DATA D´INICI : 20 / 3 / 2003

DATA DE FINALITZACIÓ : 1 / 4 / 2003

TÍTOL : DETERMINACIÓ PRESSUMTIVA I CONFIRMATIVA DE ESTREPTOCOCS FECALS. I DETERMINACIÓ CONFIRMATIVA DE CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORS.

OBJECTIU : Determinar pressumtivament i confirmar l´existència de estreptococs fecals de l´aigua d´un reactor,mitjançant la taula del NMP.

Determinar confirmativament els clostridium sulfit reductors d´un aigua d´un reactor.

FONAMENT TEÒRIC :

Solució tamponada estèril : Permet el creixement del microorganisme però no permet que es reprodueixi.

Dilució : passar de major concentració a menor mitjançant transferències de volum.

Medi d´enriquiment : medi on hi ha microorganismes que provoca la duplicació d´aquest concentrant-los encara , que sinó hi ha microorganismes no enriqueix1.5

Medi selectiu :afavoreix el creixement d´uns microorganismes determinats i inhibeix el creixement dels altres.

Estreptococs fecals :cocs gram positius anaerobis facultatius, fermenten sucres en producció d´àcid

Clostridium sulfito reductors :anaerobis estrictes.

PROCEDIMENT :

Preparar dilucions:

• Agafar els tubs amb la solució tamponada estèril

• Obrir la mostra de l´aigua del reactor, flamejant la boca del tap

• Introduir 1mL de la mostra al primer tub

• Flamejar el tub i tapar

• Homogeneïtzar el tub (dilució 10-1)

• Canviar la punta de la micropipeta

• Agafar 1mL de la dilució -1

• Introduir-la en un altre tub amb solució tamponada estéril.

• Flamejar el tub i tapar

• Homogeneïtzar el tub (dilució 10-2)

• Canviar la punta de la micropipeta

• Agafar 1mL de la dilució -2

• Així fins arribar a la dilució desitjada, en aquest cas 10-5

Prova presumptiva d´estreptococs (medi rothe simple) :

• Obrir el tub amb major dilució ( 10-5)

• Flamejar el tub i el tap a la flama del bec bunsen

• Introduir la micropipeta i pipetejar 1mL

• Agafar el tub amb el medi rothe i obrir-lo flamejant el tap i el tub

• Introduir el mil·lilitre de mostra

• Homogeneïtzar per rotació suau

• Repetir la sembra per triplicat de cada dilució

• Incubar a 37ºC durant 48h com a màxim

• Lectura de tubs positius

• Consulta a la taula del NMP

Prova presumptiva d´estreptococs fecals (medi rothe doble concentrat) :

• El procediment és el mateix però el medi de cultiu està preparat doblement concentrat

• Es repeteix la sembra per triplicat per a cadascuna de les dilucions con al anterior

Prova confirmativa d´estreptococs fecals (medi EVA) :

• Agafar la dilució més baixa que hagi donat positiva a la prova anterior

• flamejant el tap i el tub

• Introduir la micropipeta i pipetejar 0.5mL

• Agafar el tub amb el medi EVA obrir-lo flamejant el tap i el tub

• Introduir la mostra

• Homogeneïtzar per rotació suau

• Repetir la sembra per triplicat de cada dilució

• Incubar a 37ºC durant 48h com a màxim

• Lectura de tubs positius

Prova de la determinació confirmativa de Clostridium sulfito-reductors (medi SPS):

• Començar per la dilució inicial (10-5)

• Flamejar el tub i el tap a la flama del bec bunsen

• Introduir la micropipeta i pipetejar 1mL de la dilució

• Agafar el tub amb el medi SPS i obrir-lo flamejant el tap i el tub

• Introduir el mil·lilitre de mostra sembrant-lo des de la part inferior fins a la part superior del medi expulsant-lo molt poc a poc

• Homogeneïtzar per rotació molt suaument

• Deixar solidificar

• Fer les sembres per duplicat

• Anar a la campana i posar 5mL de vaselina estèril.

• Incubar a 46ºC durant 24h

• Observar els tubs

• Fer la lectura

MATERIAL :

• Bec bunsen

• Homogeneïtzador

• Tubs d´assaig grans i petits

• Gradeta

• Vas de precipitats 500mL

• Proveta 100mL

• Proveta 10mL

• Espàtula

• Vareta de vidre

• Trespeus

• Reixeta

• Encenedor

• Micropipeta

• Puntes de micropipeta estèrils

• Pipeta pasteur

• Campana estèril

REACTIUS :

• Solució tamponada estèril

• Potassi hidrogen fosfat

KH2PO4

p.m:136.09 g/mol

puresa:98%

• Sulfat de magnesi

MgSO4

p.m:246.48g

puresa:100%

• Medi rothe simple i doble concentrat ( R22 , S45 )

• Medi àcida i violeta lila (EVA) (R22 , S45)

• SPS

• Aigua destil·lada

• Vaselina estèril

FRASES DE SEGURETAT:

Medi Rothe i EVA:

• R22 nociu per ingestió

• S45 en cas d´accident o malestar anar immediatament al metge ( si es possible mostrar etiqueta)

DADES EXPERIMENTALS :

Pesos dels medis

Resultats de la lectura dels tubs ( reactor ):

CÀLCULS I RESULTATS :

Rothe simple

34.7g

250mL x --------------- = 8.675 g

1000mL

EVA

35.8g

150mL x --------------- = 5.37 g

1000mL

- Taula NMP (311) 75 / 0.01 = 7500ufc

Rothe simple

40 g

200mL x --------------- = 8.00 g

1000mL

Dilució 10-2

5 + 33 / 2 = 19 colònies ; 19*100/1 = 1900ufc

Dilució 10-3

7 + 2 / 2 = 3.5 colònies ; 3.5*1000/1 = 350ufc

Dilució 10-4

No es detecta creixement

Dilució 10-5

1 + 0 / 2 = 0.5 colònies ; 0.5*100000/1 = 50000ufc

Dilució 10-2 + Dilució 10-3 : 1900 + 3500 / 2 = 2700ufc clostridium

OBSERVACIONS I CONCLUSIONS :

• La prova en medi EVA només és fa per a les dilucions que en el medi rothe hagin donat positives.

• Per fer les sembres si se sembra de menys a mes concentrat no cal canviar la punta de la micropipeta.

• La sembra en el medi rothe és per a la determinació presumptiva d´estreptococs fecals.

• A mesura que augmentava la dilució la contaminació era menor.

• La lectura dels tubs era positiva degut al sediment verdós i la turbidesa del medi

• Suposo que aquest aigua té una gran contaminació ja que en totes les dilucions ha sortit almenys un tub positiu.

• Crec que hauríem d´haver elevat el grau de dilució degut a la elevada contaminació del reactor.

• La sembra en el medi EVA és per a la determinació confirmativa d´estreptococs fecals.

• Només es sembren els tubs que han donat positiu a l´anterior prova.

• En els tubs positius es forma turbidesa i sediment blau

• La majoria de tubs han donat positiu en la confirmativa i el nombre de UFC d´estreptococs fecals és de 7500/mL

• Aquest aigua té una elevada contaminació fecal.

ANNEX :

Medi Rothe ( 34,7 g per litre, esterilitzar 15 minuts a 121ºC )

Composició g/L

Sodio azida 0.2

D(+) Glucosa 7.5

Extracte de carn 4.5

Peptona 15.0

Clorur sòdic 7.5

Medi EVA ( 35.8 g per litre, esterilitzar 15 minuts a 121ºC)

Composició g/L

Sodio azida 0.4

D(+) Glucosa 5.0

Violeta de etilo 0.0008

Mescla de Peptona 15.0

Clorur sòdic 5.0

Potasio dihidrogeno fosfato 2.7

Medi SPS ( 40 g per litre, esterilitzar 15 minuts a 121ºC)

Composició g/L

Sulfit de sodi 0.5

Sulfat de polimixina 0.01

Sulfadiazina 0.12

Peptona de caseina 15.0

Extracte de llevadura 10.0

Citrat de ferro 0.5

Agar bacteriològic 13.0