament que la immunodifusió doble, però al forçar-la amb corrent elèctrica augmenta la sensibilitat.
  Aquestes proves es poden fer per diferència a la càrrega entre Ag i Ac. Els Ac neutralitzen la càrrega a pH alcalins, ja que tenen el PH més alt que els Ag.