TRABAJO PRACTICO N° 1

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.

OBJETIVO.

• Realizar curvas de calibración a partir de una muestra de proteínas (albúmina bovina), con distintas concentraciones conocidas, utilizando el método de Bradford y Lowry estándar, con HEPES y TCA.

• Hallar la concentración de proteínas en dos muestras incógnita: una sin interferentes y otra con el interferente HEPES.

INTRODUCCIÓN.

El método de Lowry se aplica para hallar la concentración de proteínas en las muestras. Este método utiliza una solución, scn 1, que contiene cobre (aumenta la sensibilidad en la determinación de proteínas) y un reactivo, llamado Reactivo de Folin, que se reduce en presencia de proteínas. Las especies reducidas cambian su color hacia el azul y son capaces de ser leídas por el espectrofotómetro para averiguar su absorbancia.

Si las concentraciones de las proteínas son conocidas, se realiza la curva estándar de calibración (Absorbancia vs. Concentración). Si, en cambio, las concentraciones de las muestras no son conocidas, se mide su absorbancia, se interpola este valor con la curva de calibración y así se halla la concentración de la muestra incógnita.

A la muestra se le puede agregar HEPES, interferente, y luego tratarla con TCA, para precipitar la proteína. Se hallan nuevas curvas y se las puede comparar con la estándar.

El método de Bradford, que tiene las mismas aplicaciones que el de Lowry, utiliza un reactivo, llamado reactivo de Bradford, que al entrar en contacto con proteínas se reduce, virando su color del amarillento al azul intenso. Las muestras son leídas a 595nm y con estos datos se realiza la curva de calibración.

PROCEDIMIENTO.

Se tomaron 5 tubos de vidrio en los que se colocaron distintas cantidades de solución de BSA (albúmina sero bovina) 1mg/ml y luego se llevaron los tubos al mismo volumen final (100 ul) con agua destilada. Se agregaron 1000 ul de reactivo de Bradford, se dejó reaccionar dos minutos y se midió la absorbancia de cada tubo en el espectrofotómetro a 595 nm de h. Se realizó la curva de calibración con los valores obtenidos, se hizo la regresión lineal y se calculó el ajuste de la recta.

Se tomaron 7 tubos de vidrio con distintas cantidades de scn. de BSA y se llevaron al mismo volumen final (300 ul) con agua destilada. A cada tubo se lo incubó primero durante 10 minutos con la solución 1 y luego se agregó el reactivo de Folin (150 ul), se agitó y se incubó durante 30 minutos.

Finalmente se midió la absorbancia de cada tubo en el espectrofotómetro a 660 nm, se realizó la curva de calibración y se calculó el ajuste de la recta.

Se tomaron 7 tubos con diferentes cantidades de scn. BSA. Se llevaron al mismo volumen final (300ul) con HEPES (interferente), luego se incubó 10 minutos con scn. 1 y finalmente 30 minutos con el reactivo de Folin (150 ul).

Se midieron las absorbancias en el espectrofotómetro a 660 nm y se realizó con estos valores la curva de calibración.

Se tomaron 7 tubos a los que se agregaron diferentes cantidades de scn. BSA y se llevaron al mismo volumen final con agua destilada (300 ul). A cada tubo se agregó HEPES y la misma cantidad de TCA. El TCA se agrega para que precipite la proteína y así poder separarla del interferente. Se dejó a los tubos así preparados durante 15 minutos en frío para favorecer la precipitación. Luego se centrifugaron (15 minutos- 3500 r.p.m.), se descartó el sobrenadante por inversión sobre papel absorbente, se agregó éter etílico para descartar el TCA, se centrifugó nuevamente y se retiró el sobrenadante con pipeta Pasteur. El pellet se resuspendió en NaOH.

A los tubos con las soluciones resultantes se le agregó la scn. 1, se dejó incubar 10 minutos, se agregó el reactivo de Folin y se incubó 30 minutos. Se midieron las absorbancias en el espectrofotómetro a 660 nm, se realizó la curva de calibración y se hizo el ajuste de la recta resultante.

Se prepararon 4 tubos con 30 ul cada uno de scn. de proteína incógnita. Dos de ellos se llevaron al volumen final de 300 ul con agua destilada y los otros dos se llevaron a 300 ul con HEPES.

Se agregaron 1500 ul de scn. 1 y se incubó por 10 minutos, luego se incubó durante 30 minutos con reactivo de Folin (150 ul).

Se midieron las absorbancias a 660 nm y los resultados obtenidos se interpolaron en las curvas de calibración confeccionadas en los pasos anteriores.

Cabe destacar que para los 4 tubos se utilizó el mismo blanco utilizado para la curva de calibración de Lowry HEPES.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES.

A)

B)

C)

D)

Si el HEPES no fuera un interferente en el método de Lowry, las pendientes de las curvas de calibración de Lowry HEPES y Lowry Std. deberían ser las mismas. Como no los son, se demuestra que HEPES actúa como interferente en este método.

Al utilizar TCA para eliminar el interferente, se espera que las pendientes de las curvas de calibración de Lowry TCA y Lowry Std. fueran iguales o al menos muy similares, ya que en ninguna de las dos hay interferente. Sin embargo, al compararlas, notamos que difieren en un factor de 1.25, dando un error porcentual aproximadamente igual al 27%. Este es un error experimental muy elevado y no sería una buena aproximación utilizar los valores de esta curva de calibración TCA para encontrar la concentración de una muestra incógnita. Seguramente hubo errores sistemáticos en las mediciones, en los tiempos de incubación, en el pipeteo, al descartar los sobrenadantes, etc.

E)

Los valores de cero de las absorbancias se deben a que los blancos utilizados para obtener los valores de las mismas fueron los utilizados para la curva de Lowry HEPES, es decir que los blancos contenían HEPES mientras que las muestras no. En realidad los valores dieron negativos, lo que es absurdo y es, por lo tanto, válido tomarlos como valores nulos.

Puede deducirse de esto que el interferente se une a los colorantes utilizados en el método de Lowry, ya que de otra forma las muestras podrían dar valores de absorbancia linealmente proporcionales con respecto al blanco, donde al no haber proteínas, el interferente no tendría a quien unirse.

Conociendo la relación lineal que hay entre la absorbancia y la concentración (Ley de Lambert-Beer: A=  b c, donde A es la absorbancia,  es el coeficiente de absorbancia, b es el camino óptico recorrido y c es la concentración), puede obtenerse la concentración de la muestra incógnita con HEPES tomando en cuenta cada curva de calibración realizada.

Para el caso de Bradford Std.:

y = 0.0168 1/ug prot. * x

O mejor expresado,

A = 0.0168 1/ug prot. * c , donde la pendiente representa el valor de  = 0.0168.

Tomando el promedio de los dos valores de absorbancia para la incógnita con HEPES y reemplazando en la ecuación:

0.112 = 0.0168 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.0168 = 6.67ug prot.

La concentración de la proteína incógnita por ul de scn. de proteína es, entonces:

C = 6.67ug prot. * 1ul scn. prot. / 30ul scn. prot. = 0.22ug prot/ul scn. prot.

Evidentemente, al interpolar en la curva Bradford Std., el valor obtenido no puede tomarse en cuenta debido a que para medir la absorbancia de la muestra incógnita se utilizó el método de Lowry, que utiliza otros colorantes y se lee a otra longitud de onda y por lo tanto no va a ser comparable con los valores obtenidos en el método de Bradford.

Para el caso de Lowry Std.:

A = 0.0055 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.0055 = 20,36ug prot.

La concentración de la proteína incógnita por ul de scn. de proteína es para este caso:

C = 20,36ug prot. * 1ul scn. prot. / 30ul scn. prot. = 0.68ug prot/ul scn. prot.

Para el caso de Lowry TCA:

A = 0.004 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.004 = 28ug prot.

La concentración de la proteína incógnita por ul de scn. de proteína es para este caso:

C = 28ug prot. * 1ul scn. prot. / 30ul scn. prot. = 0.93ug prot/ul scn. prot.

En el caso de calcular la concentración de la incógnita con la curva de Lowry Std., al no tener ésta HEPES, y al haberse demostrado ya que éste se une a los reactivos de Lowry produciendo interferencia en la lectura de la absorbancia, el valor no puede tomarse en cuenta. Lo mismo pasa al calcular con Lowry TCA, con el agravante de que en este caso se introduce un error del 27 % aprox., lo que lo hace mucho más inexacto.

Para el caso Lowry HEPES:

A = 0.0341 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.0341 = 3,28ug prot.

La concentración de la proteína incógnita por ul de scn. de proteína es para este caso:

C = 3,28ug prot. * 1 ul scn. prot. / 30 ul scn. prot. = 0,109 ug prot/ul scn. prot.

Para la curva de Lowry HEPES se tomaron pocos valores porque en los que la concentración de la proteína era elevada, no respondían ya a la relación lineal de Lambert-Beer. Así, al interpolar en dicha curva, el valor de la concentración de proteína de la muestra incógnita que se obtiene es solamente una aproximación del valor real. Esto puede verse en el ajuste de la recta en el gráfico (R2 = 0.8942), que si bien es bastante bueno por tratarse de una scn. con interferente, es suficientemente bajo para ser una buena aproximación.

Las interferencias de numerosas sustancias constituyen uno de los principales inconvenientes del método de Lowry en comparación con otros. Estas sustancias son derivados aminados, componentes de ciertos buffers, agentes quelantes, detergentes, algunas sales, azúcares, etc. Las principales interferencias con el Coomassie blue son los detergentes.

La sensibilidad de un método representa la cantidad mínima de proteína necesaria para dar una respuesta detectable. El método de Bradford es más sensible que el de Lowry.

La elección de un método de dosaje de proteínas dependerá sobre todo de la precisión requerida y de la cantidad de proteína a dosar, además de la facilidad de puesta en marcha, la rapidez de la respuesta durante el proceso, las condiciones de dosaje, etc.