PRACTICA 1: HIPERLIPIDEMIAS.

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL Y TRIGLICERIDOS EN SUERO Y EN LIPOPROTEINAS.

INTERES DE LA PRÁCTICA

Es conocida la relación existente entre elevados niveles de triacilglicéridos y colesterol en sangre y el desarrollo de arteriosclerosis y enfermedades coronarias. La importancia de dicha relación ha hecho prudente la recomendación de que se reduzca la ingesta de grasas al 30-35 por 100 de los requerimientos energéticos totales y que se reemplacen los ácidos grasos saturados por los insaturados.

Los lípidos de la dieta están formados en un 90% de triacilglicéridos y el resto son ésteres del colesterol, esteroles vegetales, diversos fosfolípidos y otros.

Los lípidos de la dieta que pueden producir mayores riesgos de enfermedades cardiovasculares son:

Colesterol. Pertenece a un grupo importante de compuestos conocidos como esteroides. Es insoluble en agua. Se encuentra en las membranas celulares (exceptuando las células bacterianas). También es un componente principal de la vaina de la mielina, la membrana lipídica que envuelve a las fibras nerviosas de conducción rápida, acelerando el impulso nervioso.

El colesterol es sintetizado en el hígado a partir de ácidos grasos saturados y también se obtiene en la dieta.

Triacilglicéridos. Son lípidos compuestos (su molécula presenta dos o más grupos diferenciados). Constituyen la forma molecular de reserva energética más eficaz de manera que pueden ser almacenados de esta forma en grandes cantidades de tejido adiposo.

Son altamente insolubles en agua y son hidrolizados enzimáticamente por acción de las lipasas como vereremos en el apartado siguiente.

FUNDAMENTO DE LA TECNICA UTILIZADA

Determinación de colesterol por métodos enzimáticos.

Algunos de los primeros métodos para efectuar pruebas de colesterol incluían la obtención de productos coloreados, haciendo reaccionar el colesterol con sustancias fuertemente ácidas. Dado que se descubrió que los ésteres de colesterol y el colesterol libre no producen cantidades equivalentes de color esto dio lugar a la adición de un paso de saponificación para transformar los ésteres de colesterol en colesterol libre. Actualmente se utilizan métodos más rápidos y seguros que utilizan enzimas como reactivos para las pruebas de colesterol.

Los métodos enzimáticos para el análisis de colesterol fueron ideados en los años 70 y desde entonces han reemplazado los métodos químicos casi completamente.

Los métodos enzimáticos se ven menos sujetos a posibles interferencias por sustancias no esterólicas que los métodos químicos. No obstante, no hay absoluta especificidad para el colesterol, dado que su oxidasa puede reaccionar también con otros estelores, que se sabe que están también presentes en el plasma, y con esteroles vegetales, presentes en concentraciones apreciables en la circulación en pacientes con *-sitosterolemia. El método atribuido a Flegg lleva a cabo el análisis en tres pasos; el grupo 3-OH del colesterol es oxidado y el agua oxigenada, que es uno de los productos de la reacción, se determina enzimáticamente:

Hidrólisis de los ésteres de colesterol mediante la colesterol esterasa (CE).

Colesterol esterificado CE Colesterol libre + ácido graso

Oxidación del colesterol mediante la colesterol oxidasa (CO) para producir peróxido de hidrógeno.

Colesterol libre + O2 CO 4-Colestenona + H2O2

Oxidación de un cromógeno con el peróxido de hidrógeno en una reacción catalizada por la peroxidasa para producir un producto coloreado.

H2O2 + fenol +4- aminoantipirina peroxidasa quinoneimina + H2O

Con respecto a las enzimas que actúan en estas reacciones, se puede decir que:

• La colesterol esterasa (CE) se encuentra presente en el jugo pancreatico y en el intestino, transforma los esteres del colesterol en colesterol y acido graso libre, y es precisamente en esta forma libre como es absorbido el colesterol por el intestino.

• La colesterol oxidasa (CO) se encuentra en la vesicula biliar y el intestino y produce la oxidación del colesterol libre debido a que el organismo es incapaz de oxidar colesterol hasta dioxido de carbono por lo que solo puede excretarlo en la bilis donde parte del colesterol libre se convierte en acidos biliares.

Determinación de triglicéridos por métodos enzimáticos.

Los métodos antiguos incluían extracciones con disolventes orgánicos y eran prolongados en su elaboración. Al igual que sucede con el colesterol, los métodos enzimáticos han reemplazado los métodos químicos en la mayoría de las finalidades. Los análisis se realizan directamente en plasma o en suero y no están sujetos a interferencias por los fosfolípidos o la glucosa. En la actualidad la mayoría de los métodos siguen dos pasos:

Descomposición de los triglicéridos por una lipasa en ácidos grasos libres y glicerol.

TG LPL Glicerol + ácidos grasos libres

Fosfoliración del glicerol catalizada por la glicerol quinasa (GK).

Glicerol + ATP GK Glicerol-3-P + ADP

Oxidación del glicerol-3-fosfato catalizada por la glicerol fosfato oxidasa.

Glicerol-3-P + O2 GPO Dihidroxiacetona fosfato + H2O2

4. En presencia de peroxidasa el peróxido provoca el acoplamiento del 4-clorofenol y la 4-aminoantipirina dando lugar a un derivado quinonímico de color rojo. La intensidad de la coloración es proporcional a la concentración de triglicéridos y se mide fotométricamente.

La lipoproteina lipasa (LPL) se encuentra en su forma activa, en el endotelio vascular. Presenta varios sitios funcionales, distintos entre sí y que contribuyen a su efectividad catalítica o la modulan:

Un sitio de unión a la porción lipídica de la superficie del sustrato.

Un sitio de unión a la apo C-II.

Un sitio de unión de los trigliceridos.

Un sitio catalítico.

Un sitio de interacción entre sus dos subunidades.

La glicerol quinasa (GK) es una enzima donde su mayor actividad se encuentra en el hígado y la corteza renal. Esta desempeña un papel fundamental en la velocidad de flujo gluconeogenico a partir del glicerol.

Glicerol fosfato quinasa (GPO) dará lugar a la oxidación del glicerol 3 fosfato que pasa a dihidroxicetona.

PROTOCOLO

Se va a determinar la cantidad de colesterol y triglicérido a partir del método señalado en el apartado anterior llamado método de Flegg. Para realizar esta determinación se utilizó los siguientes reactivos:

DETERMINACIÓN DEL COLESTEROL:

• Reactivo:

Tampón fosfato 150mM (pH 7.2)

Fenolato sódico 7.8mM

4-aminoantipirina 0.4 mM

Colesterol Esterasa (CE) > 1.7 *kat/L

Colesterol Oxidasa (CO) > 1 *kat/L

Peroxidasa > 20 *kat/L

DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS:

• Reactivo:

Tampón Pipes 42mM (pH 7.5)

Adenosina trifosfato (ATP) 1mM

4-aminoantipirina 0.5 mM

Lipoproteína Lipasa (LPL) > 50 *kat/L

Glicerol quinasa (GK) > 13 *kat/L

Glicerol fosfato oxidasa >25 *kat/L

Peroxidasa > 5 *kat/L

4-Clorofenol 6mM

Las técnicas que utilizamos en estas determinaciones son la espectrofotometria y la electroforesis. La espectrofotometria se refiere al uso de la luz para medir las concentraciones de sustancias químicas mientras que la electroforesis consiste en la aplicación de un campo eléctrico sobre una muestra y observar sus variaciones con respecto al campo.

Vamos a emplear como técnica el ensayo enzimático colorimetrico a punto final ( todo el sustrato se convierte a producto), donde la longitud de onda se va a medir dentro de la banda del visible.

Las muestras se colocan en tubos o en placas:

Placa: - El aparato utilizado es un lector de placas.

• Las cubetas de la placa se rellenan con multipipeta (250 microlitros) aunque antes se ha utilizado micropipeta para poner 10 microlitros. La multipipeta cada vez que se rellena puede echar 250 microlitros 10 veces por lo que es muy útil cuando se quiere poner el mismo volumen de un mismo compuesto.

• Las muestras se realizan por triplicado.

• Para incubar las muestras se utiliza un hinchador de placas.

Tubo: - El aparato utilizado es un espectrofotometro.

• Los tubos se rellenan por completo con micropipeta.

• Las muestras se realizan por duplicado.

• Para incubar las muestras se utiliza un baño de agua.

Para la determinación de colesterol se utilizó placa y para la determinación de trigliceridos tubos.

Los pasos para la determinación de colesterol son los siguientes:

• Se saca de la nevera 2 eppendorf en los cuales se encuentra el calibrador y el control patológico. El calibrador es una solución diluida del analito que sirve para realizar la recta de calibrado; el control patológico es una solución con una concentración conocida del analito, este control va a presentar un valor en el lector de placas que debe estar dentro de un intervalo de confianza que indica si se puede seguir realizando la determinación. Existen dos tipos de intervalo: 1) media + 2*desviación típica; 2) media + 3*desviación típica, este ultimo recibe el nombre de intervalo permisible.

• Además de los dos eppendorf, se saca de la nevera 3 tubos que corresponden a 3 muestras de tres pacientes diferentes. Estos tubos se deben poner en hielo para que no pierdan la temperatura de la nevera.

• También es necesario un blanco para realizar el cero de absorbancia, en este caso será solución salina ya que se va a asemejar a las condiciones fisiológicas del medio.

• Ahora en la placa, se debe añadir 10l de blanco, calibrado, control patológico y de las tres muestras; esto se realiza por triplicado para tener una mayor fiabilidad en los resultados. Posteriormente se ponen 250 l de la solución reactiva que contiene las enzimas (esta solución es propia del colesterol y contiene las enzimas colesterol esterasa y colesterol oxidasa que han sido explicadas en el apartado anterior). Al ser por triplicado se pipetean 250l x 3 veces.

• Después de pipetear todos los volúmenes, se debe incubar las muestras en un hinchador de placas durante 10 minutos a una temperatura de 37ºC que es la temperatura a la que se realiza las diferentes reacciones enzimáticas ya que el cuerpo humano se encuentra a esa temperatura.

• Después del hinchador, se observa que han aparecido en la placa unos productos coloreados por lo que ahora se debe medir la absorbancia y la concentración en el lector de placas.

• Todo este proceso lo repetimos dos veces debido al mal pipeteo del volumen de 250 l.

Con respecto a la determinación de trigliceridos, los pasos seguidos son los siguientes:

• Se coge de nuevo de la nevera 2 eppendorf que contienen calibrador y control patológico,

• Las muestras utilizadas son las mismas que las de la determinación del colesterol.

• En este caso se utilizó tubos para realizar la determinación. En los tubos se puso el blanco, el calibrador, el control patológico y las tres muestras. Esta determinación se realizó por duplicado.

• En cada tubo se puso 10 l de cada sustrato y 1 ml de solución reactiva en este caso de trigliceridos (esta solución lleva las enzimas que reaccionan con los trigliceridos que son lipoproteina lipasa, glicerol quinasa y glicerol fosfato oxidasa. este volumen de 1 ml se pipeteo con micropipeta. Al ser por duplicado se puso 1 ml x 2.

• Se incuba 5 minutos las muestras en un baño de agua que se encuentra a 37ºC para que se asemeje a la temperatura del cuerpo humano.

• Aparece en los tubos, un producto coloreado que se lleva al espectrofotometro y este da los valores de la absorbancia y de la concentración de trigliceridos en las muestras.

• Los valores tanto de colesterol y trigliceridos así como su discusión se explicaran en los siguientes apartados.

DETERMINACIÓN DE HDL Y LDL.

INTERES DE LA PRÁCTICA

Desde el punto de vista clínico, se ha atribuido a determinadas lipoproteinas el papel de factores esenciales directos en el desarrollo o en la prevención de las enfermedades cardiovasculares. De hecho, un incremento en los niveles plasmaticos del colesterol asociado a una de estas lipoproteinas, las LDL o de baja densidad, significa un mayor riesgo de padecer coronopatia, como principal manifestación de enfermedad cardiovascular, mientras que un incremento del colesterol plasmatico asociado a las lipoproteinas de alta densidad (HDL) supone una disminución de dicho riesgo.

Las lipoproteinas son esfericas, con una parte interior de naturaleza hidrofobica y oleosa, y constituida por lipidos apolares (esteres del colesterol y triacilgliceridos), recubiertos por una monocapa de lípidos anfipaticos (fosfolipidos y colesterol libre), que como tales tienen caracteristicas detergentes, y por las apoproteinas especificas.

La unión de los lipidos del núcleo a la superficie exterior de fosfolipidos y apoproteinas no es covalente, sino mediante puentes de hidrogeno y fuerzas de Van der Waals, lo que hace que sea relativamente lábil y permita el intercambio de lipidos y apoproteinas entre las distintas lipoproteinas séricas y entre éstas y los tejidos.

Los distintos tipos de lipoproteinas son:

• Quilomicrones: transportan trigliceridos.

• VLDL o lipoproteinas de muy baja densidad: transportan trigliceridos.

• LDL o lipoproteinas de densida intermedia: Transportan colesterol.

• HDL o lipoproteinas de alta densidad: Transportan colesterol.

La diferencia existente entre Las VLDL y Los quilomicrones se debe a que las VLDL transportan trigliceridos endogenos y los quilomicrones transportan trigliceridos de la dieta. Además los quilomicrones son más pequeños que las VLDL, y los quilomicrones presentan menor cantidad de proteinas. Debido a que los trigliceridos de la dieta son transportados por los quilomicrones y cuando se le realiza a un indiduo un analisis de sangre este esta en ayunas, esto quiere decir que los trigliceridos medidos proceden de las VLDL.

FUNDAMENTO DE LA TECNICA UTILIZADA.

Para observar la existencia de HDL en las muestras; se utiliza el metodo de precipitación.

Este metodo consiste en la precipitación de las lipoproteinas VLDL y LDL quedando en el sobrenadante las HDL. Para ello, se utiliza una solución de acido fosfotugstico que precipita a las VLDL y a las LDL debido a la presencia de la apoproteina B-100 en ellas mientras que en las HDL no se encuentran estas apoproteinas pero sí la A-I y A-II.

La apoproteina A-I es la más abundante dentro de las HDL mientras que La A-II es la segunda más abundante. La primera se sintetiza en el intestino y en el higado. La intestinal sale a la circulación asociada a los quilomicrones pero una en la sangre es transferida alas HDL, mientras que la hepatica sale directamente a la circulación unida a las particulas nacientes de HDL, constituyendo una parte estructural fundamental de estas lipoproteinas.

La apo B es una apoproteina cuya estructura no es bien conocida debido a su gran tamaño, a su alta insolubilidad en medio acuoso y a que forma agragados y se oxida con facilidad. Existen en dos formas, La B-100 y la B-48 como la que nos incumbe es la B-100 se ahondara en su estudio.

La apo B-100 es una proteina de 4536 aminoacidos que se sintetiza en el higado, y se encuentra en las VLDL, IDL y LDL. Esta apoproteina constituye el factor de reconocimiento de las LDL por receptores especificos que se encuentran tanto en el higado como en tejido extrahepaticos, y de esta forma desempeña un papel fundamental en la captación del colesterol transportado en dichas lipoproteinas en los tejidos.

Existen varios tipos más de apoproteinas que son la apo-C, apo-E, apo-D y apo-F.

Para realizar la precipitación se utilizó como reactivo acido fosfotugstico 0,44 mM; MgCl2 20 mM.

PROTOCOLO

Para realizar la medición de la precipitación se utiliza la tecnica de espectrofotometria donde las muestras en este caso se van a poner en tubos.

Para realizar la precipitación se hicieron los siguientes pasos:

• Se coge de la nevera un eppendorf que contiene control patologico de HDL además también se coge los tubos con las tres muestras utlizadas en las determinaciones anteriores (vease colesterol y trigliceridos). El control de HDL se utiliza al igual que el control patologico de las determinaciones anteriores donde si cae dentro del intervalo de confianza propio para HDL, la medición puede continuar.

• Se pipetean con micropipeta en cuatro eppendorf 100 l de las 3 muestras y del control de HDL (uno por cada sustrato), despues se le añade la solución precipitante (250 l), al añadir estos volumenes se ha realizado una dilución que a la hora de medir se debe tener en cuenta es decir se tiene un factor de dilución que sera de 3,5 ya que se parte de 100 l y se llega a 350 l. Se agita los cuatro eppendorf en vortex durante 10 segundos y se deja incubar durante 10 minutos.

• Después de los 10 minutos, se dejan otros 10 minutos dentro una centrifugadora donde al sacar los eppendorf se observara un sobrenadante donde se encuentran las HDL y una parte solida en el fondo del eppendorf donde estaran las LDL y VLDL.

• El sobrenadante donde se encuentran las HDL se extrae de los eppendorf 250 l por cada uno deellos y se pasan a otros eppendorf.

• Ahora, primero se coge de la nevera el blanco, el calibrador y el control patologico que va a tener la misma utilidad que en las determinaciones de colesterol y trigliceridos. La medición se realizara por duplicado al utilizar tubos. Se debe poner por cada tubo un sustrato es decir 15 l de blanco, calibrador, control patologico, control de HDL y las tres muestras además de 1 ml de solución de colesterol que presenta la misma utilidad que en las determinaciones anteriores.

• Los tubos son llevados al espectrofotometro que da los valores de absorbancia y concentración que ayudan a hallar la cantidad de colesterol que hay en las muestras, cuyos datos seran explicados en apartados siguientes.

4. RESULTADOS

Determinación de colesterol total

Para determinar colesterol trabajamos con placa. Obteniéndose los siguientes resultados de concentración de colesterol:

	Colesterol total mg/dL	Colesterol total mg/dL
Control patológico	97,545	101,520
Muestra 1 (21941)	227.680	223,899
Muestra 2 (21963)	187,466	180,511
Muestra 3 (21965)	127,581	124,911

Intervalo de confianza (Colesterol) 101-123 Intervalo admisible (Colesterol) 92-132

En los dos casos podemos validar el ensayo porque el control patológico de colesterol entra dentro del intervalo admisible. En la primera colorimetría despreciamos los valores de las muestras 1 y 3 porque difieren mucho entre si, impidiendo obtener una media aceptable. En una segunda colorimetría todos los valores obtenidos no son validos. En la tercera colorimetría obtuvimos los valores de las muestras 1 y 3. El motivo por el cual tenemos que descartar algunos valores es debido posiblemente a errores en él pipeteo, que son significativos porque trabajamos con volúmenes pequeños. Con estos datos hacemos la media de cada muestra obteniendo la concentración total de colesterol de cada muestra.

• Muestra 1 = 225.7895mg/dL

• Muestra 2 = 183.99mg/dL

• Muestra 3 = 126.246mg/dL

Determinación de triglicéridos

Para determinar triglicéridos trabajamos por duplicado, en tubos donde la concentración en triglicéridos, la medimos en un espectrofotómetro. Obteniendo los siguientes resultados:

	Triglicérido total mg/dL	Triglicérido total mg/dL
Control patológico	120.8	144.2
Muestra 1 (21941)	162.7	171.0
Muestra 2 (21963)	71.42	72.8
Muestra 3 (21965)	83.10	84.47

Intervalo de confianza(Triglicérido)134-164 Intervalo admisible(Triglicérido)118-180

En ambos casos el control patológico entra dentro del intervalo admisible, luego podemos dar la validación por válida.

Calculamos la media de estos valores para obtener la concentración total de triglicéridos de cada muestra.

Muestra 1 = 166.85 mg/dL

Muestra 2 = 72.11 mg/dL

Muestra 3 = 83.985 mg/dL

Determinación de colesterol asociado a HDL por precipitación con ácido fosfotúngstico e iones magnesio de VLDL y LDL

En esta ocasión trabajamos con tubos. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

	Colesterol HDL mg/dL	Colesterol HDL mg/dL
Control patológico	105.0	102.6
Control HDL	38.99	39.2
Muestra 1 (21941)	14.35	16.11
Muestra 2 (21963)	5.704	6.482
Muestra 3 (21965)	11.62	13.09

Intervalo de confianza (HDL) 35-42,8 Intervalo admisible (HDL) 31,9-45,9

Intervalo de confianza (Colesterol) 101-123 Intervalo admisible (Colesterol) 92-132

Con los dos valores de concentración de cada muestra, se hace la media y multiplicando por el factor de dilución que es 3,5 (100L/350L) obtenemos la concentración total de colesterol asociado a HDL para las muestras 1, 2 y 3.

Muestra 1 = 53.32 mg/dL

Muestra 2 = 21.32 mg/dL

Muestra 3 = 86,485 mg/dL

Determinación de colesterol asociado a LDL

El cálculo se realiza aplicando a la fórmula de Friedwald, para cada una de las muestras, los valores de triglicéridos totales, colesterol total y colesterol asociado a HDL, obtenidos en los apartados anteriores.

LDL-C= CT- HDL-C- VLDL-C; Siendo VLDL-C= 0.2 x TG

Muestra 1 = 139.097 mg/dL

Muestra 2 = 148.24 mg/dL

Muestra 3 = 23.004 mg/dL

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

MUESTRA	TRIGLICÉRIDO TOTAL (mg/dL)	COLESTEROL TOTAL (mg/dL)	COLESTEROL HDL (mg/dL)	COLESTEROL LDL (mg/dL)
1	166.85	225.7895	53.32	139.097
2	72.11	183.49	21.32	148.24
3	83.785	126.246	86.485	23.004

5. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Para el diagnóstico de hipercolesterolemia se recomiendan los siguientes límites:

	Colesterol total	Colesterol-HDL	Colesterol-LDL
Sospechoso:	>200 mg/dL	<55 mg/dL	> 130 mg/dL
Elevado:	>240 mg/dL	<35 mg/dL	> 150 mg/dL

Para el diagnóstico de hipertrigliceridemia se recomiendan los siguientes límites:

Sospechoso:	>200 mg/dL
Elevado:	>240 mg/dL

Muestra 1

Observando los resultados obtenidos del paciente de la muestra 1, vemos que presenta valores relativamente elevados de triglicéridos (mayores de 150) y de colesterol total y LDL( mayores de 200 y 130 respectivamente) y valores bajos de colesterol HDL (menor de 55). Con lo que solo podemos tener la sospecha de una posible hipertrigliceridemia y una hipercolesterolemia.

Muestra 2

El paciente de la muestra 2 presenta valores muy bajos de colesterol HDL y relativamente altos de colesterol LDL, datos que identifican una posible hipercolesterolemia del tipo Iia.

Muestra 3

El paciente de la muestra 3 se ajusta a unos valores aceptables que nos permiten afirmar que está sano.

PRACTICA 2: PEROXIDACIÓN LIPIDICA

INTERES DE LA PRÁCTICA

La peroxidación de los acidos grasos poliinsaturados (PUFAS) también es una forma alternativa de su degradación, catalizada por enzimas presentes en reticulo endoplasmatico con la liberación de un atomo de hidrogeno y formación de radicales libres, que reajustan las posiciones de sus dobles enlaces. A estos dobles enlaces se incorpora oxigeno molecular, dando lugar a la formación de hidroperoxidos o endoperoxidos, que terminan rompiendose en aldehidos de cadenas cortas.

Un radical libre es una especie con un electrón desapareado; es muy reactiva y para oxidar lo que realiza es una captación de un electrón de otra molecula. Estas especies son responsables de la oxidacioón de lipidos, proteinas y ADN.

Existen dos sistemas antioxidantes: enzimatico que presenta la enzima catalasa y el no enzimatico quie presenta vitamina E y C asi como -carotenos.

El proceso de oxidación que se produce se debe a un desequilibrio entre la formación del radical y la salida de este va a dar lugar al llamado estress oxidativo esto indica que hay una alta concentración de oxidantes que oxidan todo, esto se piensa que produce enfermedades tales como el envejecimiento y cancer.

Se ha visto que los LDL son susceptibles a ataques de radicales libres (oxidación). Las LDL pueden jugar un papel importante en la aterosclerosis. Se supo por estudio de placas de ateroma donde se observó una gran cantidad de lipidos.

Se realizaron estudios “in vitro” donde se observó la formación de LDL modificadas mediante la acetilación o tratamiento de dialdehido malónico de las LDL purificadas, que van a tener un papel fundamental en el proceso de formación de las células espumosas, que estan cargadas de grandes cantidades de colesterol y que se forman en el endotelio vascular durante el desarrollo de la placa de ateroma. De ahí su potencial transcendencia fisiopatologica.

El mecanismo por el cual las LDL se dicen que dan aterosclerosis es:

Las LDL se captan en el interior de la celula por unos receptores de LDL; estos receptores son saturables si les llega muchas LDL se impide su captación. Estos receptores evitan la acumulación de colesterol en el organismo. Sin embargo, las LDL cuando se oxidan se modifican de tal manera que los receptores no las reconoce y van a ser reconocidas por otros receptores “scavenger” y al ser reconocidas pasan al interior de celula. Al no ser saturables; se produce un acumulo de colesterol con alta concentración de colesterol y se llaman celulas espumosas. Estas celulas se acumulan en la pared del vaso hasta que se obstruye el vaso y se da la lesión de aterosclerosis.

FUNDAMENTO DE LA TECNICA.

Se quiere conseguir que los acidos grasos poliisaturados con dobles enlaces aislados se conviertan en hidroperoxidos de ácido graso con dobles enlaces conjugados (dienos) los cuales absorben a 234 nm. Para ello se parte de LDL sin oxidar que se van a encontrar en una columna con gel donde se va realizar la extracción de estas LDL con un tamón fosfato que sirve para lavar todo el contenido de LDL ya que esta unido a EDTA que es antioxidante por lo que para poder oxidarlas es necesario eliminarlo.

El otro reactivo utilizado es sulfato de cobre que se utiliza para formar los radicales libres.

Los dos reactivos deben ser preparados, los datos de estos estaran en apartados siguientes.

La columna con gel se refiere a cromatografia en gel donde esta tecnica se basa en tener una fase movil liquida o gaseosa que pasa por el gel donde los poros son suficientemente pequeños para excluir moleculas grandes de soluto, pero no las pequeñas. Las moleculas pequeñas requieren más tiempo para pasar a través de la columna porque entran en el gel y por tanto deben fluir a través de un volumen más grande antes de ejar la columna, Esta tecnica se llama también de exclusión molecular y separa por tamaño.

Para el estudio de la formación de los dienos conjugados es necesario el estudio de su cinetica que esta en parte relacionada con un componente de las LDL que es la Vitamina E (antioxidante):

Absorbancia (nm)

Fase de descomposición

Fase de propagación | /t ! velocidad de propagación

|

_ _ _|

<___ Fase de retardo

tiempo (minutos)

Figura 2: Cinetica de dienos conjugados.

En esta figura se observa que la fase de retardo presenta una absorbancia pequeña esto se debe a la vitamina E que evita el ataque de los radicales libres a los acidos grasos poliinsaturados. El aumento de absorbancia se debe a que todos los antioxidantes se han terminado por lo que los radicales atacan a las LDL y se empezaran a formar los dienos (fase de propagación). En la fase de descomposición, los dienos pasan a ser peroxidos.

Los peroxidos formados dan lugar a TBARS debido a la reacción de los peroxidos con él acido tiobarbiturico. Posteriormente los aldehidos se transforman en productos de fragmentación, estos reaccionan con la parte proteica de las LDL y da lugar al aumento de carga negativa de la proteina y un aumento de la movilidad electroforetica es decir cuanto mayor carga mayor movilidad del compuesto por acción del campo electrico.

PROTOCOLO.

Para realizar la medición y posterior determinación de la cinetica de dienos se utiliza la tecnica de espetrofotometria por la cual aparece una grafica semejante a la del apartado anterior donde se representa la curva de dienos frente al tiempo. Los cambios producidos se observan a una absorbancia de 234nm en función del tiempo de oxidación los cuales se establecen mediante la sutracción de la absorbancia inicial del resto de valores.

Los pasos a seguir son los siguientes:

• Se equilibra la columna Econo-Pac 10 DG con un volumen de 20 ml de PBS (hasta que este completamente llena).

• Una vez vacia añadir con una pipeta 600 l de la solución de LDL.

• En la columna se observa un color amarillo caracteristico de las LDL debido a los carotenoides. Para poder extraerlas se debe añadir 2,4 ml de PBS utilizados para separa el Edta de las LDL, este volumen se añade en tres veces es decir 0,8 ml por vez.

• Cuando las LDL esten cerca de ser extraidas se pone otro volumen de 0,8 ml de tampón fosfato el cual permite que extraer las LDL que son recogidas en un eppendorf.

• Se debe realizar una determinación de colesterol en las LDL para ello, se utiliza el mismo procedimiento que en las determinaciones de colesterol y trigliceridos, es decir se coge tres eppendorf que contienen blanco, calibrador, control patologico y las muestras con LDL antes de la extracción y después de la extracción. Todos estos sustratos se ponen en una placa que se lleva un medidor de placas y se determina asi el contenido de colesterol en LDL, para saber la concentración que hay de LDL es necesario saber que el contenido en colestrol de las LDL es de 31,6%.

• Ahora para poder realizar la cinetica de dienos conjugados se debe poner en dos cubetas una solución que ocupe un volumen total de 1 ml donde debe haber:

• PBS buffer hasta 1 ml (1 ml - volumen LDL -volumen solución sulfato de cobre).

• LDL para obtener una cocentración final de 0,25mg/ml.

• Sulfato de cobre de 5M y de 0,5 M.

Estos compuestos se añaden con micropipeta.

• Las dos cubetas se introducen en espectrofotometro y se mide la absorbancia.

• Posteriormente los productos de la cubeta se introducen cada uno en un tubo y posteriormente se realiza con ellos un lipidograma que sera explicado a continuación.

4. RESULTADOS.

Cálculos de las disoluciones

Tampón fosfato

150.10-3M = gr NaCl/58,44/1L ! gr NaCl=8,766

10.10-3M = gr Na2PHO4 /141,96/1L ! gr Na2PHO4=1,4196

Solución de CuSO4 100 mM y por dilución dos soluciones de concentraciones 10mM y 0,1 mM

100.10-3M = gr CuSO4 /249,68/50.10-3L ! gr CuSO4=1,248

Con esta solución por dilución formamos las otras dos soluciones

100 mM . V = 50 ml . 10 mM ! V= 5 ml

10 mM . V = 50 ml . 0,1 mM ! V= 0,5 ml

	Colesterol total mg/dL	Colesterol total mg/dL
Control patológico	112,369	91,544
LDL-C con EDTA	148,431	160,114
LDL-C extraído	60.13	47.78

Intervalo de confianza (Colesterol) 101-123 Intervalo admisible (Colesterol) 92-132

Puedo validar el ensayo porque el primer y el tercer valor del control patológico entran dentro del intervalo de confianza. El segundo al no entrar ni siquiera en el intervalo admisible lo descartamos.

Con los datos de LDL-C con EDTA o concentrado hallo la media descartando el segundo valor porque difiere bastante de los otros dos. Para LDL-C extraído de la columna también hallo la media.

LDL-C con EDTA =149,193 mg/dL

LDL-C extraído = 53.955 mg/dL

Sabiendo que las LDL poseen un contenido en colesterol de 31,6%, calculamos la masa total de las LDL

LDL-C con EDTA = 149,193 x 100/31,6= 102,04 mg/dL = 472,129 mg/mL

LDL-C extraído =53.955*100/31,6= 170.743 mg/dL= 1.707 mg/mL

En las cubetas de cuarzo se añade: PBS buffer hasta 1 ml (1 ml- volumen LDL-volumen solución CuSO4). La concentración final de LDL en cada una de las cubetas tiene que ser 0,25 mg/mL y la concentración de LDL que tenemos en el eppendorf es de 2,1734 mg/dL. Por tanto calculamos que volumen de LDL tenemos que pipetar del eppendorf para tener en las cubetas una concentración de 0,25 mg/mL.

2,1734mg/mL . V= 0,25 mg/mL . 1 mL ! V= 0,115 mL =115L

En cada una de las dos cubetas vamos a introducir también CuSO4 en concentraciones 5M para la cubeta más concentrada y 0,5 M para la menos concentrada. Partiendo de la disolución de CuSO4 0,1 mM anteriormente preparada, hallamos que volumen necesitamos de esta disolución para tener en las cubetas estas concentraciones de CuSO4.

0,1.103M . V = 5M . 1000 L ! V= 50 L

0,1.103M . V = 0,5M . 1000 L ! V= 5 L

En consecuencia en la cubeta con mayor concentración de CuSO4 tendremos que añadir 804 L de PBS

1000 L - 146 L de la solución de LDL extraída de la columna -50 L de CuSO4 = 804 L de PBS

Para la cubeta con menor concentración de CuSO4

1000 L - 146 L de la solución de LDL extraída de la columna -5 L de CuSO4 = 849 L de PBS

Con los datos de las demás taquillas construimos la siguiente tabla:

Nº DE MUESTRA	F. RETARDO (min)	PENDIENTE	TAQUILLA
1	66.66	0.0294	1-2
2	141.6	0.0112	1-2
1	55.3	0.0217	5-6-7
2	141.2	0.0089	5-6-7
1	63.43	0.0236	3-4
2	142.5	0.0088	3-4

DISCUSIÓN

Con los datos obtenidos de absorbancia en función del tiempo obtenemos una gráfica en la que observamos que la fase de retardo es menor para la cubeta que tiene mayor concentración de CuSO4. Esto es debido a que los antioxidantes (como la vitamina E) se consumen antes y comienza más pronto la oxidación de las LDL por el CuSO4 que forma los radicales libres que atacan al PUFA y forman los dienos conjugados.

Respecto a la velocidad de propagación como es lógico es mayor cuánto menor es el tiempo de retardo.

Comparando los resultados con el de las otras taquillas observamos que nuestra muestra 2 presenta una menor susceptibilidad a la oxidación de las LDL que los otros dos pacientes al presentar una menor velocidad de propagación. Tiene por tanto menor riesgo de padecer aterosclerosis o enfermedades cardiovasculares.

LIPIDOGRAMA

INTERES DE LA PRÁCTICA.

El componente proteico (apolipoproteinas o apoproteinas)de las lipoproteinas induce también diferencias en su punto isoélectrico; de ahí que su desplazamiento en la electroforesis sea distinto de unas a otras. Precisamente la denominación que a veces se utiliza de lipoproteinas pre- (VLDL),  (LDL) o  (HDL) se debe a su migración respectiva en relación con las globulinas pre- y , mientras que los quilomicrones permanecen debido a su gran tamaño en el punto de aplicación de la muestra, tambien denominado origen de la electroforesis.

Esta introducción se hace para poder explicar que un lipidograma es una tecnica que se basa en que las lipoproteinas migran hacia el anodo al someterlas a un campo electrico. Para ello, el medio debe de tener un PH alcalino para permitir la expresión de una carga negativa neta en las apolipoproteinas.

FUNDAMENTO DE LA TECNICA.

El lipidograma es un tipo de electroforesis que se utiliza para separar liporpoteinas del suero y esto se realiza por migración en función del tamaño.

El lipidograma se realiza en una placa recubierta por un gel de agarosadonde se van a colocar las primeras muestras que se han utilizado desde la determinación del colesterol, las LDL oxidadas y unas LDL sin oxidar. En este gel hay 8 posiciones donde en cada una sé pondra las muestras antes citadas.

Despues las placas se introducen en electroforesis con tampón barbital que produce PH basico para que las muestras tengan carga negativa y estas lipoproteinas migran: cuanto mayor carga negativa más migran y cuanto menor tamaño más migran.

También debido al mayor numero de proteinas migrarn más o menos:

• Las que más migran son las HDL al presentar un mayor numero de proteinas, despues las VLDL de las cuales sé vera un rastro despues las LDL y las que no migran son los quilomicrones ya que al estar en ayunas el individuo no presenta apenas proteinas.

• De las LDL oxidadas y la oxidada migraran más que las LDL de las muestras esto se debe a que cuando se oxida una muestra primero lo hace la parte lipidica, se forman los TBARS, reacciona la parte proteica y se cargan más negativamente por lo que sé veran más arriba.Con respecto a las LDL sin oxidar su movilidad se modifica poco y aparecen como las LDL de las muestras.

• Tambien se va a ver una proteina que es la albumina que al transportar lipidos también se tiñe.

Los reactivos utilizados son:

• Lipo gel: 0,5% de Agarosa, 1% de tampón barbital, 0,1% de azida sódica.

• Tampón barbital B-2, 18,2 g: 5,5 ácido dietilbarbiturico 10 nm; sal sodica del ácido dietlbarbiturico 50 mM.

• Sudan black, 7% (p/p).

PROTOCOLO

Para poder observar el lipidograma es necesario fijar y despues teñir las lipoproteinas para ello se deben seguir los siguientes pasos:

• El gel se encuentra dentro de un embalage que contiene un liquido que mantiene mojado el gel. Se debe tener cuidado para coger el gel debido a que si hubiese alguna marca se puede producir interferencias en la lectura; la forma mejor de sujetar el gel sera por los extremos del mismo.

• El gel se deposita en un papel de fltro y para secarlo es necesario poner sobre él, papel de filtro del tamaño del gel (secante de geles). Despues se pone sobre el gel, una plantilla, esta debe estar alineada con el punto c que se encuentra en el gel. Se debe pasar de forma suave el dedo sobre la plantilla para asegurar un buen sellado. Sobre cada ranura de la plantilla se pone las 3 muestras, las dos LDL oxidadas, la LDL no oxidada y en las ranuras que faltan se puede poner una repetición de las muestras, de las LDL oxidadas o la LDL no oxidada. Como las LDL oxidadas estan muy diluidas se debe poner dos veces.

• Se van a aplicar 5 l sobre las ranuras (de las LDL oxidadas, 10 l), un producto por cada ranura. Se debe esperar 5 minutos para que difundan bien. Se seca la plantilla con secante para plantillas. Se desechan el secante y la plantilla.

• Ahora se debe colocar sobre el puente de la cubeta, el gel. En dicha cubeta anteriormente, se ha puesto tampón barbital B-2 que reacciona con las lipoproteinas. El gel debe alinearse de forma que su posición positiva este con la posición positiva de la cubeta y la negativa con la negativa de la cubeta. Se coloca la cubeta en la fuente de alimentación. Se fija la tensión a 100 voltios y se mantiene la electroforesis durante 30 minutos.

• Se retira el gel de la cubeta, se coloca en un margen de geles. Ahora este marco de geles con el gel, se introduce en la primera solución de una secuencia de soluciones que van a dar lugar a la tinción de las lipoproteinas. Esta primera solución sirve para fijar las lipoproteinas en el gel, se deja 5 minutos en esta solución.

• Cuando se saca de la solución, se seca en un secador durante 20 min.

• Despues del secado se realiza las siguientes secuencia de soluciones:

• Solución 2: 5 minutos.

• Solución 3: 3 inmersiones.

• Solución 4: 3 inmersiones.

• Solución 5: 5 minutos.

• Despues de esta secuencia se debe limpiar los tintes con agua del grifo. Se saca el gel del marco de geles y se vuelve a poner en el secador. Se deja en él, 20 minutos y cuando se retira de este ya se observa como ha sido la movilidad de las lipoproteinas.

• Se debe evaluar el gel visualmente y si se parece a la determinación de colesterol que se realizó.

RESULTADOS

Lipidograma correspondiente a la práctica de determinación de colesterol y triglicéridos en suero y en lipoproteinas:

Los puntos 1, 4 y 7 corresponden a la muestra 1(21941)

Los puntos 2, 5 y 8 corresponden a la muestra 2(21963)

Los puntos 3 y 6 corresponden a la muestra 3(21965)

El lipidograma correspondiente a la peroxidación lipídica debido a un fallo en la aplicación de las muestras no se pudo observar una correcta migración. Adjuntamos a continuación el lipidograma de la taquilla 2:

DISCUSIÓN

Las lipoproteínas migran al polo positivo en función de su carga y su tamaño. El tamaño influye porque al ser más grande la molécula la carga está más repartida, o lo que es lo mismo, tiene menor densidad de carga.

Los quilomicrones no se ven porque la muestra de sangre extraída de los pacientes se realiza en condiciones de ayuno. Son los que migran menos porque son las más grandes de todas y las que tienen menor cantidad de proteínas y como consecuencia menor porcentaje de aminoácidos cargados negativamente.

En nuestro lipidograma vemos que las que avanzan menos hacia el polo positivo son las LDL que son las lipoproteínas más grandes que constituyen nuestra muestra. Luego pegadas a ellas aparecen las VLDL. Estas lipoproteínas VLDL tienen mayor diámetro y menor contenido proteico que las LDL pero tienen grupos apo B-100, A, C y E que exponen mayor número de cargas negativas que un solo apo B-100, que es el único apo existente en las LDL. Por último migran las HDL porque presentan mayor porcentaje de proteínas y son las de menor diámetro ó tamaño. Arriba del todo aparecen los agregados de albúmina que transportan ácidos grasos libres. Se tiñe porque tiene lípidos y avanza más porque el tamaño es menor que el de cualquier lipoproteína.

Respecto a las LDL oxidadas observamos que migran más que las LDL sin oxidar porque los radicales libres reaccionan con la parte lipídica formando los TBARS que reaccionan con la parte proteica provocando un aumento en la carga negativa de la proteína. Cuánto más oxidada está la proteína, más migra al polo positivo y por tanto de las muestras de LDL oxidadas migra más la muestra a la que se añadió mayor cantidad de CuSO4.

Las LDL que se pincharon solas migran un poco más que las LDL de las muestras que llevan otras lipoproteínas. Por tanto el resto de las componentes de la muestra influyen en la movilidad.

De un lipidograma es posible hacer un análisis cuantitativo de lipoproteínas. En nuestro lipidograma podemos apreciar que la muestra dos presenta un menor contenido en HDL lo que se corrobora con los datos obtenidos en la colorimetría. También se observa que todas las muestras presentan cierto contenido en albúmina ya que son las responsables del transporte de ácidos grasos provocando que se tiñan con el colorante utilizado para lípidos. Para el resto de lipoproteínas no observamos diferencias entre cada una de las muestras.

PRACTICA 3: HORMONAS.

INTERES.

Las hormonas se han definido desde siempre como productos de las glandulas endocrinas que pasan a la circulación sanguinea para alcanzar los correspondientes tejidos diana o blanco, donde desencadenan sus efectos biologicos finales.

Dentro de las hormonas se encuentra la insulina que es reguladora del metabolismo de los carbohidratos, lipidos, aminoacidos e iones la cual tiene respuestas celulares a ella muy diversas pero todas estas respuestas estan iniciadas con la interacción de la hormona con un receptor localizado en la membrana plasmatica, este receptor es una glicoproteina de naturaleza tetramerica compuesta por dos subunidades alfa unidas por puentes disulfuro. La insulina la entrada de glucosa en sangre y va a producir la enfermedad de la diabetes.

La diabetes se define como un sindrome de etiologia multiple, caracterizado por un conjunto de problemas que van a tener como origen la herencia. Como denominador común destaca la hiperglucemia, que se ve acompañada de alteraciones en el metabolismo de los lipidos y los aminoacidos. Existen dos tipos de diabetes: insulino-dependiente e insulino no dependiente; la primera se da desde jovenes y la segunda a mediana edad.

FUNDAMENTON DE LA TECNICA.

Para detectar la insulina se debe hacer por medios inmunologicos ya que no se puede detectar por medios enzimaticos colorimetricos por presentar una concentración baja. El metodo inmunologico es más sensible.

Mediante el ensayo inmunologico se realiza un reconocimiento entre antigeno y anticuerpo por lo que va a seguir una cinetica muy parecida a la cinetica enzimatica.

La reacción sería asi:

Antigeno + Anticuerpo _____# Complejo antigeno-anticuerpo.

Donde al anticuerpo se le puede unir otra molecula:

• Enzima: La detección seria por colorimetro. También se llama enzimoinmunoensayo.

• Isotopo radiactivo: detección radiactiva

• Emisión de luz: la detección seria con Luminometro.

• Si la molecula es fluorescente: la detección sera con fluorimetro.

La tecnica que se utiliza es el metodo ELISA: Es un enzimoinmunoensayo con superficie solida donde ocurre la reacción (unión a la superficie donde se puede unir el antigeno o el anticuerpo.

Existen dos tipos de ELISA: directo e indirecto.

ELISA indirecto: Se enclava en los pocillos primero anticuerpos a los que se les añade un antigeno con la muestra despues se añade un segundo anticuerpo marcado con un enzima, la enzima es una peroxidasa. Seria forma tipo “sandwich”. Posteriormente se lava para eliminar los anticuerpos conjugados. Despues se añade un cromogeno TMB (3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina) que permite detectar el anticuerpo, junto al cromogeno se añade agua oxigenada que permite la oxidación del TMB, esto se observa por su color azul. El desarrollo del color se detendrá con la adición de acido sulfurico y el color tornara a amarillo. Este color sé medira en un lector de placas a 450 nm.

Se llama directo porque la absorbancia es proporcional a la intensidad de color. Cuanto mayor insulina mayor cantidad de anticuerpos se une y mayor clor amarillo.

ELISA indirecto: Se enclava en los pocillos un anticuerpo, despues se añade la muestra sin el antigeno, despues de esta adición se añade el antigeno marcado con un enzima. Posteriormente se va a añadir TMB y agua oxigenada que da lugar a la oxidación de TMB.

Se llama indirecto porque a menor concentración de insulina mayor concentración de TMB oxidado por la peroxidasa debido a que se añade mayor cantidad de antigeno.

Los reactivos utilizados son:

• Conjugado anti-insulina de rata marcado con HRP (peroxidasa de rábano).

• Tampón para el conjugado.

• Solución sustrato A (TMB).

• Solución de parada: acido sulfurico 1N

• Soluciones estándar de insulina liofilizada : 0-0,15-0,4-1-3 y 5,5 g/l.

• Solución de lavado concentrada.

PROTOCOLO.

La tecnica a utilizar es una colorimetria que se realiza en un lector de placas.

Los pasos a seguir son:

• Se utiliza una placa microtiter que es diferente a la utilizada en las determinaciones anteriores. La diferencia se encuentra en el soporte ya que antes la placa estaba llena de pocillos mientras que en este caso los pocillos son independientes del soporte.

• Para rellenar los pocillos se deben utilizar además de 2 muestras que se dan en dos eppendorf, 6 muestras standard que van a permitir realizar una curva de calibrado. Tanto muestras como muestras standard se ponen por duplicado para obtener una mayor precisión en él calculo de los resultados. Loas pocillos se rellenan con micropipeta y el volumen de las muestras es de 25 l.

• Se agita durante 15 segundos para que se mezclen bien los productos.

• Se añaden con multipipeta 50 l de la solución con el anticuerpo conjugado (marcado con la peroxidasa) a cada pocillo. Para cada producto (solución con el anticuerpo conjugado, solución de lavado, solución de sustrato y solución de parada) que se añade se tiene una jeringa para la multipipeta.

• La muestra 2 al estar muy concentrada fue necesario diluirla y esto se realizó con la muestra standard de 0 g/l, sé podia diluir 1/3,1/4 o 1/5; en nuestro caso se diluyó ¼ .

• Se agitaba durante 15 segundos y se dejaba incubar en un hinchador de placas durante 1 horay media a temeperatura de 37ºC (temperatura fisiologica).

• Se elimina el contenido de los pocillos en una bandeja y se lavan estas 5 veces con 300 l de la solución de lavado, la cual ha sido anteriormente diluida 1/20. Despues del ultimo lavado se invierte la placa y se golpea contra un papel de filtro, para segurar que no queda liquido en el interior de los pocillos.

• Se añade 200 l de solución sustrato a cada pocillo. Se agita durante 15 segundos y posteriormente se introduce los pocillos en la taquilla ya que el sustrato es sensible a la luz, esto se realiza durante 15 minutos.

• Se detiene la reacción enzimatica añadiendo 50 l por cada pocillo de solución de parada. El color azul debido al TMB oxidado se torna amarillo.

• Se llevan los pocillos al lector de placas y se mide su absorbancia a 450 nm. La grafica resultante sera explicada en apartados posteriores.

• Por ultimo se detiene la reacción con bicarbonato ya que tenemos acido sulfurico en la reacción y el bicarbonato es una base.

RESULTADOS

Construimos una curva estándar trazando un gráfico de D.O. (promedio de los resultados) (eje Y) obtenidas para cada referencia estándar contra su concentración en L (eje X) en escala semilogarítmica.

Por interpolación en la curva de calibrado obtenemos la concentración de insulina de cada muestra teniendo en cuenta el factor de dilución que es ¼.

	Concentración (g/L)	Concentración (g/L)
Muestra 1	3,852	4,272
Muestra 2	18,612	16,472

Haciendo la media de los dos valores de concentración obtenemos la concentración final de insulina de cada muestra:

Muestra 1 = 4,062 g/L

Muestra 2 = 17,542 g/L

DISCUSIÓN

A falta de una tabla que contenga los niveles normales de insulina en rata, la única conclusión que podemos sacar es que la rata a la que pertenece la muestra 2 tiene más bajos los niveles de insulina. Si suponemos que la rata a la que pertenece la muestra 1 tiene unos niveles de insulina normales de insulina, la rata a la que pertenece la muestra 1 es insulino-dependiente.

BIBLIOGRAFIA.

• BIOQUIMICA. E.Herrera. Volumen 1 y 2. Editorial interamericana-McGRAW HILL. Paginas 575,577 y 667-670.

• Biologia. Curtis Barnes. Editorial medica panamericana. Pagina 95.

• Analisis quimico cuantitativo. Daniel C.Harris.Grupo editorial Iberoamerica. Pagina 539.

• Avances en diabetes. J.P.Marañes. Editorial ELA. Pagina 15.