Tema 8: Estructura de los genes y genomas.

Un investigador llamado Griffits fue el primer investigador que descubrió que las bacterias pueden ser transformadas.

Experimento.

Con Streptococus pneumoniae se realizo el experimento. Se tomaron dos cepas una R con aspecto rugoso y una S con aspecto liso. La primera cepa era avirulenta y no producía muerte en los resultados. Las tenia con otra clasificación IIR y IIIS. Hizo un cultivo liquido, cogió una jeringuilla la lleno y la utilizó para inyectar ratones. En IIR no morían pero en IIIS si.

En el siguiente experimento cogió cepas IIIS y una vez que habían crecido las aplico una temperatura alta, de manera que las cepas murieron, las inyecto en los ratones y estos sobrevivieron, no murieron.

En otro experimento cogió cepas IIIS las mato con calor, cogió cepas IIR y las mezclo con las anteriores, luego volvió a inyectarlas en los ratones y estos murieron. No solo morían si no que además tomo los fluidos biológicos, los cultivo y observo que las células eran IIIS. Es decir las cepas IIR se habían transformado. Nosotros podemos interpretar esto como que había habido recombinación y las cepas IIR se habían convertido en IIIS.

La biomolecula paso a llamarse factor de transformación hasta 1940. En esta fecha obtuvieron las cepas IIIS muertas por el calor y obtuvieron de manera aislada las IIR. Se descubrió que las IIR con una sola cepa IIIS muerta pasaban a se todas IIIS.

Esto vino dado por Levene (1910), que secuencio A-T-C-G un tetranucleotido. En 1953 dos investigadores Hester y Chase, ya se sabia que eran SNA y proteínas, también se sabia cual entraba y cual salía. Dieron dos tipos de explicación.

Conclusión: el RNA es material hereditario.

La propuesta para el DNA fue propuesta por Watson que es americano pero fue a Cambridge con una beca post-doctoral junto con Crick que era un físico cuyos conocimientos fueron muy importantes. Lo que hacían era obtener cristales de estructuras biológicas. Luego a través de los rayos X deducieron las estructuras.

Se basaron en los trabajos de Frankling y Wilkins que obtuvieron una imagen de difracción de DNA.

La estructura tenia 20
de diámetro, además era una hélice. En el interior se observaban unas repeticiones pequeñas de 3,4
midiendo distancias y una repetición mayor de 34
, además los átomos de fósforo formaban parte del DNA y quedaban en el exterior de la hélice..

Chargaff era un investigador austriaco que se fue a América en los años 40. Este señor analizo la composición de los nucleótidos, de el se sacaron las leyes de Chargaff.

Watson y Crick propusieron lo siguiente:

• Son heterociclos, tienen bases nitrogenadas, tienen enlaces conjugados Puricas> pirimidinicas.

• Los azucares son ribosas pero las del DNA son distintas de las del RNA. La diferencia reside en que las de DNA no tienen un oxigeno en posición 2' y el RNA si.

• El fósforo (ácido fosfórico) tiene que ver con la estructura y la función (PO4H3). Lo que une entre el azúcar y el fosforico es un ester fosforico. El azúcar y la base nitrogenada se unen con un enlace N--glucosidico.

• El enlace que une los monómeros para conformar el polímero se le llama fosfodiester.

• Formado por dos cadenas o hebras polinucleotidicas.

• Las dos hebras o cadenas son antiparalelas: si vamos del un extremo al otro, una de ellas tiene los enlaces fosfodiester 5'-3' y la otra 3'-5'.

• Las dos cadenas o hebras están unidas entre ellas por los enlaces de hidrógeno que se establecen en las bases nitrogenadas. Además si en una de las cadenas hay una base purica en la otra habrá un base pirimidinica. Las razones son que dos pirimidinicas son pequeñas y dos Puricas juntas no entran en el diámetro de los 20
  .

• Si la base purica en una de las hebras o cadenas es A, en la otra hebra o cadena la pirimidinica será T. Si la purica es G en una de las hebras en la otra estará C. es así porque de este modo se cumplen las leyes de Chargaff.

• La A se une a la T por dos enlaces de hidrógeno y son los máximos que pueden dar.

• La C se une a la G por tres enlaces de hidrógeno y son los máximos que se pueden dar.

• Las dos cadenas o hebras están enrolladas en espiral dextrógira, además para separar el enrollamiento helicoidal las dos cadenas o hebras hay que hacer girar a una de ellas alrededor de la otra en sentido contrario de la doble hélice.

• En la doble hélice los grupos fosfato que son hidrófilos, están en el exterior y sin embargo las bases están en el interior.

• El avance o la distancia de una base con la inmediatamente superior es 3,4
  . por lo que vieron Frankling y Wilkings.

• La vuelta completa de la doble hélice mide 34
  por que Frankling y Wilkings dijeron que había una repetición mayor cada 34
  .

• Cada vuelta completa de la doble hélice tiene 10 bases.

• Las bases nitrogenadas en la doble hélice esta en forma estable con la mayor frecuencia y esta forma estable es un forma tautomerica y es en la forma amino y ceto, en amino esta A y C y en ceto T y G. Un átomo de oxigeno unido a un nitrógeno puede pasar reversiblemente desde su unión con un nitrógeno a otro y desde su unión con un nitrógeno a un oxigeno. Estas reacciones reversibles llamadas reacciones de tautomeria interconvierten a las formas ceto C=O en enol o alcohol C-OH. Esto posibilita que cuando se producen las formas raras las bases no se unan a las bases complementarias usuales. La forma amino de A se aparea con C y la forma enol de G se aparea con T y viceversa. Esto es una de las causas de la transversión.

Implicaciones genéticas de la estructura.

Cualquier molécula biológica que sea hereditaria tiene que tener estas características.

• Ser informativa.

• Tener capacidad de transmitir la información de célula a célula y de generación en generación.

• Ser capaz de codificar para otra moléculas.

• Ser capaz de mutar o cambiar para que se de la evolución.

Se dice que el DNA cumple casi todas las características.

• No hay limite para el numero y la posibilidad de colocación de las bases, por eso es informativa. Se puede dar cualquier secuencia.

• La molécula ya en su forma dice como el DNA puede replicarse. Lo que puede suceder es que se separa y que cada hebra sirva como patrón para sintetizar una nueva cadena complementaria. Por eso es capaz de transmitir la información.

• Cualquier información debe ser capaz de cambiar porque solo así es capaz de darse la evolución. Las base pueden cambiar y eso demuestra que es capaz de cambiar o mutar.

Tipos de estructuras de DNA.

La estructura de Watson y Crick es la forma -DNA, es la obtenida de fibras y cristales en condiciones de pH y humedad fisiológicos y una composición al azar de nucleótidos.

Cuando las condiciones de humedad se modifica, de modo que no son fisiológicas sino mas bajas y cuando la composición de bases no es al azar, se hacen moléculas de DNA sintéticos con composición de bases conocida, entonces se han encontrado que el DNA puede adoptar otras estructuras.

• Cuando las condiciones de humedad son bajas la estructura que se obtiene es, otra forma del DNA llamada A-DNA los surcos externos se reducen y se modifica el numero de pares de bases por vuelta >10. además se modifica la distancia entre las bases que ya no es 3,4
  sino menos. Si se sigue disminuyendo la humedad, varia el diámetro, la longitud, la estructura externa , el numero de vueltas, y el numero de bases por vuelta.

• Cuando la composición no es al azar si no que se crean moléculas de DNA sintético con una composición de bases conocida, y además cuando se crean moléculas de DNA que tengan purinas y pirimidinas alternadas. Y la purina sea G y la pirimidina sea C, entonces al observar las imágenes de difracción, la molécula de DNA es una forma de DNA que recibe el nombre de Z-DNA, esta forma fue vista por primera vez por Wang y Rich en 1979 y las diferencias con el DNA normal son dos fundamentalmente:

• La forma Z es una doble hélice levógira en lugar de dextrógira.

• En la forma A, B etc. Que todas son dextrógiras la conformación de N- - glucosidico es de siempre anti* sin embargo en la forma Z la conformación N-- glucosidico es anti en C y sin en G.

*Anti es cuando la ribosa y la guanina están en posiciones opuestas.

*sin es cuando la ribosa y la guanina están en la misma posición.

• Parece ser que la estructura Z se estabiliza cuando las citosinas se metilan en posición 5'.

• las islas CpG son capaces de metilarse y desmetilarse reversiblemente.

• estructura del RNA.

Estructura del RNA monohebra.

Cuando es monohebra la estructura que adopta el RNA es una hélice levógira.

Las moléculas de RNA monohebra, tanto como el DNA en monohebra, las bases no están protegidas de la acción de las nucleasas. Las moléculas de RNA tienen regiones repetidas invertidas, son regiones de complementariedad intracatenaria, como consecuencia el RNA monohebra se pliega de modo que se unen las regiones por enlaces de hidrógeno, esto genera unas estructuras secundarias denominadas bucle interno, horquilla y salientes.

Estructura del RNA duplexo.

Cuando es duplexo o de doble hebra se estructura como una doble hélice y además dextrógira, tiene que tener una forma que sea muy similar a la forma A del DNA. Porque lo único que difiere en tamaño porque el DNA tiene oxigeno en su ribosa en posición 2' y el DNA no.

• Técnicas analíticas básicas.

Medición de absorbancia.

El DNA y el RNA tienen la capacidad de absorber la luz ultravioleta y además se sabe que los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorbancia de la luz ultravioleta cuando la longitud de onda son 260 nm. Midiendo esta absorbancia en un aparato llamado espectrofotómetro (a pH7).

Las unidades de medida son E260 (M-1 cm-1) dado que 260 es la unidad.

Esta técnica sirve para medir la cantidad de DNA que tengo o lo que es lo mismo el valor C.

El DNA eucariota esta fuertemente empaquetado, después de romper las proteínas hay que medir la pureza.

Separación molecular

Cuando se habla de separar un genoma se hace a cachos.

Hay distintos tipos:

• Centrifugación: esta es la centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio (CLCS). Antes se llena el tubo de centrífugo con cloruro de cesio, el cesio es muy denso y queda en un gradiente. Pongo la muestra y lo centrífugo. El DNA se distribuye y se queda en el mismo lugar que el cesio que tenga la misma densidad que el DNA.

A igualdad de longitud la que tiene mas pares C-G es mas densa, por lo que va mas abajo en el tuvo de centrifugación y sirve para saber la composición de bases.

Además independientemente de la composición si las hebras tienen distinta longitud, la mas densa es también la mas larga. Esto sirve para saber la cantidad de DNA que se tiene.

• Electroforesis: se separa la molécula de DNA, se ponen los fragmentos de DNA en un gel, lo metemos en un aparato (cubeta de electroforesis). Lo tapamos con una solución tampón par el pH"7 que cubre el gel . el DNA esta cargado negativamente, la cubeta tiene un polo positivo y un polo negativo, la conectamos y el DNA ira al ánodo que es positivo. En el DNA tenemos un carga masa idéntica. Y la separación de las moléculas depende del tamaño.

Esto sirve para separar moléculas en función del tamaño.

Hibridación.

Las moléculas de ácidos nucleicos cuando son de doble hebra si se les modifica las condiciones de pH y temperatura se desnaturaliza , es decir, se separan las hebra por la ruptura de los puentes de hidrógeno. Es un fenómeno reversible,, cuando modificamos en sentido opuesto las condiciones, las moléculas vuelven a su estado natural (fenómeno de la renaturalización).

Hibridar es coger una molécula duplexa desnaturalizarla y después coger una hebra, de DNA o RNA pero de diferente procedencia, utilizamos esta hebra y ponemos las condiciones idóneas para que se una con la hebra original.

En conclusión, hibridar es unir dos hebras de DNA; una DNA y una RNA o unir dos hebras de RNA. Pero siempre y cuando cada una de las dos hebras sean de diferente procedencia.

Se utiliza para localizar secuencias. Y se utiliza también para medir la cinética o la velocidad en que las hebras de diferente procedencia o de igual procedencia se reasocian. Para ello se utilizan las curvas C. O. T. utilizando los datos obtenidos.

• Geonómica comparativa.

El dato del valor C.

Se observa que hay una correlación entre la cantidad de DNA y el numero de cromosomas y también que hay una correlación positiva entre la cantidad de DNA y la posición en la escala evolutiva.

Aunque en general hay correlación positiva entre cantidad de DNA y posición en la escala evolutiva, no siempre es así. Este hecho se conoce como la paradoja del valor C.

Hay organismos en un fillum que hay una gran variabilidad en cuanto a la cantidad de DNA.

Diferencia de tamaño y % de bases C-G.

Se observa que en organismos procariotas hay gran variabilidad entre ellos, y con este dato se ha concluido que a medida que subimos en la escala evolutiva y en su cenit es porcentaje constante se estabiliza y estos organismos poseen una gran cantidad de DNA cuyo porcentaje C-G es 40 %. La banda obtenida es ancha y se le llama banda principal. También se observa que tiene una parte del DNA con contenido C-G diferente que es mas estrecha. Además de la banda principal los organismos eucariotas tienen bandas estrecha que pueden estar por encima y/ o por debajo. Esta bandas son las bandas satélite.

Hibridación para la localización de secuencias.

Con la curva COT estándar se hacen comparaciones y se obtienen los siguientes datos en relación con la geonómica comparativa.

Cuando se realiza en organismos procariotas:

Conclusión: solo hay una clase de cinética dado que coincide con la estándar

Esto implica que el DNA procariota no tiene secuencias repetidas.

Cuando se utiliza en organismos eucariotas se obtiene una curva en todos los casos que se aparta de la curva estándar. Esto se ve porque tiene una clase que se reasocia en menores cotas que la curva COT y otra que se reasocia en mayores cotas que la curva estándar.

Conclusión: en el DNA eucariota hay secuencias repetidas que son aquellas que están a menor valor Cot.

• estructura del gen.

Operones: conjunto de genes estructurales cuya expresión esta regulada por la misma secuencia regulador, y como la secuencia tiene un regulador llamado operador, a este conjunto de genes mas la secuencia reguladora se le llama operon; la expresión se hace de forma coordinada, y solo existe en bacterias.

En eucariotas los genes que codifican para proteínas nunca consisten en un operon. Cada secuencia reguladora coordina la expresión de un solo gen. Nunca se expresan simultáneamente los mRNA de varios genes.

• naturaleza de los genomas.

Virus

Hay virus con DNA y virus con RNA, pero nunca de las dos cosas a la vez.

El genoma de virus de DNA puede ser monohebra (lineal o circular) duplexo (lineal o circular), doble hebra con proteínas asociadas covalentemente y puede ser duplexo lineal y con los extremos unidos covalentemente.

El genoma de virus de RNA, doble hebra y monohebra pero nunca RNA circular. Hay virus de RNA que en vez de tener el genoma en un solo fragmento lo tiene en varias piezas.

Bacterias.

Sea el genoma que sea es mas grande que el compartimiento. Esta empaquetado porque es mas grande que el compartimiento.

La bacteria tiene dos tipos de genoma, nunca en compartimiento nuclear sino que en el citoplasma de la célula, formando una parte de la célula muy densa, el genoma se denomina nucleoide, esta formado por una molécula de DNA circular y convexo, esta formado por una pequeña molécula de DNA duplexo circular llamados plasmído o plasmidio.

Esa estructura esta empaquetada o plegándose. Se observa mide y analiza químicamente. Se analiza y se propone que el DNA de las bacterias esta estructurado en forma de lazos y estos están unidos covalentemente a la matriz primera de la mitocondria. En base a esto se propone que el DNA de las bacterias esta resguardado por la otra vértebra. Se supone que las protege y crean los empaquetamientos.

Eucariotas.

Genoma citoplasmático.

• Mitocondrias: el genoma de mitocondrias esta formado por una molécula de DNA duplexo y circular, en relación con la trascripción y replicación actúa independientemente. A una hebra se le llama U y a la otra L. Es una cromatina con una gran densidad génica.

• Plasmidios: los hay en eucariotas haploides y en plantas, son pequeñas moléculas de DNA circular. Contenidos en las mitocondrias haya un plasmido que esta en la levadura, en su núcleo, y se llama circulo de 2 micras (m). Este plasmido es muy útil en los experimentos de ingeniería, insertando vectores de clonación.

• Cloroplastos: orgánulos citoplasmático solo presentes en plantas. El genoma de los cloroplastos es duplexo y circular, se caracteriza por su gran densidad génica, tiene 3 tipos de secuencias. Tiene secuencias IR (repeticiones invertidas), una misma secuencia esta repetida en sentido contrario, tiene LSC (Long Single Copy) son largas copias únicas y por ultimo las secuencias SSC (Short Single Copy) que son copias únicas cortas.

Genoma nuclear.

1. Cromatina:

La hipótesis esta basada en la observación de microscopia electrónica, en medición de las microscopias electrónicas, en el análisis químico de las estructuras.

Observación: si se extrae la cromatina interfasica, el contenidos nuclear en interfase, se tiñe y se observa, se ven que hay regiones mas intensamente teñidas y regiones menos teñidas, las que se tiñen mas son heterocromatina y además constitutiva por que siempre esta en forma heterocromática y la eucromatina se tiñe menos. La tinción tiene un significado, se tiñe mas o menos cuando esta mas o menos empaquetada, esto ultimo es porque esta inactiva.

Si se extrae la cromatina interfasica y se le somete a distintas concentraciones salinas y además se aumenta esa concentración de sal y luego se tiñe (hay que teñir siempre porque las estructuras biológicas son transparentes), se observa que a concentraciones de sal bajas la cromatina aparece como cuentas de un rosario (collar) y se mide y tiene un diámetro de 10nm o 100
y si se analiza químicamente se ve que esta formado por DNA y además por cuatro tipos de proteínas histonicas que son: H2A, H2B, H3 y H4, y cada cuenta del collar esta formada por un octomero de estas proteínas con dos subunidades por cada una. Estas estructuras reciben el nombre de nucleosomas y a las proteínas se les llama proteínas histonas nucleosomicas.

Cuando se aumenta la concentración de sal se ve que se compacta mas cuando el nivel de la concertación salina alcanza los valores filológicas se observa una estructura que se le llama fibra o solenoide, se mide y se ve que su diámetro son 30 nm o 300
que todavía es mayor que la anterior, al analizarla químicamente se ve que esta formado por DNA, proteínas histonicas y además se ve una proteína histonica adicional H1, que no es nucleosomica.

Cuando se extrae la cromatina interfasica y se la somete a procesos químicos que eliminan las proteínas histonicas, se tiñe y se observa la estructura se observa que hay en el centro una estructura proteica, y se le llama andamio o matriz nuclear, además se observa unos lazos. Además se ha visto en orgánulos que hay regiones o secuencias de DNA en que ese DNA se une al andamio o matriz nuclear, a estas secuencias de unión se les denomina SARs, el nombre viene de Scahold Atachment Regions.

En base a todo esto se propone que la cromatina nuclear eucariota se estructura de la siguiente forma:

• Se enrolla alrededor de octameros de histonas.

• Se enrolla en forma de solenoide.

• La fibra se estructura en lazos unidos a la matriz nuclear.

2. Cromosomas:

Se propone que los lazos unidos a la matriz nuclear se enrollan en espiral dando forma a los cromosomas.

Nivel de resolución es el numero de bandas que se obtienen.

Todos los cromosomas tienen una constricción primaria o centrómero, además hay algunos cromosomas que tienen constricciones secundarias no centromericas y los que tienen este segundo tipo son los cromosomas 1, 9, 16 esta constricción secundaria no centromérica aparece en los brazos largos y son heterocromatina constitutiva, además los brazos cortos de los cromosomas acrocentricos, 13, 14, 15, 21 y 22, están formados por heterocromatina constitutiva. Y por ultimo el brazo largo del cromosoma Y en su mayor parte es heterocromatina constitutiva. Además en cuanto a la cantidad de DNA por cromosoma, se sabe que el valor medio es 130 Mb, este valor oscila entre 50 y 250 Mb (50 en el cromosoma 21 y 250 en el cromosoma 1).

En las bandas oscuras en bandeo G son pobres en genes y ricas en pares A-T, ricas en LINES y pobres en secuencias ALU (sine característico humano) y además son insensibles a la acción de la desoxirribonucleasa.

Las bandas claras en bandeo G son ricas en genes, ricas en pares C-G, pobres en LINES y ricas en secuencias ALU y además muy sensibles a la acción de la desoxirribonucleasa.

3. Organización de secuencias.

Las secuencias no codificantes están muy repetidas en tamdem y dispersas.

En tamdem: este tipo es lo que se conoce como no codificante se conoce como DNA satélite, porque cuando se le somete a una centrifugación en gradiente de densidad de ClCs (cloruro de cesio) suele estar ocupando las bandas satélites.

Dependiendo del tamaño de la repetición podemos clasificarlo en:

• Satélite.

• Minisatélite: es el que se utiliza para hacer la huella de DNA.

• Microsatélite: este tipo de secuencia constituye lo que en genética molecular se denomina VNTR's (Variable Number Tandem Repeats)

Dispersas: tenemos dos tipos importantes.

• LINES (Long Interspersed Nuclear Elements)

• SINES (Sort Interspersed Nuclear Elements)

57