GENÉTICA APLICADA

TEMA 1: CONCEPTOS BÁSICOS

• INGENIERÍA GENÉTICA

¿Qué es la ingeniería genética?, es un conjunto de métodos, técnicas y procedimientos destinados al aislamiento, caracterización, modificación, clonaje y expresión de ácidos nucleicos.

Su objetivo más profundo es el análisis, la modificación y la utilización de la información genética con el fin de descubrir las reglas del funcionamiento celular, e incluso, reconducir la vida de la célula hacia metas más programadas.

El objetivo principal es estudiar los ácidos nucleicos, su modificación y la utilización de la información que hay en ellos. Estudiar como funciona este material hereditario en las células, y después modificarlo para obtener los resultados que queramos.

La ingeniería genética nace a principios de los años 70, gracias al descubrimiento de las endonucleasas de restricción, y a las técnicas de secuenciación, de síntesis química y empleo de vectores de clonación.

Pese a todo esto surgen reticencias bélicas, científicas y en relación con la eugenesia.

• APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA.

1.- Investigación:

2.- Medicina: para el diagnóstico de enfermedades, para terapia génica.

3.- Biotecnología: implica el uso de organismos vivos (o partes de organismos vivos) para hacer productos o resolver problemas específicos. Tenemos técnicas tradicionales:

Y también hay técnicas actuales: como manipulación genética de organismos para:

4.- Ecología: se puede aplicar en:

• TÉCNICAS BÁSICAS

1.- Recolección y almacenamiento de muestras.

2.- Extracción de ácidos nucleicos.

3.- Separación de aann mediante electroforesis en gel.

4.- Modificación enzimática de aann (generalmente tratamiento con endonucleasas de restricción)

5.- Inmovilización del aann mediante transferencia a soportes sólidos.

6.- Preparación de sondas marcadas.

7.- Hibridación de las sondas con aann inmovilizados.

8.- Otras técnicas: PCR, secuenciación, clonación de ADN.

• EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

Las fuentes de ácidos nucleicos son variadas:

1.- ADN celular total (cromosómico), en bacterias, células, tejidos,…

2.- ADN plasmídico o extracromosómico.

3.- ADN de orgánulos: mitocondrias o cloroplastos. Primero se separa el orgánulo por centrifugación y después extraer el ADN.

4.- ADN viral.

5.- ARN.

Para hacer la extracción del ADN celular total el primer paso es la lisis celular, tiene que ser suave para que el ADN no se degrade. Se puede utilizar un detergente como el SDS, utilizando un alcali o hirviéndolo. Tenemos un extracto que tiene el ADN y más compuestos.

Para separar el ADN del resto de los compuestos se hace una centrifugación concreta y tenemos un extracto celular con ácidos nucleicos y también otros contaminantes. Después se hace un tratamiento enzimático con proteasas que degradan algunas proteínas contaminantes.

El siguiente paso es la extracción del ácido nucleico por solubilización diferencial. Se basa en que los ácidos nucleicos tienen propiedades diferentes a las de las proteínas. Tienen una carga negativa y son hidrofílicos. Las proteínas son más hidrofóbicas, por eso añadimos al extracto un solvente orgánico, que suele ser el fenol, mezclamos y en el fenol se quedan retenidas las proteínas porque son hidrofóbicas y los ácidos nucleicos se quedan en la fase acuosa, que se queda arriba. Debajo está la fase fenólica mas densa, donde están las proteínas y hay una interfase donde hay proteínas coaguladas.

Para la concentración de los ácidos nucleicos se añaden sales y etanol absoluto. El ADN precipita y forma una maraña blanquecina. Con una varilla de vidrio se saca el ADN que tiene mucha afinidad por el vidrio. Se pone en un tubo con agua y se vuelve a resuspender.

La extracción del ARN es prácticamente igual.

Una vez extraídos los ácidos nucleicos se hace la caracterización de estos. Nos fijamos en tres cosas:

1.- En su concentración.

2.- En su pureza.

3.- En su tamaño.

Para la medida de la concentración se mide la absorbancia a 260 nm. La absorbancia da idea de su concentración. La relación es que a una absorbancia a 260 nm que sea igual a 1 le corresponde una cantidad de ADN de cadena doble de 50 µg/ml. Si es ADN de cadena simple o ARN este valor varía.

Para la medida de la pureza se mide la absorbancia a 260 nm y a 280 nm, y se calcula el cociente entre las dos. Para un valor entre 1,8 y 2 es una muestra pura o con pocos contaminantes. Para valores menores de 1,8 indica que la muestra está contaminada por proteínas. Y para valore mayores que 2 quiere decir que la muestra está contaminada por ARN.

La absorbancia a 280 nm da una idea de las cantidades de proteínas que hay en la muestra. A una relación de 1,5 le corresponde una contaminación de proteínas del 30%.

Para medir el tamaño, se mide con la electroforesis.

• ELECTROFORESIS EN GEL.

Las moléculas de ácidos nucleicos tienen carga negativa, y si se someten a un campo eléctrico se mueven del polo negativo al positivo, y este movimiento depende de dos factores:

1.- La forma de la molécula.

2.- La relación carga/masa.

En solución todas las moléculas de ADN tienen la misma forma. La relación carga/masa también es equivalente entre todas las moléculas. Se ponen moléculas diferentes en solución y se mueven todas igual y no se pueden separar en tamaños.

Necesitamos un factor que nos permita que las moléculas se separen en función a su tamaño, o sea, una matriz. Esta puede ser de Acrilamida o de Agarosa.

La acrilamida nos permite separar moléculas de ácidos nucleicos con pesos muy parecidos. La agarosa tiene mayor resolución para moléculas más grandes.

En una matriz el ADN migra en función de su forma, su relación carga/masa y de su tamaño.

La matriz de agarosa está formada por polímeros de arabinosa. Un vez que se gelifica se van quedando poros, y por esos poros es por donde migra el ADN. Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes. Para poder ver el ADN hay que teñir el gel con un colorante intercalar, es una sustancia que se mete entre las dos hebras de ácidos nucleicos (por eso son altamente cancerígenos). Si no hay ácidos nucleicos no hay colorante. Estos colorantes se pueden excitar con luz ultravioleta y emiten fluorescencia.

Para averiguar el tamaño de la molécula hay que utilizar un marcador de peso molecular, que son soluciones de ADN lineal de cadena doble que tienen tamaño conocido.

Hay diferentes factores que afectan a la migración del ADN:

• APLICACIÓNES DE LA ELECTROFORESIS EN GEL.

1.- Aplicación analítica: para calcular el tamaño de ADN por comparación con un marcador de peso molecular hay que correr el marcador junto con el ADN, se representa el tamaño en relación con la distancia recorrida del marcador, y después se compara con las distancias. Si se representa el logaritmo del tamaño frente al tiempo sale una recta.

2.- Averiguar la calidad de la muestra de ADN. Si está degradada, si está contaminada con ARN, como de concentrada está, etc.

3.- Estudio de interacciones entre moléculas de ácidos nucleicos o entre ácidos nucleicos y proteínas. Si hay interacción de la proteína con el ADN se pega a él y el ADN ya no migra igual, migrará mucho menos que las moléculas que no están unidas a proteínas, es el análisis de retardo en gel de agarosa, que es para estudiar este tipo de interacciones.

4.- Aislamiento de moléculas de tamaño determinado. Queremos separar de un plásmido un fragmento de este que nos interesa, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina. Cortamos los fragmentos y lo tenemos todo mezclado en un tubo de ensayo, hacemos electroforesis y cortamos el fragmento del gel que nos interesa y hacemos una solución.

TEMA 2: RESTRICCIÓN Y LIGAMIENTO DEL ADN IN VITRO

• INTRODUCCIÓN

Hasta los años 70 la fragmentación de los ácidos nucleicos era inespecífica, o sea, un corte al azar de forma no precisa y no reproducible. La fragmentación al azar no sirve prácticamente para nada.

Entre la fragmentación inespecífica podemos encontrar métodos físicos como pasar el ADN por una jeringa con una aguja muy fina. También hay procedimientos químicos, por ejemplo sometiendo al ADN a pH ácido, primero se rompe el enlace entre la base y se van perdiendo bases al azar, normalmente donde hay purinas (depurinación), si tarda mucho se rompe el enlace fosfodiester. También puede ser mediante enzimas, como las nucleasas que degradan ácidos nucleicos de forma inespecífica.

A partir de los años 70 se descubre la fragmentación específica mediante Endonucleasas de Restricción, que son enzimas capaces de cortar una molécula de ADN de cadena doble por sitios específicos, y que fueron descubiertas gracias al fenómeno de restricción controlada por el hospedador.

La restricción controlada por el hospedador se basa en que las bacterias han desarrollado un sistema de defensa frente a la entrada de ADN exógeno, y este sistema de defensa está basado en dos componentes:

1.- Componente 1: son enzimas que reconocen secuencias específicas en el ADN y las cortan. Por lo que pueden destruir el ADN exógeno.

2.- Componente 2: para asegurar que sólo el ADN viral será degradado, modifican el ADN propio en los sitios reconocidos por su enzima de restricción, de manera que al reconocerlos no los degradará (suele ser mediante una metilación). Es una manera de proteger el ADN propio.

La restricción controlada por el hospedador es un fenómeno que fue descubierto por Werner Arber al estudiar la capacidad del fago  para infectar distintas cepas de E. coli. Cada cepa tiene su propia endonucleasa de restricción que degrada cualquier molécula de ADN que no tenga el patrón de modificación de la misma. La modificación se lleva a cabo mediante la metilación del ADN.

• RESTRICCIÓN DEL ADN IN VITRO

• Sistemas de modificación - restricción (M - R).

¿Qué son?

Las endonucleasas de restricción son enzimas nucleolíticas que catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiester internos en las dos hebras de una molécula de ADN bicatenario, mayoritariamente por sitios específicos (dianas o sitios de restricción), y que en la naturaleza se encuentran formando parte de los sistemas de restricción - modificación bacterianos.

Estos sistemas desempeñan en la célula bacteriana una función de protección genética, dirigida a impedir el establecimiento en su interior de material genético exógeno que pudiera codificar productos capaces de alterar la vida celular. Algunos sistemas R-M están codificados en genes cromosómicos, otros en plásmidos e incluso en bacteriófagos.

¿Cómo funcionan?

Básicamente, el sistema incorpora dos actividades enzimáticas: una metilasa y una endonucleasa, ambas con una misma especificidad de secuencia. El sitio o diana de reconocimiento es una corta secuencia de pares de bases, constituido por lo tanto por las dos hebras. Ambas actividades van a reconocer la misma secuencia en su ADN sustrato, luego actuará una u otra en función del estado de metilación de la diana:

La metilación es una forma de señalizar el material genético de la bacteria y evitar su rotura por el propio sistema de restricción. Cuando el ADN cromosómico es replicado, las dianas de restricción de las moléculas hijas están metiladas sólo en la hebra parental (dianas hemimetiladas); en ese estado se encuentran protegidas contra la nucleasa. Cuando estos sitios son reconocidos por el sistema R-M, la nucleasa no actúa, pero sí la metilasa que modifica la hebra aún no metilada para producir una diana ya metilada en ambas hebras. En los casos de invasión por ADN exógeno, por ejemplo tras la infección por un bacteriófago, el sistema R-M lo investigará y reconocerá en él una o varias dianas específicas del sistema, que normalmente no estarán metiladas en ninguna de las dos hebras, entonces la acción de la nucleasa se impone a la metilasa y el ADN del fago resultará degradado.

La presencia de un sistema R-M es muy normal entre bacterias; incluso no es raro que una estirpe posea más de uno. Sin embargo, algunos bacteriófagos han desarrollado mecanismos para evitar las defensas bacterianas, tales como metilasas con la misma especificidad que el hospedador, inhibidores de la endonucleasa celular o eliminación de su genoma de los sitios reconocidos por el sistema R-M bacteriano. Además, en raras ocasiones, el ADN invasor puede escapar a la acción de la restricción celular por fallo del sistema. En estos casos, el ADN extraño resulta metilado en las dianas específicas de la célula y, a partir de ese momento, tanto él como las copias que resulten de su replicación se encontrarán modificados según el patrón de metilación propio de la célula y serán capaces de sobrevivir en ella. El sistema R-M es específico de estirpe y por ello no impide la transferencia de ADN entre células de la misma estirpe, por ejemplo mediante conjugación; en este caso, el ADN transferido vendrá metilado según el mismo patrón que existe en la célula receptora.

• Tipos:

Hoy en día se conoce un gran número de sistemas R-M, que, según una clasificación probablemente provisional, se suele agrupar en tres tipos:

• La subunidad R, responsable de la restricción.

• La subunidad M, que cataliza la metilación.

• La subunidad S, que marca la especificidad de sustrato y es la encargada de reconocer la secuencia específica de la diana.

El agregado multinumérico cataliza tanto la metilación como la restricción. Requiere iones Mg2+, ATP, y S-adenosilmetionina como cofactores. El sitio de reconocimiento de estos sistemas consiste en una secuencia específica de 3 pb, separada una cierta distancia de otra secuencia específica de 4 pb; la secuencia de la región central es intranscendente, pero su longitud es importante porque hace que las regiones específicas aparezcan en el mismo costado de la doble hélice del ADN, lo que nos dice que es una diana bipartida y asimetrica. El sitio de la rotura catalizada por su actividad de restricción se localiza a más de 1000 pb del sitio de reconocimiento y no implica ninguna secuencia específica, esta distancia implica que disminuya mucho el interés por su utilización.

• Los sistemas R-M tipo II; son los más comunes en el mundo bacteriano. Su estructura proteica es sencilla. Quizá lo más interesante de este tipo de sistema es que las actividades de metilación y restricción se localizan en entidades enzimáticas separadas. Las dos actividades enzimáticas constituyentes de la enorme mayoría de los sistemas tipo II actúan en la misma diana de reconocimiento, bien metilando ciertas bases, bien cortando ciertos enlaces. En este caso, la rotura se da por sitios específicos y definidos, lo que permite su utilización en trabajos con fines analíticos y en el diseño de una gran variedad de experimentos. En este caso como vemos la nucleasa y la metilasa están separadas, por lo tanto las reacciones están también separadas. Su diana es simétrica (palindrómica), y el sitio de corte es en la misma diana.

• Los sistemas R-M tipo III; son bastante raros. Presentan dos tipos de subunidades, la R, responsable de la restricción, y la MS, responsable tanto de la metilación como del reconocimiento del sitio específico de acción. Ambas actividades requieren Mg2+, ATP y S-adenosilmetionina. La metilación se da en residuos de adenina en el propio sitio de reconocimiento, pero la restricción se produce fuera de este, a unos 24 o 26 pb. Esto reduce mucho su aplicación para el análisis y manipulación de ADN.

• Otros sistemas que cortan o mutilan el ADN.

• Sistemas de restricción dependientes de metilación; cortan si la secuencia está metilada.

• Sistemas de modificación del ADN; enzimas que mutilan determinadas secuencias diana.

• Sistemas M-R tipo II.

1.- Nomenclatura.

Son tres letras, que corresponden, la primera, a la inicial del género y las otras dos a las iniciales de la especie bacteriana de donde se ha aislado. Una cuarta letra, en algunos casos, que identifica la estirpe o el tipo celular origen de la actividad. Un número, en romano, que indica el número de orden de su aislamiento a partir de una cepa que posea varios sistemas R-M. Las tres primeras letras van en cursiva. En caso de ambigüedad, si es una enzima de modificación se coloca delante una M·, y si es una enzima de restricción una R·.

EcoRI

M·EcoRI

R·EcoRI

2.- Sitios diana y frecuencia de distribución.

El sustrato de estas actividades es un dsADN: catalizan la hidrólisis simultánea de las dos hebras de un ADN bicatenario y no actúan sobre estructuras en monohebra. La diana o sitio de reconocimiento de estas endonucleasas está constituida por una secuencia específica de algunos pares de bases, normalmente de cuatro a ocho.

La complejidad del sitio depende de su longitud y, en teoría, la probabilidad de que una cierta diana esté presente en la secuencia de un ADN varía en función inversa a aquélla: la probabilidad de que en una determinada posición aparezca una determinada base es de 1 en 4; la probabilidad de que se dé una secuencia de cuatro pares de bases es (1/4)4, o sea, 1/256; y así sucesivamente. Aunque la realidad siempre se desviará de estos números, es importante tenerlos en cuenta a la hora de plantear un experimento: si se digiere un ADN largo con una enzima de restricción que reconoce un sitio de seis pares de bases se obtendrán fragmentos de un tamaño que varía alrededor de 4000 pb, mientras que si se usa una enzima que rompe por sitios de ocho pares de bases, la media de los fragmentos producidos será de más de 65 kb. Para estos cálculos conviene tener en cuenta el contenido en pares de GC de la diana y del ADN que se quiere fragmentar (si se conoce); en la mayoría de los casos, este último es menor del 50%, por lo que la probabilidad de que contenga un sitio rico en GC, es menor que la teórica.

La estructura del sitio presenta simetría rotacional. Salvo raras excepciones, las dianas de las endonucleasas del tipo II, son simétricas, presentan secuencias palindrómicas en ambas hebras. Esta característica estructural es muy peculiar; podría estar relacionada con la capacidad de las secuencias palidrómicas para formar estructuras especiales (cruciformes) que fueran la base del reconocimiento por parte de estas endonucleasas, aunque, de momento, no se dispone de ninguna explicación de peso para este hecho.

3.- Tipos de extremos tras el corte con endonucleasas de restricción.

Los puntos de rotura concretos son dos enlaces fosfoéster, localizados uno en cada hebra, que se encuentran dispuestos simétricamente según el mismo eje que marca la simetría de la secuencia de las hebras en la diana. Quizá esto es el reflejo de todo un mecanismo de reconocimiento y rotura basado en la simetría del sitio. La hidrólisis de los enlaces fosfoéster suele dejar al resto de fosfato esterificando al OH en posición 5´ de una desoxirribosa y un OH libre en la posición 3´ de la desoxirribosa contigua.

Así como el corte es simétrico podemos encontrar extremos romos, extremos cohesivos 5´ prominentes, y extremos cohesivos 3´ prominentes, según la estructura de la diana.

4.- Isoesquizómeros.

Dos o varios enzimas de modificación-restricción son isoesquizómeros cuando reconocen la misma secuencia diana. Estos pueden cortar en la misma posición o en posiciones diferentes y en ambos casos siguen siendo isoesquizómeros.

5.- Actividad estrella.

Es la actividad que presentan algunas enzimas de tipo II en condiciones no óptimas (pH, fuerza iónica, presencia de contaminantes), caracterizada por un descenso en la especificad del sitio de reconocimiento.

• Aplicaciones de las endonucleasas de restricción tipo II.

1.- Corte del ADN in vitro en sitios específicos.

Se hace una reacción con los siguientes componentes:

• ADN a digerir.

• Enzima de restricción.

• Tampón (pH).

• Iones Mg+2 (cofactor).

• Sales.

• Agentes reductores.

• Otros componentes como BSA o detergentes.

Se incuba a temperatura óptima (normalmente 37ºC) y se detiene la reacción. Para cortar el ADN hacemos una digestión parcial en contraposición a la digestión total, si las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción no son las óptimas no se producirá el corte en todas las dianas existentes, efecto conocido como digestión parcial, y se consigue hacer jugando con la concentración de enzimas y con el tiempo de reacción. También haciendo una digestión doble en contraposición a una simple, se produce la digestión empleando dos o más enzimas al mismo tiempo si es posible, y si no es posible se hace en reacciones secuenciales. Si las dos actúan en condiciones iguales se pueden utilizar conjuntamente, sino se trabaja con una y después con otra.

2.- Elaboración de mapas de restricción.

Un mapa de restricción es una representación gráfica de las posiciones o de los sitios de corte para diferentes endonucleasas de restricción en una misma molécula de ADN. Se pueden elaborar:

• Con digestiones parciales: se marcan los extremos 5´ con fósforo radiactivo (se elimina el fósforo en 5´ y se añade fósforo radiactivo). Queremos una molécula marcada en un solo extremo, para esto digerimos con una endonucleasa de restricción que genere fragmentos de diferentes tamaños. Se generan extremos 5´ sin marcar. Se hace el mapa con todos los fragmentos y después pegamos los resultados, esto si tienen diferentes tamaño, si tienen el mismo tamaño no los podemos separar. Se hace una digestión parcial de cada uno de los fragmentos con nucleasas de restricción a localizar, después se hace una electroforesis. El resultado de está se ve mediante autorradiográfia. Si se provoca solo un corte obtenemos una parte marcada y la otra no. Si se producen varios cortes solo veremos los bordes correspondientes a los 5´ marcados.

• Con digestión doble: se hacen las digestiones simples totales por separado y luego se hacen las digestiones dobles. No hace falta marcar porque los fragmentos dicen como es el enzima de restricción. Se hacen digestiones simples de cada uno y después se hace la doble. Después se corren todas en un gel.

3.- RFLP´s.

Es el polimorfismo para la longitud de los fragmentos de restricción. Hacen referencia a variaciones existentes en los individuos para la longitud de los fragmentos de restricción. Se pueden utilizar para el diagnostico de enfermedades, identificación de individuos y otras aplicaciones.

Tenemos ADN de individuos diferentes y lo sometemos a digestión con enzimas de restricción. El individuo 1 tiene dos dianas y como es diploide, el otro también tiene las mismas dianas. El 2 también es diploide y también tiene las mismas dianas, pero en una de las cadenas tiene otra diana para el mismo enzima. Lo corremos en un gel y el individuo 1 sale una banda, el individuo 2 tiene 3. No todos los individuos en una especie tienen el mismo patrón de bandas.

• Aplicaciones de los sistemas de modificación de tipo II.

1.- Protección de secuencias diana para endonucleasas de restricción.

Las enzimas van por parejas, una corta la secuencia no metilada y el otro metila la secuencia no metilada. Podemos proteger una secuencia diana, para ello se metila con enzimas de modificación.

2.- Crear sitios de corte para enzimas de restricción dependientes de modificación o de metilación.

Utilizando enzimas de modificación tipo II podemos crear un patrón de modificación en una determinada sección de ADN que no puede ser reconocido por una endonucleasa de restricción y esta corta al estar metilada (son otras endonucleasas diferentes a las anteriormente vistas).

• LIGAMIENTO DEL ADN IN VITRO

Para pegar el ADN se utilizan las ligasas de ADN que catalizan la formación de un enlace fosfoéster entre un extremo 5´P y otro 3´OH.

Hay dos ligasas que se utilizan fundamentalmente, la ligasa de T4 y la ligasa de E. coli, son capaces de unir moléculas de ADN con extremos cohesivos, pero solo la ligasa de T4 es capaz de unir moléculas con extremos romos y cohesivos, esta necesita ATP como cofactor y la ligasa de E. coli sólo une extremos cohesivos y necesita NAD como cofactor.

En extremos romos para que se produzca el ligamiento necesitamos un extremo 3´OH y otro 5´P.

En extremos cohesivos compatibles se pueden autoaparear y la ligasa aprovechando esto cataliza el enlace.

En extremos cohesivos incompatibles no podrían unirse en principio. En ocasiones se pueden unir mediante una técnica. Si tienen algún nucleótido compatible se pueden rellenar los que no sean compatibles con otros nucleótidos compatibles. Incubando cada molécula de ADN con los nucleótidos que necesita se hacen compatibles y se pueden ligar.

TEMA 3: MODIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN VITRO

• TRANSFERASA TERMINAL

Es un dímero de 80 + 26 kDa.

1.- Como funciona:

Utiliza como sustrato extremos 3´OH de moléculas de ADN, tanto de cadena simple como doble, pero es mucho más eficiente el de cadena simple.

Este enzima adiciona desoxirribonucleótidos del medio al extremo 3´OH de una molécula de ADN. Esta adicción se produce sin necesidad de molde. La secuencia que se va añadiendo depende de los nucleótidos que haya en el medio.

Hay diferentes técnicas para hacer creer al enzima que la cadena doble de ADN es simple:

• Utilizar una exonucleasa que digiera el ADN en dirección 5´-3´. Hay varios tipos de exonucleasas. Después de la acción de la enzima tenemos ADN doble pero con extremos de cadena simple y ahora la transferasa funciona con mas eficiencia.

• Utilizar condiciones ligeramente desnaturalizantes. La molécula de ADN solo se desnaturaliza en los extremos. Después de esto tenemos la cadena doble con los extremos separados (cadena simple).

2.- Aplicaciones:

Creación de regiones (colas) de homopolímeros en fragmentos de ADN que van a ser ligados entre sí. Este fue el método seguido para la construcción de las primeras moléculas de ADN recombinante artificial.

Marcaje de los extremos 3´ de un ADN por incorporación de dNTPs, ddNTPs o NTPs marcados.

• POLI-A POLIMERASA

Es un monómero de 58 kDa.

1.- Como funciona:

Utiliza como sustrato únicamente ARN y cataliza la adicción de ATP al extremo 3´OH de molécula de ARN sin necesidad de molde. Se usa para generar moléculas de ARN con colas de poli-A.

Sobre un buen sustrato, es capaz de incorporar hasta 2000 restos de AMP.

2.- Aplicaciones:

Marcaje de moléculas de ARN por adición de una cola de nucleótidos marcados.

Creación de una cola poli(A) en moléculas de ARN para permitir el cebado con oligo(dT) con el fin de sintetizar ADNc.

• FOSFATASA (FOSFOMONOESTERASA)

1.- Como funciona:

Utiliza como sustrato tanto moléculas de ADN y de ARN, hidroliza los grupos fosfato tanto en 3´ como en 5´. Lo normal es en 5´. En condiciones normales si actúa la fosfatasa, elimina los grupos fosfato excepto si tiene una mella en el interior. En condiciones desnaturalizantes si quitamos los de la mella.

2.- Aplicaciones:

Se utiliza para evitar autoapareamientos no deseados en moléculas de ADN. También para marcaje de moléculas en 5´, se quita el fosfato 5´ y se pone marcado con la quinasa.

• QUINASA

1.- Como funciona:

Usa como sustrato ARN o ADN de cadena simple o de cadena doble. Fosforila extremos 5´OH prominentes en caso de cadena doble en ADN y 5´OH de cadena simple de ARN.

2- Aplicaciones:

Se usa para marcaje de extremos 5´.

TEMA 4: SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN VITRO

• DEGRADACIÓN

1.- Degradación química.

A pH muy bajos (1 ó menos) se produce una hidrólisis de los grupos fosfodiéster, tanto en la molécula de ADN como en la de ARN, acompañada de la ruptura de enlaces N-glucosílicos entre las bases y azúcares. Este tipo de degradación se utiliza cuando se quiere determinar la composición de bases de un ácido nucleico.

A pH 4 aproximadamente se produce una depurinización por ruptura de los enlaces N-glucosílicos entre el azúcar y las purinas, afectando más a la molécula de ADN que a la de ARN. A pH neutro se invierte la tendencia y el ADN se hace unas 200 veces más resistente a la hidrólisis que el ARN; a pH aún más alto el ADN es prácticamente resistente a la hidrólisis, pero no así el ARN, que a pH 11 y 37ºC se hidroliza totalmente en pocos minutos a una mezcla de nucleótidos 3´ y 2´. El ADN depurinizado también es sensible a pH elevado y se rompe por el enlace fosfodiéster 5´ correspondiente a la desoxirribosa del lugar donde falte la purina.

2.- Degradación enzimática.

Las enzimas que degradan los ácidos nucleicos se denominan en general nucleasas y pueden ser de dos tipos dependiendo de si actúan a partir de los extremos (exonucleasas) o dentro de la cadena (endonucleasas).

El sustrato puede ser ADN, ARN ó ambos, ya sean de cadena simple ó cadena doble. Para las exonucleasas se necesitan extremos libres, mientras que para las endonucleasas no son necesarios. Y el punto de hidrólisis es en extremos 5´-P y en extremos 3´-P.

3.- Ejemplos de degradación enzimática:

• ADNasa I (endonucleasa I de E. coli). Es una endonucleasa que hidroliza ADN de cadena simple y doble. Prefiere cortar detrás de pirimidín nucleótidos. En presencia de Mg+2 ataca al azar cualquiera de las dos hebras y produce mellas. En presencia de Mn+2 corta ambas hebras, aproximadamente, en el mismo lugar.

• Exonucleasa III de E. coli. Actúa sobre extremos 3´ OH de AND de hebras dobles, lineares o circulares. No degrada ADN de hebra sencilla.

• Nucleasa S1. Degrada ADN de hebra sencilla y ARN (es exo y endo). En grandes dosis también degrada ADN de hebra doble. Requiere Zn+2 y actúa a pH bajo (4), lo que es un inconveniente, ya que a este pH hay depurinación de las bases de ADN.

• Nucleasa BAL31. Es preferentemente una exonucleasa que elimina mononucleótidos a partir de extremos 3´OH, pero también es endonucleasa, por lo que elimina las hebras sencillas creadas por la acción exonucleásica. La reacción es totalmente dependiente de calcio por lo que se puede controlar el grado de degradación eliminando éste, a tiempos determinados, con agentes quelantes como el EGTA. Degrada bastante más rápido secuencias ricas en AT que en CG. También degrada con poca eficiencia ARN. Dado que produce terminales de distintos tamaños, algunos de hebra sencilla, será necesario reparar la molécula antes de su posterior utilización con alguna polimerasa que rellene regiones de hebra sencilla.

• SÍNTESIS

1.- Síntesis química.

Tiene dos utilidades, una es la síntesis de oligonucleótidos. Y la segunda utilidad es el desarrollo e estrategias para la síntesis de moléculas largas.

2.- Síntesis enzimática.

Es llevada a cabo por enzimas conocidas como Polimerasas. Pueden ser de dos tipos:

• ADN-polimerasas: sintetizan ADN a partir de un molde (generalmente ADN) y un cebador.

• ARN-polimerasas: sintetizan ARN a partir de una secuencia promotora en el ADN.

3.- Ejemplos de síntesis enzimática:

• ADN polimerasa I de E. coli. Consta de una cadena polipeptídica que funciona como polimerasa y exonucleasa en la dirección 5´-3´ y exonucleasa 3´-5´. También tiene actividad de ARNasa H, que es esencial para la viabilidad de la enzima pero no se utiliza mucho in vitro. Esta polimerasa se emplea en le proceso de marcaje radiactivo denominado “traslado de la mella”, que es uno de los procesos más comunes de sustituir un ADN por su copia radiactiva. También se pueden utilizar marcajes no radiactivos empleando biotina o el hapteno esteroideo digoxigenina (DIG) en alguno de los precursores. El producto se detecta por luminiscencia o color. El procedimiento se basa en el tratamiento de un ADN de hebra doble con una pequeña cantidad de ADNasa I para que se produzcan algunas mellas al azar que sirvan de enganche a la ADN pol I. en presencia de magnesio y deoxinucleótidos trifosfato (dNTF), la ADN polimerasa va digiriendo nucleótidos en el sentido 5´ 3´ (exonucleasa) y sustituyéndolos por los dNTF del medio. Uno o más de estos dNTF pueden ser radiactivos, con lo que marcaríamos el ADN sintetizado, facilitando su utilización como “sonda” en experimentos de hibridación de ácidos nucleicos.

• Fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Representa la holoenzima a la que se le ha eliminado la actividad exonucleasa 5´-3´. La actividad exonucleásica de la holoenzima es muy activa y muchas veces elimina los fosfatos 5´ de los extremos de moléculas de ADN que se pensaban utilizar como sustratos para uniones con la enzima ligasa, la cual no podrá utilizarlos sin el fosfato 5´. Por otra parte, esta actividad exonucleásica se puede eliminar con relativa facilidad por tratamiento proteolítico de la holoenzima sin afectar la actividad polimerasa. Sintetiza ADN en huecos o terminales de hebra sencilla. Una de las reacciones más utilizadas con esta enzima es la de extensión del iniciador o iniciación al azar; el método utiliza ADN circular o lineal de banda doble o sencilla, y consiste en realizar el ADN mezclado con un exceso molar de moléculas iniciadoras o cebadores. La reacción, en este caso, se lleva a cabo a pH 6´6 porque a este pH la actividad exonucleasa 3´ 5´ es muy débil y no se corre peligro de degradar los oligonucleótidos utilizados como iniciadores o cebadores. La enzima Klenow se utiliza también en la síntesis de la segunda hebra del ADNc (ADN copia), en secuenciación del ADN por el método de terminación de cadena por di-deoxinucleótidos y en experimentos de mutagénesis dirigida.

• ADN polimerasa de T7. La primera se induce en E. coli después de la infección del fago T7. En realidad, es un complejo formado por dos proteínas íntimamente unidas: la proteína del gen 5 del bacteriófago y la tiorredoxina del huésped. Es la polimerasa más eficiente de todas las conocidas y la que sintetiza cadenas más largas. Posee actividades 5´-3´ y 3´-5´ (correctora de errores), al ser más potente que la de otras polimerasas, pone en peligro la estabilidad de los cebadores que en muchos casos son sintéticos y no aparean con perfección total. La actividad exonucleasa 3´-5´ radica en el extremo amino de la molécula y se puede inactivar incubando la enzima durante varias horas con un agente reductor (oxígeno molecular) a concentraciones bajas del ión de hierro. La enzima sin actividad exonucleásica se denomina secuenasa. También se obtiene secuenasa por ingeniería genética, eliminando del gen los nucleótidos responsables de la actividad exonucleásica.

• Taq polimerasa. Es termoestable, y aunque originariamente se aislaba de Thermus aquaticus, hoy se sintetiza por ingeniería genética. Su temperatura óptima es entre 75-80ºC; a 60ºC retiene sólo la mitad de su actividad, y a 37ºC, una décima parte. Requiere Mg+2 y posee actividad exonucleásica 5´-3´, pero carece de la exonucleásica 3´-5´ correctora de errores. Se utiliza sobre todo para amplificar secuencias en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Su molde es ADN de cadena sencilla y el cebador un extremo 3´- OH libre.

• Otras polimerasas termoestables:

Nombre	3´5´ Exo	Origen	Propiedades
Taq	No	Thermus aquaticus	Vida media a 95ºC 100 min. Alta tasa de error (10-4 a 2·10-5)
Pfu	Si	Pyrococcus furiosus	Baja tasa de error (1-2 · 10-6 por pb)
Vent (Tli)	Si	Thermococcus litoralis	Vida media a 95ºC aprox. 7 horas

• Transcriptasa inversa. Sintetiza ADN utilizando como molde ARN. También necesita un cebador que provea un extremo 3´OH donde engancharse para iniciar la síntesis. Carece de actividad exonucleasa 3´-5´, que es la correctora de errores en otras polimerasas, por lo que acumula los fallos que produce; incorpora una base equivocada cada 500 bases aproximadamente. Posee actividad ARNasa H que puede degradar el ARN en forma de híbrido ARN-ADN. Durante mucho tiempo se empleó la transcripatasa inversa aislada del virus que produce la mieloblastosis en las aves, pero su poderosa actividad ARNasa interfería muchas veces con la estabilidad del ARN molde antes de que se llegara a completar la copia del mismo. Actualmente se utiliza preferentemente la transcriptasa inversa obtenida por ingeniería genética a partir del gen clonado del virus Molones que produce la leucemia de ratón; esta última enzima posee una ARNasa H mucho más débil.

• ARN polimerasas. Enzimas que reconocen secuencias promotoras específicas e inician la síntesis de ARN a partir de las mismas utilizando como molde la molécula de ADN. Sirven para la síntesis de sondas de ARN. Hay de tipo SP6, T3 y T7.

TEMA 5: IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS

Es la detección de una secuencia CONCRETA entre un grupo de moléculas de ácidos nucleicos con secuencias diversas.

• MATERIAL DE PARTIDA

1.- ADN o ARN en solución.

2.- Colonias (en bacterias) o calvas (en fagos).

3.- Cromosomas metafásicos.

4.- Geles de agarosa.

5.- ARN tejidos enteros.

6.- ARN en cortes.

En función de cómo esté el material de partida hay que hacer una cosa u otra.

• PASOS A SEGUIR

1.- Trasnferencia de ácidos nucleicos de cadena simple a soporte sólido, como una membrana de nailon (cuando sea necesario).

2.- Obtención de sondas, que son moléculas de ácidos nucleicos con secuencia complementaria a la que estamos buscando.

3.- Hibridación.

4.- Revelado, que pone de manifiesto la presencia o la ausencia de la sonda. Si la sección de interés está pegada al filtro detectaremos la sonda porque se pega al filtro.

• TRANSFERENCIA A SOPORTE SÓLIDO

1.- ADN en forma de cadena simple. Para que se peguen a la sonda no es necesario ningún tratamiento. Si los ácidos nucleicos están en forma de cadena doble se da una desnaturalización que puede ser antes o después de la transferencia, para que al final tengamos ácidos nucleicos en cadena simple.

2.- ADN en forma de cadena doble. Hay que desnaturalizar antes de la transferencia o después de la transferencia.

3.- ADN o ARN en solución. Hay dos métodos, en ambos la desnaturalización se hace antes de la transferencia. Los dos métodos son:

• Método Dot-blot; poner gotas en la membrana de nailon.

• Método Slot-blot; se utilizan unos aparatos con unos agujeros en forma de malla. Tiene una cámara de vacío, encima la membrana de nailon y encima la tapadera con los agujeros, por ahí se echa la solución en la membrana de nailon y tenemos el ADN justo en las mallas.

4.- ADN o ARN en bacterias (colonias) o fagos (calvas). Se hace la desnaturalización después de la transferencia. Se coge la membrana y se pone encima de la placa de Petri con las colonias o las calvas. Cuando pasan unos cinco minutos se levanta con unas pinzas la membrana de nailon y en esta se han pegado las colonias o las calvas en la misma posición que están en la placa. Esta membrana ahora se lisa colocándola en una solución de lisis y las bacterias o fagos se lisan y el ADN sale, pero se queda en la misma posición que está la colonia o la calva. La misma lisis se utiliza para desnaturalizar el ácido nucleico.

5.- ADN en cromosomas metafásicos. En este caso la desnaturalización se hace después de la transferencia.

6.- ADN o ARN en geles de agarosa. La desnaturalización se hace antes de la transferencia. Una vez que el ADN está en el gel de agarosa se puede clasificar en diferentes tipos dependiendo del ácido nucleico de partida:

• Si es ADN la técnica es Southern-blot.

• Si es ARN la técnica de transferencia es Northern-blot.

• Si son proteínas la técnica es Westhern-blot.

En función de los mecanismos para que el ácido nucleico pase a la membrana de nailon se diferencian:

• Transferencia por capilaridad; se coge un recipiente y se coloca un soporte dentro para que nos mantenga en alto lo que vamos a meter. Encima del soporte metemos un papel de filtro que llegue hasta el fondo del contenedor. Encima del papel de filtro ponemos el gel de agarosa con el ácido nucleico en cadena simple. Encima la membrana de nailon. Ponemos papel de filtro encima, una columna, encima papeles absorbentes, encima un soporte de vidrio y encima una pesa de un kilo. Los papeles absorbentes son para aumentar la capilaridad. Echamos al recipiente la solución de transferencia. Esta solución sube hasta los papeles y el ácido nucleico pasa a la membrana arrastrado por la solución mediante capilaridad. El ácido nucleico se queda en la membrana porque llega a cargas positivas y ya no sube más.

• b)Transferencia por vacío; partimos de una cámara de vacío con dos salidas, una que se conecta a una bomba de vacío y la otra a un tubo donde se desaguan las soluciones. La parte de arriba está cerrada con material poroso, encima de este material poroso ponemos la membrana de nailon, encima el gel de agarosa con el ácido nucleico. Sellando todo lo que sobre se pone una máscara impermeable. Todo lo de arriba se rellena con la solución de transferencia. Ahora hacemos que el líquido pase a través del gel y por esto el ácido nucleico va del gel a la membrana de nailon.

• Electrotransferencia; con un aparato llamado cassette, parecido a una carpeta, encima ponemos dos hojas de material poroso. Después ponemos dos hojas de papel de filtro. A un lado se pone el gel de agarosa con el ADN y en el otro lado la membrana de nailon. Después se cierra el cassette. Necesitamos una cubeta vertical de electroforesis. Metemos el cassette y rellenamos la cubeta con solución de transferencia. Aplicamos voltaje y el ADN se mueve hacia el lado positivo por lo que sale del gel y se va a la membrana de nailon.

• OBTENCIÓN DE UNA SONDA

Una sonda es una molécula de ADN o ARN que puede estar en forma de cadena simple o doble, debe estar marcada y con una secuencia complementaria a la que estamos buscando. Si es de cadena doble hay que ponerla simple.

• TIPOS DE MARCAJE.

1.- En caliente; con radioactividad. Se utilizan nucleótidos con fósforo radioactivo bien en posición alfa o bien en posición gamma.

2.- En frío; se hace gracias a que los nucleótidos llevan conjugado un antígeno (dihidroxigenina, biotina y fluoresceína). La fluoresceína es capaz de emitir fluorescencia, por lo que también puede detectarse de forma directa. Todo se hace de forma indirecta porque la membrana de nailon no se puede observar al microscopio.

• METODOS DE MARCAJE.

Casi todos pueden utilizarse con antígenos o nucleótidos radioactivos.

1.- Traslado de la muesca (Nick-traslation); se incuba el ADN con el enzima ADNasa I que introduce mellas de forma aleatoria en ambas hebras de ADN (mella: ausencia de un enlace fosfodiester entre un P-5´ y un 3´OH.). El ADN con mella se incuba con la ADNpolimerasa I de E. coli y dNTP´s marcados (la ADNpolimerasa I tiene actividad polimerasa 5´-3´, actividad exonucleasa 5´-3´ y 3´-5´ correctora, y actividad ARNasa H). Al añadir ADNpolimerasa I se une en posición 3´ de la mella, pero no se puede poner nucleótido, por lo que actúa con actividad exonucleasa 5´-3´ y quita un nucleótido y luego lo pone. Polimeriza en dirección 5´-3´ y va colocando nucleótidos marcados, así en todas las mellas. La determinación de nucleótidos marcados es en función de la cantidad de ADNpolimerasa I, a más cantidad mayor número de mellas y mayor número de nucleótidos marcados.

2.- Primado al azar (Radom priming); se parte de ADN de cadena simple o doble, si el ADN es de cadena doble hay que desnaturalizarlo. Se añade una mezcla de hexonucleótidos, otra de nucleótidos marcados y ADN polimerasa (fragmento Klenow) sin actividad exonucleasa 5´-3´. Los hexanucleótidos están formados por oligonucleótidos de 6 nucleótidos, con cualquier secuencia al azar. Estos oligonucleótidos se unen a la cadena de ADN (secuencias complementarias). La ADNpolimerasa I se une al extremo 3´OH unidos a una cadena de ADN molde y sintetiza la hebra complementaria con nucleótidos del medio. La cadena de ADN marcada es toda de nueva síntesis. En el otro caso también es de nueva síntesis pero lo que se hace es sustituir el ADN inicial por ADN marcado. El fragmento Klenow cuando llega al extremo 3´ en el que comienza el nuevo hexanucleótido no puede quitar este hexanucleótido y lo que hace es meterse en medio de la hebra y despegarla. En general nos podemos encontrar que la cantidad de ADN es mucho mayor que el tamaño de la hebra.

3.- Adición de colas marcadas (oligonucleotide tailing); partimos de ADN monocatenario o bicatenario. La transferasa terminal añade nucleótidos a moléculas de ADN monocatenario o bicatenario en el extremo 3´OH. Si ponemos nucleótidos marcados en el medio, estas colas que añadimos están marcadas. Se añade ADN monocatenario o bicatenario en condiciones ligeramente desnaturalizantes, mas transferasa terminal, y con nucleótidos marcados. Obtenemos el ADN marcado en los extremos. La secuencia del nucleótido añadido es al azar.

4.- Marcaje en 3´ (3´ End-filling). Solo con moléculas de ADN de cadena doble con el extremo 5´ prominente. Añadimos una ADNpolimerasa y una mezcla de nucleótidos marcados (dNTB*). Sintetiza desde el extremo 3´ hasta rellenar el espacio. Será una molécula de ADN con los extremos marcados.

5.- Marcaje en 5´ (5´ End-labeling); La 5´ End-labeling es igual. La molécula de ADN de cadena simple o doble o ARN, se trata con fosfatasa y así quitamos el fósforo del extremo 5´. Queda OH. Tratamos después con quinasa poniendo también en el medio fósforo radioactivo. Ahora tenemos los extremos 5´ marcados radioactivamente.

6.- Marcaje por PCR. Con ADN de cadena simple o doble, se desnaturaliza, se añaden unos cebadores complementarios a la molécula que hemos puesto, estos cebadores se unen, cuando baja la temperatura, a sus regiones complementarias. Añadimos una polimerasa y nucleótidos marcados. Este ciclo se repite muchas veces (30 normalmente) y así aumentamos de forma exponencial la cantidad de ADN que se obtiene en relación a la que se obtuvo al principio (es una ventaja). Se desnaturalizan las hebras otra vez y se vuelve a repetir lo mismo, así se consigue lo anteriormente propuesto (mas concentración de ADN). Casi todo el ADN que obtenemos al final es ADN marcado. La polimerasa tiene que ser termoestable para que no se inactive durante la desnaturalización.

7.- Transcripción in vitro. Sirve para obtener moléculas de ARN marcadas partiendo de ADN de cadena doble. Pero se necesita que el ADN de cadena doble tenga al principio un promotor. Hay unos enzimas, las ARNpolimerasas, que sintetizan ARN a partir de ADN de cadena doble. Inician la transcripción en unas secuencias promotoras. Para obtener esta sonda de ARN, se utilizan ARNpolimerasas vivos: SP6, T3, T7. Reconocen secuencias específicas y diferentes. Si ponemos en el medio ribonucleótidos marcados este ARN está marcado. Si ponemos la Poli-A-polimerasa, ATP marcado y moléculas de ARN, tenemos moléculas de ARN con una cola de poliadenilato marcada.

• HIBRIDACIÓN

Consiste en unir la sonda de cadena simple con los ácidos nucleicos de cadena simple, y fijarlos a un soporte sólido.

Hay varios factores que afectan a la hibridación:

1.- Temperatura: si es muy baja la sonda se puede unir solo con alguna región de complementaridad. Si es muy alta se desnaturaliza. La temperatura tiene que ser lo suficientemente alta para que se unan todos los nucleótidos de la sonda.

2.- Concentración de la sonda; si es muy poca no se une, tiene que haber mucha.

3.- Mayor concentración de sales en el medio; se favorece la unión de la sonda a su secuencia complementaria, pero sin pasarse, porque si no la sonda se uniría a cualquiera.

4.- Bloqueo; los posibles sitios de unión inespecíficos de la sonda se tapan con ADN marcado.

Los pasos a seguir en el proceso son:

1.- Pre-hibridación; se bloquean los sitios de unión inespecíficos de la sonda (a los que se pueden unir).

2.- Hibridación; es la unión entre secuencias complementarias.

3.- Lavados; se consigue la eliminación de sonda no unida a secuencias específicas.

• REVELADO

• Para sondas calientes:

Detección de la sonda:

1.- Directa: con un contador de radioactividad.

2.- Indirecta: mediante AUTORRADIOGRAFÍA.

• Para sondas frías:

Detección de la sonda:

1.- Indirecta: mediante revelado inmunológico, mediante impresión de película sensible. Revelado inmunológico, con anticuerpos específicos, para detectar el anticuerpo, utilizamos la actividad de la enzima que hemos unido al anticuerpo. Se pueden utilizar dos enzimas, la fosfatas alcalina o la peroxidasa antidiyodoxigenina. Se añade el sustrato del enzima y donde esté el enzima se produce el producto que se deposita donde está el enzima y si es coloreado nos dirá donde está la sonda. También puede ser una sustancia que emita alguna radiación y se coloca una película para detectar la emisión.

TEMA 6: APLICACIONES DE LA MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

• SECUENCIACIÓN

La variabilidad de la molécula de ADN no radica ni en la estructura ni en la diversidad de sus componentes, sino en la ordenación y cadencia de los cuatro nucleótidos que forman la molécula, esto es, en su secuencia. Diferencias diminutas en la secuencia de dos moléculas de ADN pueden representar grandes cambios en sus productos. Hoy podemos conocer la secuencia de cualquier ADN aislado de modo rápido y eficaz.

Los dos métodos de secuenciación denominados químico y enzimático, comparten algunos principios básicos. Por ejemplo, ambos han de marcar de algún modo de las moléculas a secuenciar, bien radiactivamente o con fluorocromos. Otra de las características compartidas es la de generar fragmentos de ADN de una sola hebra cuyos tamaños sólo se diferencien en una base. Moléculas de ADN con la misma secuencia, y que sólo se diferencien en una base, pueden ser separados en geles desnaturalizantes de acrilamida por electroforesis. Las bandas correspondientes a las moléculas de longitud decreciente forman una escalera que nos permitirá leer del orden de unos 300 nucleótidos consecutivos.

• Secuenciación química.

En este método, un fragmento de ADN se marca radiactivamente en sus extremos con  32P o  35S dATP por acción de la polinucleótido quinasa. Ambos extremos han de ser separados en dos fragmentos distintos (con una enzima de restricción, por ejemplo) y secuenciados independientemente.

Al comienzo del proceso tendremos un gran número de moléculas idénticas, todas ellas marcadas en el mismo extremo. El paso siguiente consistirá en romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases.

Se separan cuatro alícuotas y cada una de ellas será tratada con un compuesto químico que nos modifique sólo una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de ADN. El tratamiento a continuación con piperidina producirá la ruptura de la cadena allí donde la base fue alterada. Existen distintas reacciones de modificación de las bases, y en la técnica que se describe las guaninas se modifican específicamente por tratamiento con dimetil sulfóxido al 1 por 100 en presencia de formato de amonio pH 3´5 durante 10 minutos. Guaninas y adeninas son atacadas por ácido fórmico al 80 por 100 durante 20 minutos. Las timiditas se degradan al tratarlas con MnO4K 0´1 mM durante 20 minutos (también son atacadas las purinas, pero en menor grado). Las citosinas son eliminadas con hidroxilamina 4 M a pH 6.

Las reacciones se pueden llevar a cabo con el ADN unido a papel, lo que facilita el manejo de las muestras. El tratamiento con piperidina suelta el ADN del papel, el ADN se analiza en geles desnaturalizantes de acrilamida.

Las bandas marcadas se visualizarán por autorradiografía y la secuencia se leerá identificando el tamaño de cada banda en los pocillos correspondientes a cada base.

• Secuenciación enzimática.

Este método es el más utilizado en la actualidad. Se parte de un ADN, idealmente circular y de banda simple, pero ADN lineal o circular bicatenario desnaturalizado también es buen sustrato. Necesitamos un cebador que sirva de enganche para el inicio de la síntesis del ADN que vamos a marcar radiactivamente y secuenciar. El cebador puede ser específico y complementario a una secuencia de localización concreta (o puede representar una pequeña secuencia al azar sin localización definida a priori). La enzima Klenow o la secuenasa son las enzimas empleadas. De modo análogo al método químico, se establecen cuatro alícuotas, una para cada base. La síntesis se lleva a cabo en dos pasos: en la primera parte del proceso el cebador se alarga unos cientos de nucleótidos más, utilizando los cuatro desoxinucleótidos e incluyendo dATP marcado con 32P o con 35S en el fosfato alfa, como precursor radiactivo. En el segundo paso se produce la terminación de cadenas por adición de una pequeña cantidad de un dideoxinucleótido distinto en cada alícuota. El dideóxido es un nucleótido trifosfato que por carecer de grupos OH, tanto en el carbono 2´ como el 3´ de la ribosa, imposibilita el crecimiento de la cadena y paraliza la síntesis. El resultado en cada tubo de ensayo es una colección de fragmentos, de tantos tamaños como unidades de la base en concreto existan en la secuencia. Los distintos fragmentos se analizarán por electroforesis en geles de acrilamida y autorradiografía como en el caso anterior.

Los nucleótidos marcados con azufre tienen varias ventajas con respecto al fósforo: originan bandas más nítidas en la autorradigrafía al poseer energía de menor poder de penetración, tienen una vida media más larga y su manipulación es menos peligrosa para el usuario.

• Secuenciación automática.

El marcaje con fluorocromos permite eliminar la radiactividad y automatizar la última parte del proceso, esto es, la manipulación de los geles de secuenciación, fijación, secado y autorradiografía.

Hay esencialmente dos métodos: uno consiste en marcar las moléculas que servirán de cebadores con el fluorocromo tetrametilrodamina. Los cebadores así conjugados al fluorocromo, iniciarán la síntesis por el método enzimático. Una vez interrumpida la síntesis con los dideóxidos correspondientes, las muestras se corren en un gel donde las distintas bandas son leídas al pasar por un rayo láser que identifica el fluorocromo.

El segundo método utiliza cuatro fluorocromos distintos: fluoresceína, NBD, tetrametilrodamina y rojo de Texas, uno para cada base. Una vez conjugados a cuatro alícuotas del cebador, se procede a la extensión del iniciador e interrupción con dideóxidos. Las cuatro muestras se pueden correr en un mismo pocillo, ya que tienen colores distintos y podrán ser distinguidos unos de otros por su diferente emisión (longitud de onda).

Los resultados han de ser examinados en un ordenador, ya que los espectros de cada fluorocromo, cuando se utilizan cuatro, se solapan ligeramente. Cuando se utiliza un solo fluorocromo, el rayo láser transmitirá a la computadora la información sobre el tamaño de los fragmentos en cada pocillo del gel. En ambos casos la computadora deducirá la secuencia y la presentará. Un total de 500 bases pueden ser identificadas con este procedimiento.

El marcaje con fluorocromos y el análisis automatizado de los geles también puede ser aplicado al método químico de secuenciación. El tratamiento con los distintos compuestos químicos no interfiere con el fluorocromo acoplado al extremo 5´ de las moléculas a secuenciar.

• DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES (RFLP)

Se fundamenta en el diagnóstico de enfermedades causadas por mutaciones que al mismo tiempo dan lugar a la aparición de RFLPs. Las mutaciones diagnosticables por RFLPs se dan por:

1.- Inserciones.

2.- Deleciónes.

3.- Mutaciones puntuales; si como consecuencia:

• Aparece una diana para ER.

• Desaparece una diana para ER.

Si cualquiera de ellos causa una enfermedad y al mismo tiempo estas mutaciones están asociadas a un RFLP; podemos hacer un diagnostico de la enfermedad por un RFLP.

La inserción y la deleción se comportan más o menos de la misma manera. Puede haber un individuo homocigoto normal y otro heterocigoto para la mutación.

Hay endonucleasas de restricción que cortan a los lados de donde se ha producido la inserción. Los individuos normales tienen un tamaño de fragmento igual y más pequeño que en los que se ha producido la inserción. Se hace una electroforesis de ADN digerido, se transfieren a un soporte sólido, se hibrida utilizando como sonda cualquier región del fragmento que vamos a detectar que no incluya la zona donde se ha producido la inserción. Lo que se ve en el individuo H.N una sola banda con la longitud del fragmento entero, en el H+.M hay dos bandas una mas corta y otra mas larga, y en H.M una base mas corta. El número de bandas depende de la sonda que utilizamos del lugar donde se une en el ADN.

• Enfermedad asociada a inserción.

1.- Digestión con ER.

2.- Electroforesis.

3.- Transferencia.

4.- Hibridación con sonda.

5.- Revelado.

HN = homocigoto normal; HC = heterocigoto; HM = homocigoto mutación.

• Enfermedad asociada a deleción.

1.- Digestión con ER.

2.- Electroforesis.

3.- Transferencia.

4.- Hibridación con sonda.

5.- Revelado.

• Enfermedad asociada a mutación puntual.

Como consecuencia aparece una diana para ER.

1.- Digestión con ER.

2.- Electroforesis.

3.- Transferencia.

4.- Hibridación con sonda.

5.- Revelado.

• Enfermedad asociada a mutación puntual.

Como consecuencia desaparece una diana para ER.

1.- Digestión con ER.

2.- Electroforesis.

3.- Transferencia.

4.- Hibridación con sonda.

5.- Revelado.

• IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS

Se fundamenta en el análisis de sitios en el genoma en los que existen variaciones en la secuencia de ADN detectables como diferencias entre individuos de una población. Cuando estas diferencias son raras reciben el nombre de mutación y no son útiles para este tipo de análisis. Cuando estas diferencias son frecuentes reciben el nombre de polimorfismos y pueden emplearse para establecer la “huella genética”.

Estudiar si una muestra de ADN está relacionada o no con algún individuo, o si un individuo puede estar relacionado con otro. Para hacer estudios evolutivos analizando registros fósiles.

Todo esto se basa en determinar la huella genética de un individuo determinado. El genoma humano tiene 3x109 pares de bases. Se analizan solo las diferencias del genoma porque entre individuos hay 0,1% de diferencias, o sea, 3 millones de diferencias.

VNTR; repetimos en tandem en números variables. Para ver las diferencias. En el cariotipo humano en posiciones en las que hay un número de repeticiones en tandem pero son variables, el número de repeticiones entre los diferentes individuos (no varía la secuencia sino el número de repeticiones).

Si analizamos una determinada VNTR en la población, vemos las variaciones que hay, por ejemplo individuos que tienen 3 repeticiones, otros 7, otros 10 y otros 25 repeticiones. Estos alelos están formados por un número diferente de repeticiones. Si encontramos endonucleasas de restricción que corten a ambos lados podemos utilizar la PCR y utilizamos como sonda la secuencia de VNTR determinado. Observamos las bandas en la electroforesis y sabemos el número de repetición.

Se utilizan diferentes sondas con secuencias diferentes dependiendo de cada tipo de VNTR.

Esto se puede aplicar para pruebas de paternidad, para pruebas incriminatorias o exculpatorias en casos criminales, para la búsqueda de personas desaparecidas o incluso para estudios evolutivos.

TEMA 7: INTRODUCCIÓN A LA CLONACIÓN

• CLONACIÓN

Un clon es una estirpe celular o serie de individuos pluricelulares nacidos de ésta, absolutamente homogéneos desde el punto de vista de su estructura genética.

La clonación permite obtener un gran número de células/individuos, portadores todos ellos de la misma información genética manipulada.

La clonación se utiliza para:

1.- Obtener un elevado número de copias de la secuencia de interés para:

• Análisis.

• Manipulación.

• Secuenciación.

2.- Analizar la función de fragmentos de ADN in vivo.

3.- Síntesis de proteínas de interés.

El proceso básico sería: unir el inserto a un vector, lo que nos daría ADN recombinante que introduciríamos en una célula hospedadora para amplificar el ADN recombinante, y a partir de esta se hace una selección de células recombinantes, y seleccionamos el clon de interés.

• ANÁLISIS DEL PROCESO DE CLONACIÓN

Los pasos claves en la clonación de ADN son:

1.- Obtención del inserto.

2.- Producción de ADN recombinante (vector + inserto).

3.- Amplificar la molécula de ADN recombinante mediante su introducción en un hospedador adecuado.

4.- Identificación del clon adecuado.

• Obtención del inserto.

El experimento suele ir dirigido al aislamiento, amplificación, análisis o expresión de un cierto fragmento de ADN que aparece como el objeto central del clonaje. En ocasiones no se conoce detalle alguno de su estructura y por ello no se le exige una participación activa en el proceso; en otros casos, se utiliza como soporte de una información para la síntesis de un producto proteico. Se le conoce como ADN pasajero, ADN extraño o foráneo o, también, inserto, recordando su ubicación en el interior de un recombinante.

El ADN se extrae de su fuente biológica natural (extracción a partir de geles de agarosa, producto de PCR, …). Una vez purificado y, en su caso, caracterizado y manipulado, se une al ADN vector para formar el ADN recombinante y ser clonado. Tras su clonaje y amplificación, puede recuperarse del cultivo y separarse del vector para su estudio y análisis.

La amplia metodología actual permite incorporar a este esquema cualquier tipo de ADN como inserto del clonaje. Así:

Puede ser un único fragmento o una población mixta de piezas diferentes de ADN.

Puede ser un ADN bicatenario o un ADN de hebra simple.

Puede ser un ADN natural, extraido de una fuente biológica cualquiera, o bien una molécula sintética, obtenida artificialmente; también puede ser un ADNc sintetizado a partir de un ARNm.

Puede ser ADN genómico (procariotas, eucariotas), ADN de orgánulos (mitocondrial, cloroplastidial), ADN de plásmidos, o incluso ARN.

Con esto se ve que el ADN puede proceder de:

1.- Una población homogénea; se obtienen moléculas de ADN en gel de agarosa y normalmente también si partimos de productos de PCR.

2.- Una población heterogénea; cuando aislamos una secuencia determinada. También se puede obtener de ARN un ADN complementario. Se trabaja con endonucleasas de restricción para generar fragmentos pequeños.

• Producción del ADN recombinante.

VECTOR.

Éste es el elemento más desarrollado del esquema. Es el principal responsable del éxito del experimento al depender de él tanto la supervivencia del recombinante en el cultivo transformado, por lo que se da una selección, como la expresión del inserto en sus células. Se trata de una molécula de ADN encargada de recibir al inserto y acompañarle en su transferencia al interior celular; allí es responsable de que el recombinante replique y de que sus copias se repartan correctamente entre las células descendientes de la primera, o se propaguen adecuadamente por infección de otras células del cultivo. El ADN vector transporta distintos tipos de marcadores fenotípicos para la selección de células así como diversas señales para la expresión del pasajero.

CARACTERÍSTICAS DEL VECTOR.

Debe contener un origen de replicación (región ori) que sea activo en la célula hospedadora, capaz de dirigir la acción de la maquinaria replicativa celular sobre el recombinante y provocar su replicación, de manera que sus copias se repartan entre las células descendientes de aquélla (o se propaguen por infección al resto de células del cultivo) y se consiga así la amplificación del ADN clonado. La naturaleza de ori es fundamental para definir el rango de hospedador de un vector, ya que esa región tiene que ser reconocida por el complejo replicativo celular. Los vectores lanzadera contienen más de un origen de replicación y, por ello, son activos en más de un tipo de célula.

Si el sistema de transferencia y/o propagación no es muy eficiente, se requiere que contengan un marcador para la selección de recombinantes que permita anular el crecimiento de las células que no lo contienen (los marcadores más frecuentes son genes que codifican resistencia a antibióticos).

Que tengan regulación de la expresión del inserto en el caso de vectores de expresión.

Y que sean de un pequeño tamaño, pero que tengan una gran capacidad de carga.

PRODUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE.

El ADN recombinante es la molécula que resulta de la unión del ADN vector y del inserto. Su amplificación, análisis y expresión pasa por su transferencia al interior de una célula hospedadora, es decir, su clonaje. Una vez clonado, puede recuperarse del cultivo y conservarse como ADN puro.

La síntesis de ADN recombinante se basa en la unión in vitro del vector y el inserto mediante la acción de la ADN ligasa. Los diferentes vectores aportan diferentes alternativas para facilitar esta etapa.

Cuando hacemos el proceso de obtención de ARN recombinante podemos obtener además de este otra molécula como el ADN inserto unido consigo mismo, es la recircularización del inserto. Unido a otro inserto son concatémeros del inserto o lo mismo pero con el vector.

Hay que aumentar la eficiencia para que todas las moléculas posibles sean ADN recombinante (inserto + vector). Hay que conseguir que tanto el vector como el inserto tengan extremos cohesivos compatibles.

Si tenemos extremos cohesivos incompatibles se puede hacer que sean compatibles con rellenado parcial de los extremos. Para conseguir extremos cohesivos el paso más simple es generar extremos sanos y a partir de ahí obtener extremos romos compatibles:

1.- Rellenado total si tenemos extremos 5´ prominentes.

2.- Eliminar la región de cadena de ADN simple con endonucleasas específicas de ADN simple.

Para luego crear extremos cohesivos se puede:

1.- Añadir colas homopoliméricas; tanto al inserto como al vector (suelen ser de poliC y poliG porque la unión es mas fuerte por estar unidos por tres puentes de Hidrógeno). Cuando las colas se unen al inserto y al vector no van a ser iguales en longitud o que aparecen en posiciones conocidas. Se quedan muescas en la cadena y hay que rellenar con polimerasas y ligasas.

2.- Empleo de moléculas; llamados Linkers, que son moléculas de ADN de cadena doble que posee una diana para una nucleasa de restricción específica. Después de tratar con este enzima obtenemos extremos cohesivos en el vector y en el inserto que son cohesivos entre si. Ponemos poco inserto y mucho linker para obtener fragmentos como queremos y con el vector igual. El problema es que como el inserto o el vector tenga la secuencia diana que reconoce la endonucleasa también cortaría esta molécula. Se trata nuestro inserto y lo tratamos con el enzima de modificación correspondiente que metila las secuencias diana y después se fija el linker.

Un adaptador. Si una molécula tiene un extremo romo y otro cohesivo compatible con alguna endonucleasa de restricción. Le colocamos un adaptador a cada lado. Los adaptadores están desfosforilados en el extremo cohesivo y por eso otro adaptador no se puede unir por ese extremo cohesivo.

El inserto después de unirle los adaptadores esta defosforilado. Si el vector que se le va a unir está fosforilado si puede unirse. Una ventaja con adaptadores es que no hay que utilizar endonucleasa de restricción y así evitamos que pueda cortar nuestro inserto.

Ya podemos unir el inserto con el vector porque el inserto tiene extremos cohesivos y compatibles.

Para aumentar la eficiencia del proceso se defosforila o el inserto o el vector, para que no se una consigo mismo.

Otra forma de aumentar la eficiencia del proceso es añadir colas homopoliméricas al vector y al inserto. Así no se recircularizan ni se forman concatémeros.

Para generar extremos cohesivos compatibles, podemos utilizar endonucleasas de restricción distintas tanto en el vector como en el inserto. Se pueden generar extremos cohesivos y compatibles.

Si se recirculariza es reconocido por la endonucleasa de restricción y se puede cortar. Y si se concatena también. Y con el vector pasa lo mismo.

Si se unen el vector y el inserto se quita la diana para las endonucleasas y ya no se unen.

Si son extremos cohesivos compatibles se pueden unir el inserto en dos direcciones. Hay que controlar la orientación del experimento.

Conseguir un inserto con extremos no compatibles entre si y el vector igual pero compatibles con los del inserto en la dirección que nos interesa. Cortando el inserto con dos endonucleasas de restricción diferentes y cortando el vector con las mismas endonucleasas en el orden que queramos que se una el vector con el inserto.

El proceso generalizado sería: se añade al mismo tubo el inserto y el vector con extremos compatibles. Y se pone, además, la ligasa de ADN, que cataliza la formación de moléculas de ADN recombinante.

• Introducción del ADN recombinante en la célula hospedadora.

Son células que se encargan de duplicar nuestro ADN recombinante. Pueden ser procariotas o eucariotas. Las procariotas que mas se utilizan son E. coli, es la mas simple y se pueden hacer pocas cosas.

Las eucariotas, las más simples son las levaduras. También se usan líneas celulares de mamíferos, insectos o plantas. También embriones de mamíferos o embriones de insectos.

Las células hospedadoras necesitan tener una serie de características:

1.- Que no sean capaces de modificar, degradar o recombinar el ADN recombinante introducido.

2.- Que carezcan del fenotipo proporcionado por los marcadores presentes en los vectores que empleamos.

3.- Otras características deseables en función del objetivo, experimento, vector, …

MÉTODOS PARA INTRODUCIR EL ADN RECOMBINANTE.

1.- Transformación por choque térmico; cuando se tratan las células con cationes bivalentes y se altera la envuelta celular, se obtienen células competentes que son capaces de captar ADN del medio que puede ser sometido a un choque térmico, normalmente se utilizan células procariotas.

2.- Transfección de ADN precipitado con fosfato cálcico; suelen utilizarse células eucariotas.

3.- Infección por fagos o virus; se coge el ADN recombinante y se mete dentro de una partícula viral y es el virus el que se encarga de meter el ADN en la célula.

4.- Electroporación; en bacterias y células animales. Se somete a la célula a una diferencia de potencial fuerte, en este proceso se abren poros transitorios y por ahí entra el ADN.

5.- Empleo de liposomas; para células que tengan membrana. El ADN se mete dentro de un liposoma (que es una membrana) y se puede fusionar con la membrana de una célula y meter dentro de la célula.

6.- Microinyección; el ADN se mete dentro de la célula directamente.

7.- Bombardeo con microproyectiles; realizados con metales pesados, y a la superficie se le une el ADN, se bombardea a la célula hospedadora con estos proyectiles. Se suele utilizar sobre todo en plantas.

DESTINOS DEL ADN DENTRO DE LA CÉLULA RECEPTORA.

1.- Se pude degradar (se pierde).

2.- Se puede integrar en el cromosoma (se replica con el cromosoma bacteriano).

3.- Puede que no se integre y entonces puede:

• No se replica de forma autónoma.

• Se replica de forma autónoma.

• Identificación del clon adecuado.

SELECCIÓN DE RECOMBINANTES.

Cuando hacemos todos estos procesos habrá células que se transformen y células que no se transformen. Dentro de las que se transforman las hay con ADN recombinante (que es lo que nos interesa), con vector, otros. Dentro de las que tienen ADN recombinante puede haber positivas y negativas.

Las células hospedadoras no transformadas, no llevan el vector por lo que no llevan el marcador.

En el caso de células hospedadoras transformadas con otra cosa que no lleve marcador, tampoco se ve nada.

Las células transformadas con vector y con ADN recombinante, llevan marcador. Para diferenciar esto se ponen dos marcadores diferentes al vector. Una célula que lleve solo el vector tendrá el marcador 1 y el 2, si la célula tiene ADN recombinante lleva el marcador 1 pero no lleva el 2, porque ha sido inactivado por el inserto.

Hacemos crecer las células en una placa y seleccionamos las que sean positivas para el marcador 1 y negativas para el marcador 2.

Por lo tanto lo que se debe hacer es poner unas condiciones de crecimiento que permitan únicamente la división de las bacterias transformadas y distinguir entre bacterias transformadas recombinantes y transformadas no recombinantes.

Cuando un fago infecta una bacteria libera un gran número de partículas fágicas que, a su vez, inyectan las bacterias de alrededor. El resultado es una zona clara en un césped de bacterias que se denomina calva.

La identificación de una calva de lisis fágica cuyos fagos lleven un gen de interés de entre todas las calvas de lisis crecidas sobre un césped de bacterias, o la de una colonia bacteriana de entre todas las crecidas en una placa Petri es una práctica común en ingeniería genética.

Los métodos de hibridación son los más comunes para la selección de un clon en particular de entre todos los obtenidos. La utilización de estos métodos precisa del empleo de una sonda, esto es, un ADN o ARN complementario al gen que se desea aislar y que podemos marcar radiactivamente. Muchas veces no es posible tener una sonda pura, sino que se parte de una mezcla enriquecida para la secuencia que buscamos, con lo cual el proceso de aislamiento e identificación del gen deseado no es tan directo como en el ejemplo que describiremos a continuación.

Partiendo, por ejemplo, de una librería genómica, el primer paso será crecer las colonias o calvas a una gran densidad para poder tener el mayor número posible de unidades por placa Petri. A continuación se transfieren las colonias/calvas a papel de nitrocelulosa o nailon, colocando simplemente dicho papel sobre la placa Petri. Una parte de las colonias permanecerán en la placa Petri y constituirán la placa maestra, a partir de la cual se aislará la colonia/fago de interés. El filtro con las colonias/calvas es tratado con álcali para lisar las bacterias/fagos y desnaturalizar el ADN. Seguidamente se incuba con protinasa K para degradar proteínas, y dejar sólo el ADN unido a la nitrocelulosa, por la que tiene gran afinidad. El ADN se fija al papel por calor en horno a 80ºC en el caso de la nitrocelulosa, o por radiación ultravioleta en el caso del nailon. Se desnaturaliza la sonda, si es de doble banda, y se hibrida a los filtros en condiciones de sal y temperatura que favorezcan la formación y estabilidad de secuencias complementarias. El resultado de esta hibridación se detecta por autorradiografía. La colonia cuyo ADN da lugar a un positivo en la autorradiografía puede ser seleccionada en la placa Petri maestra de partida.

El método descrito es general para identificar cualquier secuencia o gen del que se disponga de una sonda. La obtención de sonda es, pues, el factor limitante.

TEMA 8: VECTORES DE CLONACIÓN EN PROCARIOTAS

• INTRODUCCIÓN

Los vectores de clonación permite seleccionar o encontrar las bacterias que no llevan ADN recombinante (estas se mueren). El vector también tiene que permitir que el ADN recombinante se replique autónomamente dentro de la bacteria, para conseguir esto se ha visto que las moléculas dentro de las bacterias tienen replicación autónoma, así se han hecho vectores derivados de plásmidos. El fago  también se replica de forma autónoma y también se han hecho vectores derivados de este. Un vector con propiedades intermedias son los cósmidos. Los últimos son vectores derivados de virus monocatenarios. En resumen:

Replicación autónoma:

• Vectores derivados de plásmidos.

• Vectores derivados del fago .

• Vectores derivados de los dos cósmidos.

• Vectores derivados de virus monocatenarios M13.

• Transducción generalizada.

Cuando un fago entra en una bacteria inyecta su ADN. Este puede hacer dos cosas:

Recircularizarse, y después replicarse. Hay lisis y al final salen muchas partículas del fago de esa bacteria. Este sería el ciclo lítico.

En el ciclo lisogénico el ADN se integra en el cromosoma bacteriano, esto ocurre hasta que se dan unas condiciones en que el fago se escinde del cromosoma bacteriano y sigue el ciclo lítico.

Para la transducción generalizada hace falta un ciclo lítico, porque por el mecanismo de transducción en ocasiones se empaqueta el genoma de la bacteria en lugar de el del fago, así cuando los fagos vuelvan a infectar a una bacteria, las partículas que lleve la bacteria también se integran.

Por este mecanismo, cualquier gen de una bacteria puede pasar a otra bacteria con la misma probabilidad.

• Transducción restringida.

Es necesario que el fago haya seguido el ciclo lisogénico (completamente diferente al anterior).

El mecanismo se basa en una escisión errónea del fago que sigue un ciclo lisogénico. Cuando las condiciones son las adecuadas, el fago se escinde para replicarse, pero la escisión es errónea y se lleva parte del genoma de la bacteria. Si se da la escisión errónea al replicarse habrá pequeñas partículas con genoma de la bacteria, se empaqueta y al infectar a otras bacterias también se integrará parte del genoma de la primera bacteria.

No todos los genes pasan a la célula receptora con la misma probabilidad, pasan los genes que están a ambos lados del genoma del fago, es decir, los genes del sitio de integración (el gen gal y el bio).

• VECTORES DERIVADOS DE PLÁSMIDOS

• Características generales.

Las características principales son:

1.- Moléculas de ADN circular cerrado covalentemente, extracromosómicos.

2.- Replicación autónoma.

3.- Distribución amplia en la población.

4.- Confieren características fenotípicas a las bacterias que los poseen.

5.- Tamaño y número de copias por célula variable.

El control de la replicación del plásmido interesa especialmente porque interesa que los plásmidos estén presentes en un elevado número de copias y por tanto habrá que trabajar con plásmidos con un control relajado de la replicación.

Dentro de una misma bacteria solamente pueden coexistir diferentes plásmidos si pertenecen a grupos de incompatibilidad diferentes. Los grupos de incompatibilidad quedan definidos por el mecanismo de control de la replicación del plásmido de forma que los plásmidos pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad si el control de la replicación se realiza de la misma manera.

El mecanismo de control de replicación es muy importante y un ejemplo de este es la replicación del grupo de incompatibilidad Col E I: a un lado del origen de replicación tiene lugar la transcripción de una molécula de ARN que recibe el nombre de ARN II, esta molécula se procesa y sirve de cebador para iniciar la replicación a partir del origen de replicación. Los plásmidos pueden regular la replicación de forma negativa, y es que en la misma región donde se transcribe el ARN II, se puede transcribir otra molécula de ARN que recibe el nombre de ARN I que se transcribe en la dirección contraria a la que se transcribe ARN II. Como ARN I y ARN II se solapan en una región, y los dos se transcriben en direcciones contrarias, estos son complementarios en una pequeña región y ARN I regula negativamente la replicación porque secuestra a ARN II. Al otro lado del origen de replicación hay un gen que se transcribe y que cuando se traduce da lugar a la proteína rop que estabiliza el híbrido ARN I-ARN II (también inhibe la replicación). Para la replicación de nuestros plásmidos interesa que no haya proteína rop ni ARN I, es decir, inhibir los mecanismos de replicación negativa del plásmido.

Cuando utilizamos plásmidos hay unas características deseables para estos:

1.- Los vectores tienen que tener características fenotípicas seleccionables, es conveniente que en algún sitio un gen lleve un marcador que esté en la bacteria con el plásmido y no en las otras y hará que las primeras no mueran y las que no lleven el vector se mueran.

2.- Debe haber sitios de clonación; son dianas únicas para enzimas de restricción que cortan al vector en un solo punto. Los sitios de clonación deben estar dentro de marcadores seleccionables, cuando ponemos ADN digerido con el vector digerido lo que queremos es que se una el ADN-plásmido (vector), pero también puede aparecer el vector recircularizado y para ello nos interesa poder diferenciar bacterias con vector más inserto de bacterias con vector pero sin inserto. Si ponemos un segundo marcador y hay inserto, las bacterias con inserto lo tienen inhibido.

3.- Bajo peso molecular; cuanto más pequeño sea el plásmido más fácil es de manipular y más fácil es que entren dentro de la bacteria, que se repliquen y mayor probabilidad tienen de encontrar sitio de clonación.

• Elementos indispensables en vectores plasmídicos.

1.- Origen de replicación modificado para que sea reactivo en la bacteria.

2.- Promotores y secuencias implicadas en la expresión génica (vectores de expresión).

3.- Marcadores seleccionables.

4.- Sitios de clonación.

Los Poli-linkers son secciones cortas con aproximadamente 10 dianas para enzimas de restricción diferentes, es una secuencia que interrumpe la expresión de un marcador porque está inserto en él. Es un oligonucleótido de unas 20 pb que incluyen numerosos sitios de clonación para una gran variedad de enzimas de restricción (aproximadamente 10), y se encuentran interrumpiendo la expresión de un gen marcador.

• Selección de recombinantes.

Para la selección de los transformantes hay que sembrar las bacterias con tetraciclina, y las que crezcan es que son transformantes. Para saber cuales son los recombinantes hay que sembrar con tetraciclina y Amp, y las que estén en la 1º placa y no en la 2º serán las recombinantes.

Las bacterias tienen que ser defectivas para los genes marcadores para poder hacer esta clase de experimentos.

• Selección por inactivación insercional.

Otro gen marcador puede ser LacZ´, del operón de la lactosa. LacZ está implicado en el metabolismo de la lactosa y en concreto codifica para la -galactosidasa, que hidroliza lactosa dando GLU+GAL. LacZ también puede actuar sobre el sustrato artificial X-GAL, y da lugar a GAL y a otro producto de color azul. Las bacterias con -galactosidasa y en un medio con X-GAL dan lugar a colonias azules y lo podemos utilizar como un marcador seleccionable:

.- Si no hay inserto se produce -galactosidasa, que en un medio con X-GAL da colonias azules.

.- Si entra el inserto el gen LacZ se inactiva y en presencia de X-GAL no hay producto azul, las colonias son blancas.

Si en el medio hay también ampicilina obtendremos colonias blancas y azules, todas con resistencia a la ampicilina, pero con inserto (blancas) y sin inserto (azules). La selección se hace de las blancas que son las transformantes y recombinantes. En la realidad, las bacterias hospedadoras tienen una deleción en su gen LacZ, y la proteína no funciona, así son mutantes que hace que la -galactosidasa no sea funcional porque le falta un trozo.

El marcador no es el LacZ completo, sino el LacZ´, que es un fragmento del gen LacZ que codifica para la región que le falta a la bacteria hospedadora. Así cuando el plásmido con LacZ´ y la bacteria hospedadora defectiva están juntos, codifican para la proteína -galactosidasa funcional.

• Extracción del ADN plasmídico.

1.- Lisis celular; quedará una mezcla de ADN genómico + ADN plasmídico + impurezas. Necesitamos aislar por un lado el ADN de la bacteria y por otro lado el del plásmido, y esto se puede hacer porque los dos ADN tienen características diferentes.

2.- Extracción del ADN plasmídico (purificación);

• Centrifugación en gradiente de ClCs y EtBr; en gradiente de ClCs el ADN plasmídico y genómico están juntos pero separados de todo lo demás. Como el ADN plasmídico es circular y pequeño, y el genómico es grande y también circular, tras la lisis el genómico se vuelve lineal. Al hacer la centrifugación en gradiente de ClCs + EtBr se separan los dos porque el EtBr se mete entre las dos hebras de ADN, pero en el ADN lineal puede desenrollarlo y en el caso del plasmídico no puede hacerlo porque está superenrrollado. Al añadir EtBr disminuye la densidad de la molécula en la hebra desenrollada y en función de este se pueden separar.

• Lisis alcalina; también se lisan las células pero en una solución de lisis con pH 12-12´5, así se produce una desnaturalización de ADN lineal: el plasmídico sigue igual pero el genómico se desnaturaliza porque en el proceso de lisis se vuelve de cadena lineal. El siguiente paso es neutralizar la solución bajando el pH a 7-7´5 y el plasmídico estará igual, pero el genómico no se renaturaliza sino que forma una maraña que se puede separar de lo que es realmente el plasmídico por centrifugación.

• Electroforesis; para aislar plásmidos de tamaño elevado. Las bacterias se mezclan con agarosa fundida, se ponen en un molde y cuando solidifican se sacan los bloques con bacterias atrapadas. Este bloque se somete a solución de lisis y las bacterias se lisan dentro del bloque de agarosa. Se cargan los bloques en los pocillos como si fuera la muestra, se aplica un campo eléctrico y el ADN migra, pero las bacterias se quedan en el bloque.

• VECTORES DERIVADOS DEL FAGO 

Cuando un fago infecta a bacterias se adsorbe sobre una proteína de la superficie, entra en forma lineal, y se recirculariza. En forma circular el ADN puede seguir dos ciclos:

1.- Ciclo lisogénico; se integra en el cromosoma bacteriano y se queda de forma latente hasta que decida escindirse, en condiciones adecuadas, para replicarse y seguir el ciclo lítico.

2.- Ciclo lítico; en primer lugar el ADN circular se replica generándose un Ori y se obtienen dos copias. En la replicación tardía se replica de forma diferente, por el círculo rodante formando concatémeros de virus: el genoma de un virus seguido de otros muchos. Al mismo tiempo se sintetizan en la bacteria las cápsidas para empaquetar los virus y salir fuera de la bacteria.

El genoma del virus está formado por ADNdc con 48´5 kb, en sus extremos hay regiones de cadena simple de aproximadamente 12 pb complementarias entre sí y que son las que permiten la recircularización del fago dentro de la bacteria. Las secuencias de ADN de cadena simple de los extremos se denominan secuencias cos, que también están implicadas en el empaquetamiento, de forma que se empaqueta todo el ADN que hay entre dos secuencias cos.

Todos los genes implicados en un mismo proceso están juntos.

Sabiendo como es el ciclo biológico se puede conseguir que las bacterias hagan muchas copias del genoma del virus y utilizarlo como vector.

• Ventajas e inconvenientes del fago  como vector.

• Inconvenientes:

.- Genoma muy grande y por tanto baja probabilidad de encontrar sitios de clonación.

.- La capacidad de carga del fago  es muy baja, y eso limita el tamaño del inserto que se puede meter en el vector. Si usamos fago  como vector, y este tiene 48´5 kb, y la cantidad máxima de ADN que entra en la cápsida no puede superar las 52 kb, solo podremos poner un inserto de 3´5 kb. El límite mínimo para empaquetar es de 35 kb. En las 48´5 kb de ADN se encuentran dianas para diferentes enzimas de restricción, lo que es un problema, porque se necesitan dianas únicas para clonar.

• Ventajas:

.- Es posible realizar la selección en función del tamaño del inserto.

.- Mayor eficiencia de clonación.

Si queremos fabricar un vector a partir del fago  necesitamos aumentar la capacidad de carga del fago, también conservar los genes implicados en la replicación del fago, necesitamos también meter marcadores seleccionables y son imprescindibles las secuencias cos porque permiten recircularizar y empaquetar el vector y por tanto necesitamos meter regiones reguladoras de la expresión del inserto.

• Tipos de vectores del fago .

Hay dos tipos de vectores diferentes:

1.- Vectores de inserción; se modifica el fago  de forma que pongamos un sitio de clonación donde introducir el inserto que interrumpa un marcador seleccionable. Se corta con endonucleasas de restricción y se mete el inserto.

2.- Vectores de sustitución; se modifica el fago  de forma que se genere un región que se sustituya por el inserto. Se corta con una endonucleasa de restricción y se mete el inserto en la región a sustituir que es donde estará el marcador seleccionable.

El vector fágico puede entrar en la bacteria por transfección y por infección. Esta última posibilidad tiene mayor eficacia que la última.

El vector que entra por infección es 100 veces más eficiente.

El empaquetamiento se hace por métodos in vitro, por tres sistemas:

• Utilizando extractos celulares de bacterias infectadas por un fago  cuyos sitios cos están modificados.

• Utilizar sistemas de empaquetamiento doble; basado en dos bacterias, una infectada por fago defectivo para una proteína implicada en el empaquetamiento y la otra defectiva para otra proteína. Si se extraen las proteínas y se ponen conjuntas si se puede empaquetar.

• Comprar un sistema de empaquetamiento; vienen todas las proteínas, se juntan y se mezclan con el ADN.

Después del ligado hay concatémeros de secuencias cos y con el empaquetamiento in vitro se empaqueta el ADN que hay entre dos secuencias cos.

• Selección de recombinantes.

Inactivación isercional del gen LacZ´: si en LacZ´ hemos puesto un sitio de clonación pueden pasar dos cosas:

1.- Vector sin inserto; el LacZ´ sigue activo y junto con LacZ dan lugar a una -galactosidasa que en presencia de X-GAL lo degrada en GAL y producto azul. Ahora aparecen calvas azules en lugar de colonias azules como pasaba con los plásmidos. De esto se deduce que la bacteria hospedadora tiene que ser defectiva para LacZ, y necesita un complemento para que se active. Deben crecer en un medio con X-GAL y un inductor que será el IPTG.

2.- Vector con inserto; es el que se tiene que seleccionar. El gen LacZ´ se inactiva, no se complementa la mutación de la bacteria hospedadora y la degradación para la galactosidasa es negativa y aunque haya X-GAL en el medio no se produce compuesto color azul, serán todas las calvas blancas (calvas blancas recombinantes; se seleccionan).

Inactivación insercional del gen cI de ; este gen está implicado en la decisión de seguir el ciclo lítico o lisogénico. Cuando aumenta la cantidad de cI el virus se decide por el ciclo lisogénico, y cuando disminuye, por el ciclo lítico. En condiciones normales si tenemos una bacteria infectada por un virus, este tiene que decidir por un ciclo u otro, y en todas las bacterias no se decide por el mismo, por lo que habrá calvas turbias donde hay bacterias todavía vivas, porque el virus se ha decidido por el ciclo lisogénico. Podemos utilizar cI insercinándolo de forma que tendrá un sitio de clonación donde meter el inserto y dos posibilidades:

1.- Vector sin inserto: calvas turbias.

2.- Vector con inserto: cI se inactiva insercionalmente y como esta inactivado se sigue el ciclo lítico siempre y las calvas serán transparentes.

Selección utilizando el fenotipo spi (genes red y gam); genes implicados en la inmunidad y replicación del virus. Utilizamos como hospedador bacterias lisogénicas para el fago P2, que está integrado dentro del genoma bacteriano. Los virus tienen que evitar que haya otra infección por otro virus y los genes implicados en esto son red y gam. Si están los dos el segundo virus que va a infectar no puede hacerlo, por que el fago inhibe la entrada. Se detecta la inserción del inserto (se utilizan como vectores de sustitución). Hay dos posibilidades:

1.- Vector sin inserto; red+ y gam+, no se forman calvas porque no puede entrar el fago con un ciclo lítico (spi+).

2.- Vector con inserto; red- y gam-, no es sensible a la inhibición P2 y el segundo fago puede infectar a la bacteria y formar calvas. Todas las calvas que aparezcan serán recombinantes.

Selección en función del tamaño del genoma; si tenemos un vector derivado de , vamos a utilizarlo por sustitución si entre el vector y el inserto tienen más de 35 kb y menos de 52 kb, por encima y por debajo de estos límites no hay empaquetamiento.

• Métodos de contención biológica.

Utilizar vectores derivados de  con mutaciones de codón de parada en mitad de genes esenciales: si por ejemplo, tenemos un gen implicado en la replicación del virus y le introduce un codón de parada, cuando se transcriba y después se traduzca no se sintetiza la proteína completa y el virus no será capaz de sobrevivir. Necesitamos bacterias hospedadoras especiales que son supresoras de la mutación del vector, ya que cuando se transcriba en la bacteria esta no reconocerá el codón de parada como tal, sino que continua la transcripción porque el transferente de la bacteria introduce el aminoácido que le falta y continua la transducción de la proteína. Así el virus solo puede sobrevivir dentro de la bacteria (que está modificada genéticamente).

• CÓSMIDOS

Son híbridos entre plásmidos y derivados de , del plásmido llevan el origen de replicación y genes marcadores, y de los derivados de  llevan las secuencias cos. Además llevan sitios de clonación.

A la hora de utilizar los cósmidos una ventaja frente a los plásmidos es que al tener secuencias cos nos permiten empaquetarlos en partículas virales y podremos introducir el vector en la bacteria mediante transducción.

Y frente al vector derivado de  es que la capacidad de carga es mucho mayor.

El cósmido se linealiza y se liga con el inserto, cuando vamos a empaquetar lo hará todo lo que hay entre las secuencia cos que tenga un tamaño entre 35 y 52 kb. Con esto ya podemos infectar bacterias que se comportarán como un plásmido y se pueden seleccionar bacterias por el gen marcador (AmpR). Si:

.- Vector con inserto: en una placa con Amp las que crezcan serán recombinantes.

También tiene problemas, como:

1.- La orientación de las secuencias cos.

2.- También puede pasar que el inserto se una a otro y clonásemos secuencias que en realidad no están juntas.

3.- También se pueden caracterizar los vectores.

• VECTORES DERIVADOS DE VIRUS MONOCATENARIOS: M13

Nos centramos en M13 de ADNcs, que infecta a bacterias por pelos sexuales, es decir, tienen que ser F+. El ADN que entra a la bacteria se denomina positivo. Cuando el ADNcs entra en la bacteria tiene que sintetizar un ADNcd, es decir, la hebra complementaria a la cadena positiva. A esto se le llama forma replicativa, que se replica dentro de la bacteria por el método del círculo rodante, de forma que dentro de la bacteria se obtienen muchas formas replicativas. Al mismo tiempo que estas se replican también se transcriben genes, de forma que a mayor cantidad de copias del genoma vírico, mayor será la cantidad de proteínas virales dentro de la bacteria.

Entre estas proteínas está el producto del gen 5, que es una proteína con afinidad por unión al ADNcs, y llega un momento en que hay tanta cantidad del producto del gen 5 que la hebra positiva es secuestrada por es proteína y ya no se forma la hebra complementaria y solo queda ya la hebra positiva. Al mismo tiempo se transcriben otras proteínas como las de la cápsida del virus que se van hacia la membrana de la bacteria y se localizan allí. Ahora las partículas de hebra positiva con proteínas producto del gen 5 van hacia la membrana y salen por exocitosis.

En M13 no hay un límite de ADN que se encapsida. El genoma de M13 es de ADNcs de 6´4 kb, donde se encuentran distribuidos 10 genes con su origen de replicación. Para utilizarlo como vector de clonación tiene varios problemas:

1.- El genoma es tan compacto que no podemos quitar una región para insertar otra.

2.- Todos los genes son esenciales, y por tanto no se puede meter un inserto entre dos genes, solo se puede meter en la zona del Ori, sin afectar la secuencia o una región intergénica de pocos pares de bases entre el gen 3 y 8.

3.- No tiene sitios de clonación, habría que introducirlos.

Para usarlo como vector se han sacado genes esenciales y utilizan el vector con un virus ayudador, y se le ponen sitios de clonación. Con estos vectores obtenemos insertos de cadena simple y se pueden utilizar como sonda, por ejemplo: también se pueden aplicar en secuenciación, ya que el ADN que utiliza es ADN de cadena simple.

TEMA 9: INTRODUCCIÓN DE NUEVA INFORMACIÓN GENÉTICA EN BACTERIAS

• FORMAS DE ENTRADA DE ADN EN BACTERIAS

En bacterias de forma natural hay varios métodos por los que el ADN puede entrar dentro de ellas, y estos se engloban en tres tipos diferentes:

1.- Entrada de ADN desnudo dentro de la célula. Si solo entra ADN desnudo en la célula de otra célula se llama “transformación”. Si el ADN desnudo es viral se llama “transfección”, este tipo de ADN puede desencadenar una infección.

2.- Otro tipo de entrada de ADN implica el contacto físico entre las bacterias y el ADN pasa de una a otra y se llama “conjugación”. El ADN ya no es desnudo. Si en este proceso en vez de pasar ADN plasmídico pasa ADN cromosómico se llama “sexducción”.

3.- También puede entrar a través de partículas virales, en este caso se llama “transducción”. Hay dos formas:

• Generalizada; cualquier parte del genoma de una bacteria puede pasar a otra bacteria.

• Restringida; solo pasan unos determinados marcadores de una célula bacteriana a otra.

• TRANSFORMACIÓN

La transformación es la variación hereditaria de una célula bacteriana debida a la captación de ADN exógeno desnudo. Y un transformante es una célula que ha adquirido ADN mediante transformación.

Es un mecanismo que existe de forma natural en bacterias y que permite la entrada de fragmentos de ADN a través de las paredes celulares. Las bacterias capaces de captar ADN desnudo reciben el nombre de bacterias competentes.

1.- Transformación natural; hay especies que son competentes de forma natural. Según sean Gram + o Gram - usan un mecanismo u otro.

La transformación también se puede inducir de forma artificial:

2.- Transformación inducida químicamente; se incuban las células que queremos con cationes divalentes como cloruro de calcio o de aluminio. Las bacterias alteran su pared celular y si los incubamos con el ADN y los sometemos a un choque térmico, el ADN entra dentro de la célula.

3.- Transformación inducida enzimáticamente; tratando a las bacterias con lisozimas y EDTA en un medio isotónico. El enzima degrada la pared de la bacteria y obtenemos esferoplastos, que son células carentes de la mayor parte de su pared celular, capaces de adquirir ADN del medio. Tras la entrada de ADN y regeneración de la pared celular se obtienen transformantes.

4.- Transformación inducida físicamente; mediante electroporación. Sometiendo a las bacterias a descargas eléctricas, se le abren unos poros transitorios en la membrana y el ADN puede entrar dentro de la bacteria.

La utilización de un método u otro va a depender del tipo de bacterias con las que se trabaja.

• CONJUGACIÓN

Se requiere el contacto físico entre las bacterias donadoras y las receptoras. Las bacterias donadoras establecen contacto con las receptoras mediante un pelo sexual que las receptoras no poseen.

Todo esto se por una serie de genes codificados por el plásmido conjugativo, de manera que la bacteria donadora lleva ese plásmido conjugativo y puede transferir la información a la bacteria receptora. Constituye un problema, porque queremos que el ADN se quede en nuestra célula hospedadora y no pase a otra. Además se trabaja con bacterias que llevan diferentes clones.

Es muy importante que las bacterias que se utilicen como células hospedadoras no lleven plásmidos conjugativos.

• TRANSDUCCIÓN

Es la transferencia de ADN bacteriano de una célula a otra debido a la infección causada por un bacteriófago, portador de dicho ADN. Hay dos tipos, la transducción generalizada y la transducción restringida.

• TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA.

Los fagos empaquetan accidentalmente ADN bacteriano, y estas partículas portadoras de ADN bacteriano son capaces de infectar otras células, aunque no serán capaces de producir ninguna progenie (dado que en la cápsida no hay ADN del fago). Al introducir el ADN bacteriano dentro de otra célula, éste puede recombinar con el ADN endógeno.

La frecuencia de transducción generalizada es baja e idéntica para cualquier gen del genoma de la célula donadora.

• TRANSDUCCIÓN RESTRINGIDA.

Este tipo de transducción requiere que el fago haya seguido un ciclo lisogénico dentro de la bacteria donadora. Es debida a un error en la escisión previa al empaquetamiento. En esta tan solo se transfieren genes bacterianos próximos al sitio de inserción del fago. Después del empaquetamiento la cápsida contiene tanto ADN bacteriano como ADN del fago.

Con este tipo de transducción se puede empaquetar el ADN recombinante en una cápsula viral y utilizamos su mecanismo de infección para inyectar el ADN recombinante dentro de la bacteria.

Es un método más eficiente que la transformación, del orden de 100 veces más eficiente.

TEMA 10: SELECCIÓN DE RECOMBINANTES

• INTRODUCCIÓN

Los métodos que se utilizan para identificar los insertos dependen de la estrategia y del vector que hemos seguido.

En la búsqueda del ADN recombinante hay que emplear una propiedad específica de nuestro inserto que puede ser o bien su secuencia o su función. Esto nos lleva a establecer dos métodos diferentes:

1.- Métodos basados en la secuencia del inserto.

2.- Métodos basados en el producto de expresión del inserto.

• MÉTODOS BASADOS EN LA SECUENCIA DEL INSERTO

Necesitamos conocer la secuencia del inserto. Este tipo de métodos no requieren la expresión del inserto, y es aplicable a cualquier tipo de secuencia, no necesitamos que esta secuencia codifique para una proteína.

Conociendo una parte de la secuencia del inserto podemos fabricar una sonda para encontrar el inserto. Pueden ser ADN o ARN simples o dobles, marcados en caliente (32P) o en frío (biotina, digoxigenina o fluoresceína), las sondas bicatenarias deben desnaturalizarse antes de su empleo en la hibridación, y deben tener una longitud mínima de 20 nucleótidos. Según el experimento de clonación se pueden obtener de bandas de ADN aisladas de geles de agarosa (repetitivos), productos de PCR, de ARNm obtenido a partir de tejidos (elevada expresión del gen de interés), de insertos clonados (genes conservados en distintas especies), o por síntesis química (a partir de la secuencia de aminoácidos).

Una vez conseguida la sonda se debe marcar, y para esto hay diferentes métodos:

• Traslado de la muesca (Nick-translation).

• Primado al azar (Random priming).

• Adición de colas marcadas en 3´ (Oligonucleotide tailing).

• Marcaje en 3´ (3´ End-filling).

• Marcaje en 5´ (5´ End-labeling).

• Marcaje por PCR.

• Marcaje por transcripción in vitro.

Si no tenemos idea de la secuencia pero si conocemos algo de la secuencia de aminoácidos, de aquí podemos conocer la secuencia de nucleótidos, pero como el código genético es degenerado se utilizan sondas degeneradas, poblaciones de diferentes sondas que incluyen todas las secuencias posibles que codifican para una determinada secuencia de aminoácidos. Con esto nos aseguramos tener la secuencia de la sonda que buscamos. Aumenta la posibilidad de obtener falsos positivos.

Ahora necesitamos buscar nuestro clon recombinante en la genoteca. Hay que hacer una réplica de la genoteca en filtro (filtro de nitrocelulosa), es un filtro que tiene situadas las colonias en la misma posición que en la placa. El filtro tendrá condiciones desnaturalizantes para lisar bacterias y para que el ADN se desnaturalice.

Se hibrida con la sonda y se revela para saber donde está la sonda.

Hay veces que hacer replicación en filtro no resulta conveniente y se hace transferencia individual de colonias. Se cogen las colonias que llevan el inserto, se siembran en placas y después se hace lo mismo o se hace la transferencia individual a un filtro cuando hay pocas colonias.

• Métodos basados en la secuencia del inserto: Hibridación diferencial.

En este caso no conocemos la secuencia del gen que buscamos.

Tenemos un cultivo creciendo en condiciones normales, cuando le añadimos una sustancia X, estas células, por ejemplo, empiezan a dividirse mucho. Este puede ser debido a que esta sustancia X induzca los genes que inician la proliferación y están implicados en esta. No sabemos nada de su secuencia.

Extraemos el ARNm en las dos situaciones, en los que están inducidos por X habrá además de los ARNm normales, los que son inducidos por X. Y en las células no inducidas estarán los ARNm normales debidos a procesos básicos.

A partir de la población X de ARNm se hace la síntesis de ADN complementario y a partir de este hacemos una genoteca. De esta genoteca hacemos dos replicas, a cada un de estas las hibridamos con dos sondas diferentes.

De los ARNm de la placa X se hace la síntesis de la primera hebra con oligo-dT con la reversa transcriptasa y dNTPs*. Si aumenta el pH el ARN se degrada y tenemos hebras de ADN marcadas, sería la sonda A.

Con los ARNm de la placa que no lleva la sustancia X, se hace lo mismo, y tenemos la sonda B.

La sonda A la hibrido con una de las réplicas y la B con otra de las réplicas.

En el caso de la sonda A todos los clones están marcados, y en la B los que no nos interesan se marcan. Buscamos clones positivos con A y negativos con B. De la primera placa se pican esas colonias que no están marcadas y se siembran en una placa.

• MÉTODOS BASADOS EN EL PRODUCTO DE EXPRESIÓN DEL GEN CLONADO

Necesitamos que el inserto se exprese. Se pueden clasificar en dos tipos:

• Métodos genéticos o de complementación.

Son los más rápidos y sencillos. Necesitamos que el inserto se exprese y que esta expresión de lugar a un fenotipo observable y que la célula hospedadora se defectiva para este fenotipo y compatible con el.

Este tipo de métodos se suelen utilizar cuando estamos clonando genes implicado en vías biosintéticas. Genoteca con el genómico de la bacteria y seleccionamos las bacterias que sean capaces de crecer en un medio selectivo (que queramos nosotros).

• Métodos inmunológicos.

Hace falta que se exprese el inserto, pero no se necesita que sea un fenotipo observable. Lo que necesitamos para observar nuestro producto es un ácido, no necesitamos que la bacteria sea compatible con el gen que buscamos.

Tenemos placas con genoteca, se hibrida con un filtro (ahora buscamos proteínas en vez de ácidos nucleicos). Sobre este filtro detectamos las proteínas y lo incubamos con un ácido que reconozca de forma específica las proteínas que estamos buscando.

Se incuban luego con un ácido secundario que suele ir unido a un enzima y detectamos su presencia mediante la acción de enzimas.

Necesitamos un anticuerpo específico frente a la proteína que se busca.

Basados en Western-Blot:

• Extracción de proteínas a partir de los clones.

• Electroforesis en gel de acrilamida.

• Transferencia a soporte sólido: Western-Blot.

• Hibridación con el anticuerpo específico.

• Detección del anticuerpo secundario y revelado.

TEMA 11: ESTRATEGIAS DE CLONACIÓN: GENOTECAS

• INTRODUCCIÓN

Una genoteca es un conjunto de clones. Estos proporcionan información sobre un fragmento de ADN. Hay de varios tipos:

1.- Las genotecas genómicas, pueden ser de dos tipos:

• Totales; si está representando todo el genoma de un organismo. Conjunto de clones que lleva toda la información de un organismo.

• Parciales; es un conjunto de clones que llevan la información de una parte del genoma.

2.- Genotecas de ADN complementario (ADNc); conjunto de clones que nos da toda la información referente a los genes que se están expresando en un determinado tejido, línea celular o células en un determinado momento.

3.- Genotecas sustractivas; conjunto de clones que llevan la información de todos los genes que se expresan de forma diferencial en una determinada situación.

• GENOTECAS GENÓMICAS

El primer paso es el aislamiento del ADN de partida, que puede ser:

.- ADN genómico total.

.- Conjunto de fragmentos de un determinado tamaño (gel).

.- ADN de orgánulos.

.- ADN de uno o varios cromosomas.

El siguiente paso es la fragmentación aleatoria del ADN, puede ser de dos tipos:

1.- Rotura física del ADN; se rompe de forma aleatoria en diferentes puntos, suele dejar extremos romos, por eso se trata para generar extremos cohesivos.

2.- Digestión con endonucleasas de restricción; pero que no sean totales ya que no se obtienen fragmentos solapantes. Deben ser parciales simples o parciales dobles, y se da fraccionamiento por tamaño.

Después sea aíslan los fragmentos deseados (por rango de tamaño), y se ligan con el vector previamente digerido con enzimas compatibles.

El tamaño de una genoteca depende del tamaño del genoma del organismo del que vamos a hacer la genoteca. También del tamaño del inserto, cuanto más pequeño sea, mayor es el tamaño de la genoteca, porque tiene mayor número de clones. En función del tamaño del inserto decidimos que vectores vamos a utilizar, normalmente derivados de lambda o en cósmidos.

Para saber cual es el número de clones adecuado para tener una buena probabilidad de encontrar el inserto deseado, tenemos la siguiente fórmula:

N = ln(1-P)/ln(1-f)

N = número de clones

P = probabilidad de encontrar el inserto deseado

f = fracción del genoma en un inserto. Longitud media del inserto/Longitud del genoma

• Análisis de una genoteca.

Buscamos una sonda del fragmento que estamos buscando y rastreamos la genoteca.

Una vez que tenemos el inserto si es muy grande se subclona. Se clona cada uno de ellos por separado. Hay que encontrar genes que se encuentren próximos a una secuencia conocida, haciendo un paseo cromosómico, que permite que de una secuencia dada podamos secuenciar genes que están cerca.

Para hacer un paseo cromosómico se hace una digestión parcial de nuestras moléculas de ADN para obtener más información. Partimos de una genoteca del ADN de un organismo. Necesitamos un punto de partida (secuencia conocida), que es la sonda. Se rastrea la genoteca y nos encontraremos los genes de la secuencia (sonda) y los genes que estén a su alrededor (clones). Se coge el inserto de esos clones, se secuencian y después alineamos la secuencia obtenida. Se coge un extremo de la secuencia conocida (de la secuencia obtenida), sintetizamos una sonda y sacamos los clones positivos que serán diferentes a los anteriores, se secuencian y se alinean. De esta manera, caminando por el cromosoma se podrá ir avanzando en la caracterización de una gran región. Para saber donde está el gen se van analizando puntos de inicio de transcripción, etc., mediante sistemas informáticos.

El paseo cromosómico presenta problemas:

1.- Saber en que dirección estamos paseando. Para hermanos y especies como modelo de investigación, hay mapas en los que se indican diferentes marcadores, en cada uno de los cromosomas (polimorfismos, etc.). Para una misma especie todos los cromosomas tienen las mismas marcas.

2.- El ADN es repetitivo, hay secuencias repetidas en el genoma y se encuentran dispersas por el genoma. Si hacemos una genoteca estas secuencias se encuentran también en ella. Si hacemos una sonda para esa secuencia tendremos fragmentos de todos los cromosomas y no nos sirven para poder encontrar el gen.

3.- Son muy lentos.

Para poder resolver el problema del ADN repetitivo hay técnicas como el salto cromosómico.

En el salto cromosómico para poder secuenciar un genoma, cuanto mayor sea el inserto, antes se secuencia, pero el tamaño del inserto es limitado. Vamos a crear insertos que sean iguales a los de 500 kb. Cortamos el ADN en fragmentos de 500 kb., los ligamos a un vector que lleva un gen marcador formado por un gen supresor de un codón de parada (lo demás no es importante). Tenemos el vector más 500 kb de insertos, esto es imposible que entre en una célula, por lo que cortamos con una endonucleasa que corte en el inserto, pero va en el vector. En nuestro vector lo más probable es que se haya quedado unido un fragmento de ese ADN del inserto. Con esto formamos un vector que tiene el vector y los dos fragmentos de los extremos de nuestro inserto, así nos ahorramos meter 500 kb. Hacemos un vector con eso y con un vector derivado de lambda. Utilizamos bacterias normales, sin genes supresores y que lleven solamente el vector con el gen supresor del codón y los extremos del inserto. Si entra eso en la bacteria dan una infección predictiva, da una calva. Si no llevan el gen supresor no hacen nada a la bacteria, porque el vector derivado de lambda tiene inactivados los genes supresores y no dan lugar a la muerte de la bacteria. Todas las calvas llevan fragmentos de ADN del mismo inserto pero que están separadas en realidad por 500 kb. Lo que obtenemos al final es un genoteca a saltos. Por si mismas no sirven para hacer un paseo cromosómico, pero si sirven por si vamos paseando y podemos dar un salto.

Para dar un salto cogemos una sonda de los fragmentos que vamos analizando y la llevamos a la genoteca a salto, y la sonda hibrida con uno de los clones y dependiendo del trozo que hibrida se coge el otro y se utiliza como sonda. Por ejemplo, tenemos la sonda hibridada con X, cogemos el trozo Y y le hacemos una sonda. Esta sonda la hibridamos con nuestro ADN estudiado y hemos dado un salto de 500 kb (los fragmentos son de diferente tamaño, no de 500 kb.).

• Genoteca parcial.

Se lleva información sobre una parte del genoma, por ejemplo información sobre un único cromosoma, se puede hacer por citometría de flujo, hay que marcar.

Pueden ser:

1.- Genoteca parcial cromosómica; separamos los cromosomas y cogemos uno. Tenemos información sobre ese cromosoma.

2.- Genoteca parcial con un determinado tamaño; mediante electroforesis.

La cromosómica se puede hacer por diferentes formas, por citometría de flujo, por nidodisección.

• GENOTECAS DE ADN COMPLEMENTARIO

Se diferencia de las genómicas en:

1.- El material de partida en estas es el ARN, que pasa a ADNc. Esto tiene como consecuencia que en los genes de una genoteca de ADNc no está representado todo el ADN del organismo, sino solo las secuencias codificantes.

2.- No están representados todos los cromosomas.

3.- Las secuencias de ADNc son diferentes unas de otras dependiendo del tejido de partida y de diferentes momentos y diferentes condiciones.

Las utilidades de estas genotecas son las siguientes:

1.- Estudiar la regulación de la expresión génica.

2.- Maduraciones alternativas del mensajero, donde están los intrones y los exones.

3.- Estudio de diferentes procesos que tienen lugar durante el desarrollo, ya que se sabe cuales son los genes que se expresan durante el desarrollo embrionario.

• Síntesis del ADN complementario.

Con un fenol ácido se hace una extracción de ARN total (ARNm, ARNt, ARNr, …). Dos ARNm son normalmente los que nos interesan. Se utilizan métodos que nos permitan eliminar el resto de ARN. La mayoría de ARNm tienen una cola de poliA.

El método principal se basa en el empleo de poliT unido a una matriz de nitrocelulosa. Se pasa el ARN total por esa columna y únicamente los ARNm que lleven una cola de poliA quedarán retenidos en la matriz. Se hace una serie de lavados y después se emplean condiciones desnaturalizantes para que el ARNm se separe y salga de la columna.

Otros métodos utilizan partículas magnéticas unidas a oligo-dT, y se mezcla el ARN total con esta solución. Los ARNm con cola de poliA se unen a los oligo-dT. Se introducen en un aparato que lleva un imán en uno de los lados y arrastran las partículas magnéticas junto con los ARNm unidos a los oligo-dT. Se tira la solución y se hacen varios lavados. Después se ponen en condiciones desnaturalizantes para separar el ARNm de la partícula magnética. Se vuelve a poner el imán para que las partículas magnéticas se separen de ARNm y lo recogemos.

Tras este paso hacemos la síntesis de ADNc, en dos pasos:

1.- Síntesis de la primera hebra; síntesis de una hebra de ADN complementario al ARN de partida. Lo más simple es pone un oligo-dT que se une a la cola de poliA, enzimas retrotranscriptasas y los nucleótidos (dNTPs). La retrotranscriptasa sintetiza la cadena de ADN en dirección 5´ 3´. También podemos utilizar una mezcla de hexanucleótidos aleatorios. Se pueden quedar unidos a cualquier zona y la retrotranscriptasa sintetiza la cadena de ADNc. Esto es ventajoso cuando los ARNm son demasiado largos porque la rerotranscriptasa no es un enzima demasiado activa y cuando llega a un punto se para, haya terminado o no.

2.- Síntesis de la segunda hebra; sintetizar la hebra complementaria a la primera en forma de ADN. Hay dos métodos:

• Empleo de la ARNasa H y ADN polimerasa y dNTPs. La ARNasa H degrada híbridos de ARN-ADN, corta la cadena de ARN y deja la molécula de ARN que sirve de cebador a la ADN polimerasa que sintetiza la molécula de ADN complementaria. Con su actividad exonucleasa 3´ 5´, quita el ARN.

• Empleo de la transferasa terminal y de la ADN polimerasa. Se incuba con la transferesa terminal y con un oligo-dCTP por ejemplo, y se pone una cola de poliC en el extremo 3´ de la cadena de ADN. Se hidroliza el ARN (se puede hacer de diferentes formas). Colocan un oligo-dGTP más una ADN polimerasa. El dGTP aparearía con el dCTP y la ADN polimerasa se une a ese fragmento de poliG y sintetiza la segunda hebra. En el medio ponemos también dNTPs.

• Clonación del ADN complementario.

El ADNc va a tener extremos romos. Normalmente la clonación de esta indicará la creación de extremos cohesivos. Para ligamiento con el vector podemos usar colas homopoliméricas, linkers o adaptadores. Las colas homopoliméricas no son muy buenas, porque nos pueden alterar las lecturas, porque no controlamos la longitud y la expresión del inserto, no suele ser viable.

Nos interesa controlar la orientación del inserto, una estrategia es cuando ponemos el oligo-dT, puede ser uno especial que lleve una secuencia diana de una endonucleasa de restricción (no afecta al proceso). Sintetizamos la segunda hebra y también se sintetiza el fragmento de la secuencia diana. A esta molécula si se le puede poner linkers o lo que queramos. Si ponemos los linkers y corto con uno o con dos tengo dos extremos diferentes.

• GENOTECAS SUSTRACTIVAS

Se pueden considerar también como un tipo de ADNc. Contienen genes que se expresan de forma diferencial en una situación.

Estamos estudiando, por ejemplo, una sustancia que produce cáncer, estudiamos los genes que se expresan cuando está esta sustancia y los que se expresan cuando no está o los que no se expresan.

Se extraen los ARNm de las dos situaciones. En la situación X nos deshacemos del ARN. Se hibridan las dos poblaciones. Los mensajeros que hibridan son los que están en las dos situaciones.

Lo que nos interesa no lleva biotina (ADN que no ha hibridado). Se utiliza estreptarilina, que tiene afinidad con la biotina. Se unen y arrastran la primera hebra que se había unido a la biotina. La estreptarilina está unida a una partícula magnética, con un imán nos llevamos todas las partículas magnéticas y nos quedan sueltos los ADN que nos interesan.

TEMA 12: AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN VITRO

• INTRODUCCIÓN

Se necesita gran cantidad del material de partida (ADN y/o ARN) para cualquier tipo de manipulación in vitro.

Hasta el descubrimiento de la PCR la única forma de obtener una gran cantidad de material genético era mediante la clonación.

Desde la aparición de la PCR se han desarrollado otras técnicas que permiten la amplificación de ácidos nucleicos in vitro (NASBA, LIGASE CHAIN REACTION).

Todo esto tuvo una gran repercusión.

• FUNDAMENTO DE LA PCR

La PCR es un método enzimático que permite sintetizar numerosas copias de un fragmento concreto de ADN. Utiliza como cebadores dos oligonucleótidos complementarios a lo que serán los extremos del producto y colocados con sus terminales 3´OH enfrentados. Lo que se amplifica es el ADN comprendido entre ambos oligos. La sucesión de una serie de ciclos en los que tiene lugar la desnaturalización del molde, hibridación con los cebadores y extensión de la síntesis por acción de la ADN polimerasa, origina una acumulación exponencial de fragmentos específicos cuyos extremos estarán definidos por los extremos 5´ de los cebadores. Al poder ser utilizados los productos de un ciclo como moldes del ciclo siguiente, el número de copias de ADN, se dobla en cada ciclo. Así pues, 30 ciclos de PCR producen una amplificación de un millón de veces aproximadamente.

Las polimerasas que se emplean son termorresistentes para no tener que añadir la enzima manualmente en cada ciclo. La purificada de la bacteria Thermus aquaticus (Taq) es una de las más utilizadas, pero carece de actividad correctora de errores (exonucleasa 3´ 5´), por lo que puede introducir aproximadamente un nucleótido equivocado por cada 1000 colocados a concentraciones altas de magnesio y uno por cada 1000000 colocados, en otras condiciones. Este índice de error no suele presentar problemas en la mayoría de las aplicaciones, pero ha de tenerse en cuenta y la magnitud de la equivocación puede ser importante si ocurre en las primeras rondas. Otras polimerasas, como la obtenida de Pyrococcus furiosus (Pfu) o la aislada de la bacteria Thermococcus litorales que se encontró en la ventana de ventilación de un submarino (Vent), incorporan errores con una frecuencia mucho más baja y pueden copiar fragmentos de mayor longitud que la Taq.

Para que la especificad sea máxima, se debe evitar que la polimerasa y el resto de los componentes estén a temperatura ambiente antes de iniciar el primer ciclo. La polimerasa puede también añadirse una vez que se ha producido la primera desnaturalización del ADN o incluso mejor, para no tener que manipular los tubos una vez iniciado el proceso, se pueden añadir anticuerpos anti-Taq, que inhibirán la actividad de la polimerasa hasta que se desnaturalicen por calor. La amplificación de las secuencias requiere cambios rápidos de temperatura, el proceso se realiza en un termociclador que lleva un microprocesador para programar estos cambios y el número de ciclos deseado.

• CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR

La reacción de amplificación por PCR produce material suficiente para muchas aplicaciones analíticas, pero cuando se necesitan cantidades aún mayores del producto, o cuando éste va a ser objeto de manipulación adicional, es necesario proceder a su clonación, lo que no siempre es una tarea sencilla.

Aunque, en teoría, los productos de la reacción son moléculas de doble hebra con terminales romos, éstas abundan muy poco en la mezcla final, quizá como resultado de la actividad de la polimerasa que, con frecuencia, incorpora algún nucleótido adicional en el extremo 3´ de la hebra copiada. Esto requiere la introducción de una etapa de retoque del producto antes de intentar su clonación, por ejemplo mediante incubación con la ADN polimerasa Klenow o con la de T4 en presencia de los cuatro dNTPs; gracias a sus actividades exo 3´ 5´ y polimerasa 5´ 3´, estas enzimas son capaces de recortar los extremos 3´ protuberantes y generar terminales romos.

A continuación ha de procederse a la separación del exceso de cebadores y del producto de la reacción, mediante electroforesis en gel de agarosa y extracción de banda. Las moléculas de ADN así purificadas pueden ligarse a un vector en forma lineal y con extremos romos. Es importante tener en cuenta que los oligonucleótidos preparados por síntesis química resultan con sus dos extremos, el 5´ y el 3´, con un OH libre, sin fosfato. Los cebadores sintéticos construidos por este sistema y utilizados en la reacción de PCR no llevan fosfato en sus extremos, por lo que los productos de amplificación son moléculas de dsADN desfosforiladas. En el caso de que se pretenda su clonación, debe utilizarse, imprescindiblemente, un vector con extremos fosforilados. Si se quiere desfosforilar el vector lineal para impedir su recircularización, es necesario proceder a la fosforilación del producto de PCR mediante la inclusión de un tratamiento con polinucleótido-quinasa.

En el caso de la polimerasa Taq, el error más frecuente se da en la etapa de polimerización, y se concreta en la adición de un nucleótido extra de adenina, lo que crea moléculas bicatenarias con un terminal 3´ protuberante integrado por una única A. Se han construido y comercializado vectores, en forma lineal, que tratan de aprovechar este hecho presentando terminales con un nucleótido de timina que sobresale de los extremos 3´, con el fin de facilitar la clonación de los productos de PCR.

Una alternativa a las soluciones anteriores es el uso de cebadores que incluyen alguna diana de restricción, con lo que los productos amplificados pueden ser digeridos y posteriormente clonados en un vector con extremos compatibles.

• ALGUNAS VARIACIONES DE LA PCR

• Amplificación de ARN: retro PCR.

La amplificación de ARNm se puede realizar en un solo tubo de ensayo de dos maneras diferentes.

Uno de los métodos consiste en poner las dos polimerasas (transcriptasa inversa y ADN polimerasa termorresistente) desde el comienzo en el mismo tubo, junto con los cebadores de ambos extremos, desoxinucleótidos y sulfato de magnesio. En un principio, durante unos 45 minutos y 48ºC se sintetiza la primera hebra del ADNc copia del ARNm; a continuación se sube la temperatura a 94ºC durante 2 minutos, con lo que se desnaturaliza el molde, sintetizándose seguidamente la segunda hebra del ADNc y las múltiples copias de ambas hebras durante 40 ciclos.

El segundo método utiliza una ADN polimerasa termorresistente que posee además actividad transcriptasa inversa. Es la polimerasa Tth que se aisló de la eubacteria termofílica Thermus thermophilus. Amplifica bien ARNm de hasta 1 kb.

Una variante es la utilización de un oligonucleótido específico dentro del gen y otro inespecífico, con lo que se amplifica no sólo la región codificante de un ARNm, sino también, en muchos casos, la región no traducible 5´ o 3´ del mensajero.

• Generación de ADNcs: PCR asimétrica.

Es esta una variante que nos permite generar un gran número de moléculas de ADN de banda simple que se pueden utilizar directamente para secuenciar o como sondas para hibridaciones. El método consiste en poner diferente proporción de los dos oligocebadores de manera que uno esté a concentración limitante. Así, los 20-25 primeros ciclos amplifican las dos hebras del ADN, pero al agotarse uno de los cebadores, los 5-10 ciclos siguientes serán de ADN de banda simple.

• Búsqueda de zonas flanqueantes: PCR inversa.

La PCR inversa nos permite amplificar secuencias desconocidas vecinas a secuencias genómicas conocidas. Imaginemos que queremos aislar las secuencias adyacentes al lugar donde un retrovirus se ha insertado. Tomaremos ADN genómico y lo trataremos con una enzima de restricción cualquiera, Hind III, por ejemplo, y permitiremos la formación de círculos por complementariedad de los extremos cohesivos. Utilizaremos como cebadores dos secuencias de la región conocida, pero cuyos extremos 3´OH se dirijan hacia el exterior de la molécula conocida. Así se amplificará un fragmento que al ser tratado con la diana Hind, nos liberará dos fragmentos que representarán las secuencias anteriores y posteriores al gen concreto. La misma técnica nos permitiría amplifica cualquier región reguladora flanqueante de un gen cuya secuencia sea conocida.

• APLICACIONES DE LA PCR

1.- Producción de grandes cantidades de fragmentos de ADN concretos

2.- Marcaje de sondas.

3.- Secuenciación del ADN.

4.- Diagnóstico de enfermedades genéticas.

5.- Detección de partículas infecciosas.

6.- Diagnóstico prenatal.

7.- Medicina forense, identificación.

8.- Cuantificación (PCR cuantitativa en tiempo real).

9.- Cálculos de porcentaje de recombinación en células germinales.

10.- Amplificación de genes con expresión diferencial.

TEMA 13: MUTAGÉNESIS IN VITRO

• INTRODUCCIÓN

Para encontrar genes mutantes se estudiaba el individuo con el mutágeno se buscaban los fenotipos mutantes y se encontraba el gen y la función.

En ingeniería genética se estudia el gen, se hace un clon, lo mutamos y se estudia la alteración que se produce cuando lo mutamos y podremos deducir cual es la función de este gen.

Hay dos tipos de métodos para hacer mutagénesis:

1.- Método aleatorio; introducimos mutaciones al azar en una determinada secuencia de ADN y no podemos decidir ni la posición de la mutación ni el tipo.

2.- Métodos dirigidos; introducir la alteración que se quiera en el sitio que se quiera.

• METODOS ALEATORIOS

• METODOS ALEATORIOS POR INTRODUCCION DE DELECCIONES.

Inducimos una deleción en nuestra secuencia, se corta con una o dos endonucleasas de restricción, quitar el fragmento y se vuelve a ligar. Se corta con una endonucleasa de restricción que haga un solo corte y tratar después con nucleasa. Se para la reacción y luego se liga. Se trata con ADNasa I, se introducen cortes aleatorios con manganeso. Tratamos con nucleasas y luego ligamos.

• METODOS ALEATORIOS POR INSERCION.

Se trata con endonucleasa de restricción y el vector con el inserto linealizado se liga con un oligonucleótido de cadena doble.

Se trata con una endonucleasa de restricción que genere extremos cohesivos, en concreto extremos 5´ prominentes, se rellenan los extremos y se ligan.

• METODOS ALEATORIOS POR MUTACIONES PUNTUALES.

1.- Métodos químicos.

Por sustitución; se necesita una molécula de ADN, se puede conseguir por vectores MB. Otros métodos son:

* Tratar el vector con bromuro de etidio y se corta con enzimas de restricción. Cuando el ADN está con bromuro de etidio la enzima de restricción reconoce esa secuencia pero sólo corta una hebra. Si tratamos con una exonucleasa 3´ elimina la cadena. También se puede utilizar cualquier polimerasa con actividad exonucleasa 3´ 5´ y sin poner nucleótidos en el medio.

* Tratamiento con bisulfito sódico, induce la desaminación de la citosina y se transforma en uracilo. Si tratamos con bisulfito sódico y luego hacemos la síntesis de la cadena de ADN complementaria. Tenemos sustituciones CG y UA.

2.- Métodos enzimáticos.

Generan ADN de cadena sencilla, rellenan el hueco, síntetiza ADN al ir sintetizando se van introduciendo las mutaciones.

Utilizando su polimerasa sin actividad correctora (sin exonucleasica 3´ 5´).

Utilizar polimerasa con -tio-dNTPs, nucleótidos, que en la posición  no llevan fósforo sino un azufre. Una vez que se incorporan si se han incorporado mal la polimerasa ya no lo puede corregir.

Utilizar polimerasa junto con análogos de nucleótidos, por ejemplo el 4-hidroxicitosina, aparea tanto con la A como con la G, el que aparea con una forma o con otra depende de la forma del análogo que tiene dos formas imino que aparea con A y la amino con G. Este análogo es de dTTP. Si se aparea con una G es porque esta en la forma amino y se introduce la mutación en la siguiente réplica porque es un análogo de la T y pondría una A.

Después de hacer estos métodos se saca el inserto y se vuelve a meter en otro vector porque el primer vector puede que se haya mutado también y ya no nos funciona. Se vuelve a meter en la célula hospedadora, obtenemos una especie de genoteca de mutaciones.

• METODOS DIRIGIDOS

Una mutación en un punto concreto en una secuencia concreta, con mutagénesis con oligos de secuencia definida.

Partimos de ADN de cadena sencilla. Hacemos un oligo complementario a la secuencia en la que se encuentra el punto exacto donde queremos hacer la mutación y en el oligo ese punto lo cambiamos para introducir esta mutación.

Podemos introducir deleciones e inserciones. Una vez que se produce la mutación sintetizamos la hebra complementaria.

Introducir en las células hospedadoras. Seleccionan los mutantes, se hace una búsqueda utilizando como sonda el oligo con la mutación. Cuando la célula hospedadora se divida tendremos la mitad de los clones normales y la otra mitad mutantes.

Lisamos las bacterias, hibridazos con la sonda, si hacemos esto la sonda se pega a todos porque la diferencia es sólo de un nucleótido.

Vamos subiendo paulatinamente la temperatura, pasado un tiempo. La temperatura en la que el oligo tenga un 100% de su hibridación. Por debajo de esta son todas positivas, porque se une el oligo de forma menos específica. Si aumenta la temperatura van quedando los que tengan mayor homología con el oligo hasta quedar los que sean 100% homólogos. En esta temperatura los que son positivos se quedan y los que son negativos ya no se ven.

En realidad la frecuencia de plásmidos mutantes no es el 50% es mas bajo. Una de las veces por la que la frecuencia es tan baja es por fallos en el propio proceso, si la síntesis no se completa es porque a la polimerasa no le da tiempo a llegar al final. No todas las moléculas son de cadena doble, la solución es la purificación de las hebras de la cadena doble mediante electroforesis. Utilizamos las moléculas complementarias para introducirlas en células. También puede ocurrir que la polimerasa acabe su actividad y corrija la mutación, la solución es utilizar polimerasa sin actividad exonucleasa 3´ 5´.

A pesar de estas soluciones el proceso sigue siendo poco eficiente.

Al introducirlo en la bacteria esta quita una de las dos bases, la que está mutada o la que no está mutada.

Por esto hay que engañar a la bacteria para que corrija la hebra antigua y no la mutada. Hay dos métodos para conseguir esto:

1.- Utilizar el ADN de cadena sencilla que queremos que corrija se obtiene de una bacteria que sea dNTPasa-, dUT-, Ung-. La dNTPasa es la enzima que degrada el dUTP. Si la bacteria es dUTPasa- la concentración de dUTP aumenta. La uracil glicosilasa corta U que estén en el ADN y repara. Si la bacteria es uracil glicosilasa- su ADN tiene U. esta bacteria tendrá mucho U en su ADN. Si introducimos está hebra en la célula hospedadora con nuestra cadena de ADN con el oligo (mutación). La bacteria si es uracil glicosilasa+ por lo que quita los U y utiliza como molde la hebra de fuera que es la que lleva nuestra mutación.

2.- Hacer la síntesis del ADN de cadena doblo utilizando -tio-dNTPs. Tratamos con endonucleasas de restricción que corta en la hebra antigua, después se trata con una exonucleasa que quita bastante de esta hebra y después sintetizamos esta hebra otra vez y le introducimos la mutación. Después lo metemos en la célula hospedadora.

* Mutagénesis de cassette; queremos cambiar una secuencia concreta. Se corta a ambos lados de la secuencia. Por síntesis química se hace una hebra, luego la otra y se unen, se aparean porque son complementarias y se introduce en el hueco.

* Mutagénesis por PCR; queremos hacer una mutación en un punto concreto sintetizamos un cebador con la mutación y el otro con la secuencia normal. Las hebras mutadas aumentan progresivamente su número. Obtenemos muchas copias de nuestro inserto mutado. Para poder poner la mutación en mitad de un gen hacemos dos PCR diferentes introduciendo el cebador 1 y el 2 en un caso y el 3 y 4 en otro caso. Hacemos una PCR que contenga los dos fragmentos que obtenemos con los cebadores 1 y 4. Al hacer PCR A complementa con D y B con C. puede aparear A-B, A-D, C-D y C-B. El primer ciclo con la polimerasa la unión A-D se sintetiza la molécula de ADN de cadena doble. El segundo ciclo tenemos la hebra entera con la mutación en medio y la polimerasa hace moléculas igual a esta. Además de eso también se siguen sintetizando más moléculas B y C. B dará lugar a A y C dará lugar a D.

TEMA 14: MANIPULACION GENETICA EN MAMIFEROS

• INTRODUCCIÓN

Normalmente cuando clonamos mamíferos partimos del gen de interés que ya va a estar clonado porque si queremos clonar se hace en procariotas, si queremos estudiar su efecto entonces utilizamos eucariotas.

Ya tenemos el clon, lo manipulamos y después lo introducimos en la célula hospedadora o en el organismo hospedador y observamos su fenotipo.

En mamíferos la transformación hace referencia al proceso por el que una célula normal se transforma en una célula en la que no hay un control sobre el ciclo celular y se divide de forma indiscriminada.

Para la entrada de ADN extracelular es por transfección independientemente de cómo entre.

• MANIPULACION GENETICA DE CELULAS

La célula hospedadora es eucariota. Pueden proceder bien de cultivos primarios (tenemos tejido, lo disgregamos y lo cultivamos), o cultivos secundarios (a partir de los primarios). Al final las células acaban uniéndose porque el número de divisiones de una célula está contado. Se divide un número concreto de veces. Por lo que sólo se hacen periodos cortos.

También utilizan líneas celulares, células transformadoras en las que no hay un control normal del proceso de división celular, se dividen de forma indefinida como las células cancerosas.

Las líneas celulares no son homogéneas (esto es un problema). Porque los genes se dividen o se duplican, etc., y la información genética será diferente dando resultados diferentes.

• METODOS DE TRANSFECCION

Se pueden clasificar atendiendo a:

1.- Estabilidad del ADN dentro de la célula cuando ha entrado:

• Método de transfección transitoria; el ADN dentro de la célula acaba perdiéndose.

• Método de transfección permanente; el ADN si se queda dentro de la célula hospedadora de forma estable.

2.- Si utilizamos una partícula vírica para la transfección:

• Métodos de activa; con virus. Se usan vectores que sean de virus que infectan sólo a células eucariotas.

• Métodos de pasiva; si entra ADN desnudo sin utilizar ningún virus. Hay que precipitar el ADN con fosfato cálcico y luego se mezcla con la célula. O bien por electroporación. O bien por microinyección, se inyecta ADN en el núcleo o en el citoplasma. O bien por empleo de liposomas o de lípidos catiónicos, encierran el ADN en unas vesículas lipídicas (mono o bicapa) que cuando llegan a la membrana de la célula se fusionan y el ADN entra dentro de la célula, los liposomas catiónicos envuelven el ADN y con ello le confieren carga positiva al ADN y le facilita la entrada en la célula. En todos estos casos se puede utilizar el ADN tal cual o una mezcla del ADN que queramos meter junto con un ADN acompañante, lo que ocurre es que forman concatémeros muy largos que entran dentro de la célula y se introducen en el núcleo y se pueden integrar en el ADN de la célula. No se controla ni el número de unidades que forma un concatémero, ni donde se integran, ni el número de veces que se integran. En una célula podemos tener diferentes porciones de integración en diferentes posiciones del genoma. O el ADN se expresa o no depende de la región del genoma donde se haya integrado (zona que se expresa mas o menos). Hay vectores derivados del SV40 y vectores derivados de retrovirus.

1.- Vectores derivados de SV40.

SV40, únicamente afecta a células de mono. Su genoma tiene unas 5000 pares de bases, es circular de cadena doble, con un origen de replicación, a ambos lados regiones implicadas en la regulación de la replicación y la transcripción.

Luego la región de transcripción temprana (izquierda) y a la derecha regiones de transcripción tardía. En la zona de la transcripción temprana se transcriben dos proteínas implicadas en la transcripción del virus, sin ellos no se transcriben Ag T y Ag t. Y en la región de transcripción tardía UP1, UP2, UP3, para la cápsida del virus.

No se puede empaquetar nada que sea menor de 3900 pares de bases ni mayor de 5900 pares de bases.

La solución es el uso de vectores que llevan genomas defectivos del virus. Si quitamos una región u otra necesitamos utilizarlos con vectores ayudadores. Hay tres estrategias diferentes para un vector ayudador.

• Si utilizamos un vector ayudador SV40 silvestre, cuando pongamos la célula con el vector más el inserto más el vector SV40. Puede ocurrir que una célula hay sido infectada por el vector mas el inserto y entonces en la célula no pasa nada por el vector o no se replica o no se empaqueta.

• Si se infecta con un SV40, si hay lisis pero no hay inserto que es lo que nos interesa.

• Si es la infección conjunta se complementa el vector inserto con el SV40. Por lo que se da la lisis y tenemos el inserto. El problema es que encontramos calvas, pero no todas nos interesan, unas son producidas sólo por SV40 y las otras por los dos. Hay que analizar calva a calva.

Para resolver esto se suelen utilizar vectores ayudadores receptivos. Vector sin las regiones de la cápsida. Se puede utilizar un SV40 pero defectivo para el Ag T y Ag t. Para que entre las dos se complementen pero por si solos no puedan vivir. Por lo que sólo habrá lisis y por lo tanto calvas si se infecta la célula con los dos, vector y SV40. Las calvas van a tener todas el inserto. De estas calvas hay dos tipos de partículas virales, una con el SV40 y otra inserto. Esto se resuelve utilizando como célula hospedadora para este topo de vectores células cos, son células que han sido infectadas por un virus SV40 que tiene alguna mutación en el origen de replicación. El SV40 está integrado en su genoma. El virus no puede salir de ahí porque no pueden replicarse, pero si que se transcriben sus proteínas, por lo que tiene Ag T, Ag t y proteínas UP.

Si infectamos estas células con virus defectivos estas si se pueden replicar y empaquetar. Por eso si utilizamos nuestro vector mas el inserto, así sólo tenemos replicas del inserto.

2.- Vectores derivados de retrovirus.

Virus que tienen como genoma una molécula de ARN, suelen llevar la retrotrancriptasa que necesita todo envuelto en una cápsida y luego la cubierta.

Cuando entre en la célula hospedadora pierde la cápsida y la envuelta y entra desnudo. El ARN se tiene que convertir en ADN mediante la reversotranscriptasa.

Cuando está en forma de ADN de cadena doble se integra en el genoma viral, se traducen y se obtienen las proteínas del virus. No producen lisis de la célula.

En su genoma hay en la parte central genes para proteínas, en los extremos dos repeticiones terminales invertidas (LTR), y entre la primera LTR y los genes de proteínas hay una secuencia implicada en el empaquetamiento. Los LTR también son importantes en el empaquetamiento. Los genes que se sustituyen son los de las proteínas. Se utilizan mucho en terapia génica para que la célula hospedadora exprese el gen de interés. Necesitamos los LTR para que se introduzca en la célula de forma más correcta. Pero para empaquetarlo no tenemos los genes que nos dan las proteínas. Por lo que metemos en una célula empaquetadora en la que se meten las proteínas de la cápsula del virus. En la célula empaquetadora tiene que haber un retrovirus en su genoma y que este sea capaz de producir las proteínas necesarias para empaquetar al retrovirus.

De la célula hospedadora va a salir una partícula viral con nuestro inserto. Para impedir que el retrovirus de la célula empaquetadora se replique y salga de esta célula (la célula empaquetadora está dentro también de la célula hospedadora) se le quita la secuencia implicada en el empaquetamiento o se le muta.

Con los virus que obtengamos infectamos la célula que queramos transfectar, el ARN pasa a ADN de cadena doble, integra dentro del genoma de la célula que se transcribe pero no se empaqueta.

• METODOS DE SELECCIÓN EN CELULAS EUCARIOTAS (MARCADORES)

Para células permanentes.

1.- G418; antibiótico de tipo aminoglicósido. El marcador el APH (aminoglicósido 3´ fosfotransferasa). La célula hospedadora tiene que ser sensibles al antibiótico. El medio tiene que ser selectivo llevando el antibiótico. Este antibiótico inhibe la síntesis de proteínas da lugar a la muerte celular. Si tenemos el gen APH degradamos el antibiótico y da resistencia al antibiótico.

2.- Por timidita quinasa (tk); el gen de la tk normalmente la del virus herpes simple. La célula hospedadora tienen que ser tk- y el medio selectivo, medio HAT, lleva hipoxantina, aminopterín y timidita. La selección en el medio HAT, la ruta metabólica de los dNTPs se corta por algunos puntos y no se obtienen todos los aminoácidos por acción de aminopterín. Al tener hipoxantina se obtienen los dos aminoácidos que faltan G y A. Pero nos falta T. por lo que si tenemos timidita y con tk se puede formar dTTPs, y la célula no se muere.

3.- Resistencia a ácido micofenólico. El marcador es XGPAT. Ahora la ruta se corta por el punto de dGTP. En presencia de xantina….

4.- Resistencia a metotrexato (mtx).

• INACTIVACION DE GENES ENDOGENOS

1.- Utilización de ARN antisentido.

Conseguiremos una inactivación funcional del gen endógeno. Este está presente e intacto, sin mutar.

Vector mas inserto se pone delante de un promotor fuerte (se va a transcribir) lo ponemos en una orientación tal que el ARN que se transcriba a partir del promotor tenga la secuencia complementaria a la del ARNm del gen que queremos inactivar. Las dos cadenas se unen y no se puede traducir.

2.- Inactivación insercional de genes.

Si se consigue una inactivación estructural del gen. Intentamos que nuestro ADN exógeno se integre exactamente en el sitio que queramos del gen endógeno. Para que esto ocurra se hace mediante recombinación homóloga. Inactivación insercional de genes por recombinación homóloga.

El gen endógeno (inactivan), conseguimos este gen y lo modificamos introduciendo en el centro un gen marcador (gen de resistencia neomicina) a un lado le ponemos el gen de la tk.

Si sustituimos el gen endógeno por el que hemos fabricado lo hemos inactivado. Al introducirlo:

• Puede haber una recombinación homóloga y se sustituye el gen endógeno por el nuestro. La célula es resistente a la neomicina, pero es tk- porque el trozo de la tk se queda fuera.

• Si no hay recombinación, la célula no es resistente a la neomicina ni tk, es sensible a la neomicina y tk-.

• Con recombinación no homóloga entra todo, la célula es neomicina resistente y tk+. Pero esto se puede dar en cualquier sitio.

Conseguir un medio que sólo haya tenido recombinantes homólogos. Medio con neomicina, las células sensibles mueren. Medio también con ganadovis, las células tk son sensibles al ganadovis. Por lo que se mueren las células donde haya habido recombinante no homóloga.

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SONDA 3

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