PRACTICA Nº 1

EXAMEN COPROPARASITOLOGICO

INTRODUCCIÓN: Este examen es un estudio de materia fecal, indicado en sospechas de infestaciones por parásitos, utilizando diferentes técnicas y posterior observación microscópica, se pueden observar formas parasitarias de quistes o huevos.

Para ello se debe recolectar muestras de materia fecal de 3 a 5 días consecutivos en dos frascos:

* 1 frasco de boca ancha con formol al 5%.
* 1 frasco sin conservantes (muestras en fresco) para detectar la presencia de protozoarios. Por Ej. Giardias y Coccidios.

Rutinariamente se recomienda, cada 4 a 6 meses, se debe realizar un análisis de materia fecal y desparasitar basándose en los resultados.

OBJETIVO: Que el alumno aprenda a realizar TODOS los métodos más utilizados en un laboratorio. También que identifique los huevecillos, larvas, quistes y trofozoitos de los parásitos a observar.

MATERIAL: Según sea el método a realizar...

EXAMEN COPROPARASITOLOGICO DIRECTO:

Es un método que es muy fácil de realizar y que nos ayudará a encontrar huevecillos, trofozoitos, larvas y quistes de helmintos y protozoarios.

MATERIAL: REACTIVOS:

Guantes Solución salina al 0.9 %

Cubre bocas Solución de Yodo Lugol

Porta objetos

Cubre objetos

Tubos de ensayo

Aplicadores

Pipeta Pasteur

Frasco recolector

EQUIPO: BIOLÓGICO:

Microscopio Muestra fecal

TÉCNICA:

Se toma un fragmento de materia fecal de aproximadamente 1mm de diámetro con el aplicador.

Se lleva a un porta, el cual contendrá una gota de solución salina o yodo lugol.

Se emulsiona perfectamente, se protege con un cubre y se observa al microscopio. Si la muestra tiene moco con sangre se realiza una toma igual del sitio.

MÉTODO DE KATO O VERDE DE MALAQUITA:

Este es un método de frotis grueso útil para diagnosticar helmintiasis y además cuantificar la presencia de huevecillos.

En este método el reactivo que se utiliza es el verde de malaquita.

MATERIAL: REACTIVOS:

Microscopio Verde de malaquita al 3%

Porta objetos Glicerina pura

Cubre objetos Agua destilada

Papel celofán

TÉCNICA:

Se pone un día antes de la práctica cuadros de papel celofán en la sustancia de verde de malaquita.

Se pone un frotis y se coloca en el cuadro de papel celofán sobre el mismo y se deja reposar durante 1 hora.

Posteriormente se observa a 10X y 40X

METODO DE FAUST:

Método de concentración de materia fecal para la búsqueda de parásitos o estudio de quistes, huevecillos o larvas. Se toma en cuenta el peso específico de estos para hacerlo notar o sedimentar.

MATERIAL: REACTIVOS:

Microscopio Agua

Cubre objetos Sulfato de zinc

Porta objetos Yodo lugol

Asas bacteriológicas

Mechero de Bunsen

Trípie

Tela de alambre

Vaso de precipitados

Agitador

Tubos de ensayo

Centrifugadora

Embudo

TÉCNICA:

Se hace una suspensión homogénea con 2g de materia fecal en un vaso de precipitados y se colocan 10ml de agua

Se pasa a través de una gasa colocada en un embudo recolectando la suspensión directamente en un tubo.

Se centrífugan los tubos a 2500 R.P.M. y se decanta el sobrenadante y se resuspende con agua agitando con el aplicador, se centrífuga nuevamente y se vuelve a decantar hasta que aparezca totalmente transparente.

Se decanta nuevamente y se le agregan 5ml de Sulfato de Zinc, se homogeniza nuevamente.

Se centrífuga a 2500 R.P.M. y con el asa flameada se recolecta el sobrenadante y se coloca en el porta, se le agrega yodo lugol y se le coloca el cubre. Se observa a 10X y 40X.

METODO DE RITCHIE:

Es un método de concentración fecal muy parecido al de Faust, solo que esta vez se sedimentará en el fondo nuestra materia fecal a examinar, y es útil para encontrar huevecillos, quistes y trofozoitos muy pesados.

MATERIAL: REACTIVOS:

Microscopio Solución Salina fisiológica

Cubre objetos Formaldehído

Porta objetos Yodo lugol

Pipetas Pasteur Éter Etílico

Vaso de precipitados

Agitador

Tubos de ensayo

Centrifugadora

Embudo

TÉCNICA:

Se pesan 2g de materia fecal y se hace una mezcla homogénea, en un vaso de precipitados con 10ml de agua.

Se hace pasar a través de un embudo (con un gasa) a un tubo de ensayo.

Se centrífugan los tubos a 2500 R.P.M. y se decanta la muestra, se le agregan 7ml de solución salina y se vuelve a centrifugar hasta que el líquido sea transparente.

Se decanta nuevamente y esta vez se le agregan 5ml de formaldehído y se homogeniza, se le agregan 2ml de éter etílico y se centrífuga nuevamente.

Al final se observan 4 capas.

METODO DE AMIBA EN FRESCO:

Es un método, sencillo de realizar y que nos ayudará en la búsqueda de protozoarios, así como sus quistes y trofozoitos.

MATERIAL: REACTIVOS:

Mechero de Bunsen Yodo Lugol

Trípie

Tela de alambre

Vaso de precipitados

Tubos de ensayo

Pinzas para tubo de ensayo

Termómetro

TÉCNICA:

Se colocan aproximadamente 1g de materia fecal dentro de un tubo de ensayo.

Se le agrega agua al vaso de precipitados y se calienta con el mechero, se deja de calentar hasta que tenga una temperatura de 37º C.

Se coloca el tubo dentro del vaso de precipitados con ayuda de las pinzas, evitando que se introduzca agua dentro del mismo y se deja reposar 5 minutos.

Se procede a observarlo al microscopio a 10X y 40X.

INVESTIGACIONES:

PARASITO: Parásito, cualquier organismo que vive sobre o dentro de otro organismo vivo, del que obtiene parte o todos sus nutrientes, sin dar ninguna compensación a cambio al hospedador. En muchos casos, los parásitos dañan o causan enfermedades al organismo hospedante. Ciertos parásitos como los piojos, que habitan sobre la superficie del que los hospeda, se denominan ectoparásitos. Los que viven en el interior, como por ejemplo los nematodos parásitos, se conocen como endoparásitos. Los parásitos permanentes pasan la mayor parte de su ciclo vital dentro o sobre el organismo al que parasitan. Los parásitos temporales viven durante un breve periodo en el huésped, y son organismos de vida libre durante el resto de su ciclo vital. Los parásitos que no pueden sobrevivir sin el huésped, se llaman parásitos obligados. Los parásitos facultativos son aquellos que pueden alimentarse tanto de seres vivos como de materia muerta. Los parásitos heteroicos, como las duelas del hígado, necesitan alojarse en animales diferentes en cada fase de su ciclo vital. Los parásitos autoicos, como las lombrices intestinales, pasan los estadios parásitos de su ciclo vital en un único huésped. La ciencia que estudia a los parásitos se denomina parasitología.

NEMATODOS: Gusano cilíndrico, también nematodo, es el nombre común de cualquier miembro de un filo de gusanos no segmentados, que pueden ser terrestres, de agua dulce o marinos. Los gusanos cilíndricos están distribuidos por casi todo el mundo y son muy numerosos en las capas superficiales del suelo. Muchos son dañinos para la economía y para la salud, ya que viven como parásitos de plantas y animales, incluidos los seres humanos. Las infecciones por gusanos cilíndricos son frecuentes y normalmente pasan inadvertidas; sin embargo, algunas especies causan enfermedades graves.

Estos gusanos son animales cilíndricos, alargados, con una organización simple que consiste en un intestino interior y una pared muscular exterior, separadas por una cavidad llamada pseudocele, llena de líquido. La pared exterior segrega una cutícula elástica que el animal muda cuatro veces durante su vida. Tienen una longitud que varía desde lo microscópico hasta 10 cm. La mayoría tienen sexos separados y la fecundación es interna. Las crías se parecen a los individuos adultos y se desarrollan sin metamorfosis.

PLATELMINTO: Gusano plano, también platelminto, nombre común de un grupo de animales de cuerpo blando, por lo general parásitos. Son los animales más sencillos entre los que poseen cabeza. Presentan simetría bilateral y son un tanto aplanados dorsoventralmente. La mayoría son alargados. El filo al que pertenecen los gusanos planos o platelmintos comprende: las tenias, que en su fase adulta son parásitos del tracto digestivo de los animales; las duelas, que parasitan diversos órganos de distintos animales; y los gusanos planos de vida libre.

Los gusanos planos de vida libre se encuentran en prácticamente todos los medios y así, se localizan tanto formas terrestres como marinas o de agua dulce. Las especies acuáticas se alimentan principalmente de plancton. Los gusanos planos parásitos suelen presentar ciclos de vida muy complejos, y a veces requieren de 4 o 5 huéspedes para completarlos.

TREMATODOS: Son gusanos parásitos en forma de hoja lanceolada y son aplastados, no presentan segmentos, estan desprovistos de cilios vibrátiles, tienen un saco digestivo sin ano y pertenecen al PHILUM de los PLATHELMINTOS.

Estos parásitos poseen ventosas musculares fijadoras y su ciclo evolutivo es muy complejo. Son muy frecuentes al este de Asia, cercano y lejano oriente, regiones de África, de Sudamérica y en el sur de China. Son de distribución cosmopolita en países que explotan el ganado ovino y bovino, los cuales son la principal fuente de infestación, pero también pueden ser perros y gatos.

UNCINARIA: Es un gusano cilíndrico, de color blanquecino o rosado, con una curvatura cervical que hace que la porción anterior se dirija hacia el dorso. La cápsula bucal es fuerte, quitinosa y de contorno oval, tiene un borde ventral o superior. En situación simétrica presenta dos pares de dientes en forma de ganchos, en el borde inferior un par de dientes rudimentarios, en el fondo de la cápsula bucal hay un par de placas pequeñas, triangulares y quitinosas.

Es una de las enfermedades más antiguas conocidas por el hombre, sobre todo en los países con clima cálido y húmedo, ya que las repercusiones en la salud, traen como consecuencia retraso en el desarrollo físico y mental, con cansancio generalizado y daño anatomopatológico importante que puede llegar a causar la muerte.

ASCARIS: Ascaris, género de gusanos parásitos del filo de los Nematodos. La especie más conocida es la lombriz intestinal, que infecta a los humanos, en especial a los niños. Normalmente se aloja en el intestino delgado y a veces se abre camino hasta otras partes del cuerpo. Por lo general, mide de 15 a 25 cm de longitud, es de color blanquecino o rosado, y ahusado en ambos extremos.

Sus huevos se desarrollan en el agua o en tierra húmeda, y a las pocas semanas de su maduración en el suelo se vuelven infectantes. La infección tiene lugar cuando los huevos son ingeridos con alimentos contaminados o cuando los niños se meten en la boca las manos sucias que han estado en contacto con suelo contaminado. Los huevos ingeridos pasan al intestino donde se liberan las larvas, que atraviesan la pared intestinal y se desplazan al hígado, al corazón y a los pulmones. En este recorrido, las larvas sufren varias mudas y posteriormente ascienden hacia los bronquios y luego a la faringe, donde son deglutidas, descendiendo por el aparato digestivo hasta llegar nuevamente al intestino delgado, donde se transforman en adultos. Finalmente, se produce la fecundación y la hembra libera los huevos que son expulsados con las heces, completándose el ciclo biológico.

OXIURO: gusano nematodo parásito del intestino humano que se encuentra en casi todo el mundo. Los oxiuros son los gusanos cilíndricos más comunes, e infectan a los niños con más frecuencia que a los adultos. Se dan en todas las clases sociales e indistintamente en el medio rural y el urbano. Miden alrededor de 1 cm de largo. La infección en los humanos, llamada enterobiasis u oxiuriasis, se produce por la ingestión de agua y alimentos contaminados con huevos de lombrices. Los gusanos adultos se desarrollan en el intestino y ponen sus huevos en la región anal. Si los huevos se vuelven a tragar se produce una reinfección. Los síntomas de la infección por oxiuros no son graves: picor, trastornos intestinales, vómitos y nerviosismo.

OBSERVACIONES: En la práctica, aprendimos todos los métodos (más utilizados en un laboratorio) de exámenes coproparasitológicos y nos dimos cuenta que no vamos a encontrar los mismos parásitos en todos los métodos, de ahí la importancia de aprender a realizarlos y conocer lo que vamos a encontrar en cada uno de estos métodos, así como identificar huevos, larvas, quistes y trofozoitos de parásitos.

BIBLIOGRAFÍA: Biblioteca de Consulta Microsoft ® Encarta ® 2005 y Enciclopedia LAROUSSE Integral, Editorial LAROUSSE, pp. 341-355, “El hombre y la salud”.

CONCLUSIONES: Para realizar esta practica debemos tener una buena técnica, esto fue muy entretenido y para nada aburrido, por lo que la practica me gustó.

PRACTICA Nº 2

EXAMENES INMUNOLOGICOS

INTRODUCCIÓN: Estos exámenes nos ayudan a conocer si no tenemos algún tipo de bacteria en nuestro organismo. También en esta práctica haremos una espermatobioscopia, prueba de embarazo y prueba de factor reumatoide.

OBJETIVO: Que el alumno aprenda a realizar todos los exámenes inmunológicos correspondientes a la mesa de trabajo.

ESPERMATOBIOSCOPIA

Fundamento: Suele formar parte de la investigación científica completa de una prueba de infertilidad, así como las deformaciones que pueden presentar los espermatozoides como son: cabeza de alfiler, cabeza gigante, forma alargada, cabeza doble, media cabeza, etc...

El análisis se forma en varios aspectos como son medir el volumen, la viscosidad, el color, tiempo de licuefacción el pH y observar las anormalidades que presentan.

MATERIAL:

Microscopio

Vaso para la toma de muestra

Regla

Portaobjetos

Caja de Neubauer

Probeta

Pipeta de glóbulos blancos o rojos

Cintas reactivas

TÉCNICA:

Se procede a que el paciente done la muestra

Se mide el volumen con ayuda de un matraz

La viscosidad se mide con ayuda de dos portas y una regla

El tiempo de licuefacción es el tiempo que tarda la muestra en volverse líquida completamente.

Con ayuda de una cinta reactiva se medirá el pH, este método esta indicado en el frasco de las cintas reactivas (cómo medir el pH).

Posteriormente con ayuda de una pipeta de glóbulos blancos o rojos, tomaremos un poco de la muestra y se depositará en la cámara de Neubauer y se procederá a contarlos.

VALORES NORMALES:

Examen Físico:

Volumen: 2-4 ml

Color: Blanco-Blanco lechoso

Elasticidad: 5-10 ml

Tiempo de licuefacción: 15-20 min.

Examen Químico:

pH: Ligeramente alcalino 7-9

Examen microscópico:

Vivos: 70 - 80 %

Muertos: 20-30 %

Ascendentes: 60 %

Descendentes 40%

PRUEBA DE EMBARAZO:

Fundamento: Es una prueba de diagnostico que se utiliza para detectar el estado de una mujer que se piensa, estar en un estado de gravidez o fertilidad. Una prueba de embarazo mide una hormona llamada gonadotropina coriónica humana (GCH) para determinar si una mujer está en embarazo, y es una prueba que se puede llevar a cabo en sangre (suero) o en orina.

Existen dos tipos de pruebas de embarazo: cualitativa, que mide si la GCH está presente; y cuantitativa, que mide la cantidad de hormona que está presente.

MATERIAL:

Tubos de ensayo

Sangre

Reactivo de hormona gonadotropina coriónica humana (GCH)

TÉCNICA:

La prueba de la gonadotropina coriónica humana (GCH) en orina por lo general se lleva a cabo mediante la aplicación de una gota de orina en una banda o tirilla química preparada, que generalmente presenta el resultado en uno o dos minutos.
Las pruebas en suero se llevan a cabo mediante la extracción de un sólo tubo de sangre el cual se envía al laboratorio y es posible que se deba esperar entre algunas horas y más de un día para obtener los resultados.

Para que la prueba sea positiva debe formarse un círculo al fondo del tubo de ensayo, si no se forma nada es negativa.

REACCIONES FEBRILES:

Fundamento: Es una prueba que consiste en analizar una muestra de sangre (suero) para determinar si contiene alguna bacteria que pueda ocasionar enfermedades tales como tifoidea, brucelosis, etc.

Estas reacciones se basan en el hecho de que cuando el organismo humano es invadido por agentes infecciosos, responde produciendo anticuerpos aglutinantes contra ellos los cuales se ponen de manifiesto al entrar en contacto el anticuerpo con el anticuerpo específico. El título del anticuerpo depende del tipo y curso de la enfermedad. Para que los resultados tengan un valor diagnóstico el título de ellos debe aumentar.

MATERIAL:

Placas con divisiones (de Highlan)

Gradillas

Tubos de ensayo

Aplicadores (palillos)

Reactivos Tíficos

Pipetas automáticas

REACTIVOS.

Antígeno “O” Salmonella Typhi

Antígeno Paratyphi “A”

Antígeno “H” Salmonella Typhi

 Antígeno Paratyphi  “ B”

Antígeno Brucella Aborturs

Antígeno Proteus “OX-19”

TÉCNICA:

1.   Anotar el antígeno correspondiente en la placa de vidrio.

2.   Depositar en cada cuadro 0.04ml de suero del paciente para cada uno de los antígenos que se vayan a utiliza.

3.   A cada gota de suero añadir una gota de cada antígeno.

4.   Mezclar con un aplicador limpio ( utilizar un aplicador para cada antígeno.

5.   Agitar suavemente la placa por rotación (120 r.p.m) durante 2 ó 3 minutos.

6.   Observar la aglutinación con ayuda de una lámpara.

Cuando hay reacción positiva se repite la técnica con diluciones las cuales se obtienen con el uso de las siguientes cantidades del suero en la siguiente forma.

Mililitros de suero	Dilución
0.08	1:20
0.04	1:40
0.02	1:80
0.01	1:160
0.005	1:329

FACTOR REUMATOIDE:

Fundamento: Es una prueba que mide la presencia y nivel de las IgM especifica contra las inmunoglobulinas IgG anormales producidos por los linfocitos de la membrana sinovial de las articulaciones afectadas por artritis reumatoide.

MATERIAL:

TÉCNICA:

INVESTIGACIONES

PROTEINA “C” REACTIVA: La proteína C reactiva se produce en el hígado cuando hay una infección o inflamación aguda en el cuerpo. Su importancia es que reacciona con el sistema del complemento que es un sistema de defensa contra agresiones externas del cuerpo humano.

Se utiliza para evaluar la presencia de enfermedades infecciosas bacterianas, enfermedades inflamatorias (fiebre reumática, artritis reumatoide, etc.) pero no se eleva de forma habitual en enfermedades producidas por virus.

La Proteína C reactiva se eleva ante un problema infeccioso o inflamatorio antes que la VSG y comienza a disminuir antes que ella ante la recuperación de la enfermedad.

Si se trata la enfermedad con Aspirina o antiinflamatorios desaparece su elevación.
La proteína C reactiva aparece elevada en el infarto de miocardio.

También puede ser de ayuda tras una intervención de cirugía, ya que aparece elevada durante 3 ó 4 días, para luego disminuir, si persiste elevada es que hay alguna infección o complicación post-quirúrgica.

En la meningitis bacteriana aparece elevada y no así en la producida por virus, lo que puede servir para indicar el origen y tratamiento de un proceso de meningitis.

FACTOR REUMATOIDE: El factor reumatoide (FR) es un anticuerpo reactivo contra el fragmento Fc de la inmunoglobulina G (IgG). Este anticuerpo, FR, es producido por los linfocitos B y está compuesto por inmunoglobulinas. Se piensa como ocurre en otras situaciones con las células B, que las células B-FR presentaría los antígenos contenidos en los inmunocomplejos a las células T-helper específicas. El anticuerpo FR está compuesto de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cada una de ellas con una región constante y una región variable.

TIFOIDEA: Enfermedad infecciosa aguda producida por el bacilo Salmonella typhi. Se contagia por la leche, el agua o los alimentos contaminados por heces de enfermos o portadores. Los portadores son personas sanas que sufren una infección asintomática y excretan periódicamente el bacilo. El esquema de transmisión epidemiológica se puede simplificar con las siglas DAME (dedos, alimentos, moscas y excretas).

El periodo de incubación varía de una a tres semanas. Las bacterias se acumulan en el intestino delgado y de ahí pasan al torrente sanguíneo. La entrada en sangre de la bacteria ocasiona los primeros síntomas: escalofríos, fiebre alta y postración. Los enfermos presentan además cefaleas, tos, vómitos y diarrea. La enfermedad remite de forma espontánea tras varias semanas en el 80% de los casos, pero en el 20% restante se complica con septicemia, focos de infección salmonelósica a distancia (neumonías, osteomielitis, abscesos hepáticos o cerebrales) o perforaciones de la mucosa digestiva con la subsiguiente hemorragia. Estas complicaciones pueden producir la muerte. La tasa de mortalidad se redujo a partir del descubrimiento del primer antibiótico efectivo frente a la salmonella, el cloranfenicol, aislado de un moho sudamericano a finales de la década de 1940. Este fármaco, que hoy día se obtiene de forma artificial, sigue siendo el tratamiento de elección en la mayoría de los casos. Otros antibióticos útiles son la ampicilina y la amoxicilina, empleados para el tratamiento de los portadores.

BRUCELLA: También denominada fiebre ondulante, es una enfermedad infecciosa causada por varias especies de bacterias del género Brucella, transmitida a los seres humanos por animales como las vacas, cerdos y cabras. La enfermedad se adquiere por contacto con animales infectados o al ingerir su leche. Esta afección se ha conocido con el nombre de fiebre de Malta, enfermedad de Bang, fiebre mediterránea y fiebre de las cabras. En los animales, la enfermedad puede producir esterilidad parcial, disminución de la producción de leche y abortos. En el ser humano, la brucelosis puede presentarse en forma aguda o crónica. La forma aguda se caracteriza por debilidad, escalofríos, fiebre nocturna elevada, y con frecuencia produce alteraciones del sistema nervioso central, dolores articulares y aborto espontáneo.

La brucelosis crónica es difícil de diagnosticar, porque los síntomas son imprecisos y muy variables. Sin embargo, en casi todos los casos aparece fiebre remitente y alteraciones del sistema nervioso central. Hay una prueba de aglutinación sanguínea que permite detectar la enfermedad. Como norma, la persona que padece brucelosis responde a la administración de antibióticos de amplio espectro. La pasteurización de la leche es fundamental para el control de la brucelosis. Además, el desarrollo en la década de 1950 de una vacuna denominada cepa 19, que se puede inocular al ganado vacuno, ha reducido de forma significativa la incidencia de brucelosis bovina. El organismo que produce la enfermedad fue descubierto en 1887 por el médico y anatomopatólogo británico David Bruce.

PROTEUS: Enterobacterias, nombre común de una familia de bacterias Gram negativas que reciben este nombre porque suelen encontrarse en el intestino de los mamíferos. Las especies que poseen flagelos son móviles; el resto, inmóviles. La capacidad para fermentar la lactosa y el tiempo empleado en hacerlo sirven para diferenciar los géneros. Los que no realizan la fermentación son patógenos, los fermentadores, saprofitos. Hay enterobacterias que provocan intoxicaciones alimentarias, como la salmonelosis. Los síntomas son fiebre, diarrea y dolores abdominales. Es una intoxicación muy rápida. Las epidemias de peste, que fueron muy importantes en la antigüedad, también son producidas por una enterobacteria.

Los miembros del grupo Proteus desaminan la fenilalanina, son mótiles, crecen en medio de cianuro de potasio (KCN), y fermentan la xilosa. Estas especies se mueven con mucho actividad por medio de flagelos perítricos, lo que da por resultado hormigueo sobre los medios sólidos a menos que este fenómeno se inhiba con productos químicos.

OBSERVACIONES: Tenemos que estar atentos al realizar una prueba de reacciones febriles y factor reumatoide, ya que a veces creemos que es negativa, por que no hay aglutinación, pero al cabo de un tiempo comienza a aglutinar y sería positiva. También es un poco difícil contar espermatozoides en una cámara de Neubauer, por lo pequeños que son.

BIBLIOGRAFÍA: : Biblioteca de Consulta Microsoft ® Encarta ® 2005

Enciclopedia LAROUSSE Integral, Editorial LAROUSSE, pp. 250-263, “El mundo vivo”

Apuntes de Bacterias, Nueva estrategia curricular. Autor: M.C. Gastón M. Graillet Juárez

CONCLUSIONES: La práctica fue muy tediosa, pero al final me divertí haciendo todos los métodos ya antes citados, por lo que me gustó.

PRACTICA Nº 3

QUÍMICA SANGUÍNEA

INTRODUCCIÓN: La química sanguínea es un examen que utiliza reacciones químicas para analizar la sangre de un paciente.

Es uno de los exámenes más importante y más tedioso que se realiza dentro de un laboratorio.

A continuación se darán las técnicas para obtener TODOS los parámetros solicitados en una Química Sanguínea.

OBJETIVO: Que el alumno aprenda a realizar una química sanguínea y reconozca los valores normales y elevados, para así dar un buen diagnostico y tratamiento.

MATERIAL: REACTIVOS:

Espectrofotómetro semiautomático manual Solución acuosa de A. Pírico

Cubetas para espectro Solución acuosa de NaOH

Tubos de ensayo Solución de creatinina con Zn2Cl

Gradillas

Mechero de Bunsen

Trípie

Tela de alambre

Cristalizadores

Termómetro

Pipetas Pasteur

Pipetas de 10ml, 5ml, 0.1ml

Pipetas automáticas

Sangre

TÉCNICA:

Según la sustancia...

CREATININA:

Fundamento: En 1886 Jaffe describe un método para la determinación de creatinina haciendo reaccionar un filtrado libre de proteínas con ácido pícrico en una solución alcalina. Aunque desde entonces se han descrito muchos métodos, la reacción clásica de Jaffe es la más utilizada.

Esta reacción esta sujeta a interferencias a causa de varias sustancias como proteínas y glucosa.

Para combatir esta desventaja, se han desarrollado modificaciones. Los métodos cinéticos son los más utilizados por ser más rápidos, simples y sin interferencias.

La creatinina reacciona con el ácido pícrico en un medio alcalino para formar un complejo de color el cual absorbe a 510nm. La velocidad de formación del color es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra.

TÉCNICA:

Coloque las cubetas del espectrofotómetro a 37º C.

Lleve a cero el espectrofotómetro con un blanco de agua destilada a 510nm.

Pipetee 1 ml del reactivo en cada cubeta y preincube por 3 minutos a 37º C.

Transfiera 0.05ml del estándar en el tubo de ensayo, mezcle inmediatamente y pase a una celdilla de lectura.

Transcurridos exactamente 20 segundos, lea y registre absorbancia (A1)

Exactamente 60 segundos después de la lectura inicial lea y registre la absorbancia final (A2)

Calcule el cambio de absorbancias A restando (A1 - A2)

NOTA: Todos los volúmenes se pueden duplicar, si el instrumento requiere volúmenes mayores a 1.0 ml.

CONTROL DE CALIDAD:

Incluya en cada corrida de muestras un suero control y/u orina con valores conocidos analizados por este método.

RESULTADOS:

Los valores resultan de comparar el cambio de absorbancia (A) de la muestra (M) con el estándar (S) tratado de la forma idéntica.

VALORES NORMALES:

Hombres (Suero) 0.9 - 1.5 mg/dl

(Orina) 1000 - 2000 mg/24 horas

Mujeres (Suero)

0.7 - 1.4 mg/dl

(Orina) 600 - 1500 mg/24 horas

GLUCOSA:

Fundamento: La determinación de los niveles de glucosa fue el primer procedimiento empleado en el laboratorio clínico medico. La metodología de la glucosa-oxidasa fue introducida por Keilin y Hartree en 1948. Más tarde Keston reportó el uso de un reactivo combinado glucosaoxidasa-peroxidasa, seguido por el de Teller adicionando un reactivo cromogénico al procedimiento de Keston

La glucosa es oxidad en presencia de glucosa oxidasa (GOD). El peróxido de hidrógeno formado reacciona bajo la influencia de peroxidasa (POD) con fenol y 4aminoantipirina para formar un complejo rojo-violeta de quinona. La intensidad del color es proporcional a la concentración de glucosa.

MATERIAL: REACTIVOS:

Espectrofotómetro capaz de ab. de 500nm Glucosa Liquicolor ®

Pipetas automáticas Estándar de glucosa (100mg/dl)

Mechero de Bunsen

Trípie

Tela de alambre

Cristalizadores

Cubetas para espectro

Agitador

Cronometro

TÉCNICA:

Coloque en cubetas los siguientes volúmenes (ml) y mezcle bien.

	REACTIVO BLANCO (RB)	ESTANDAR (E)	MUESTRA (M)
REACTIVO ESTANDAR MUESTRA	1.0 - -	1.0 0.01 -	1.0 - 0.01

NOTA: El volumen se puede incrementar si el instrumento requiere volúmenes mayores que 1.0 ml.

Incube las cubetas a 37º C por 5 minutos o a temperatura ambiente 15-30º C por 10 minutos.

Lea E y M contra RB a 500 nm antes de 60 minutos.

CONTROL DE CALIDAD: Se deben incluir dos sueros control con niveles de glucosa conocidos determinados por este método o por el procedimiento de hexocinasa en cada serie de pruebas. Se recomienda el uso de Suero Control Normal Ser -T- Fy I y Suero Control Anormal Ser -T- Fy II para cada ensayo.

RESULTADOS:

Los valores se derivan de la siguiente ecuación:

Glucosa (mg/dl)= AM x 100

AE

Donde Am y As son los valores de las absorbancias de la muestra y el estándar respectivamente y 100 es la concentración del estándar (mg/dl).

VALORES NORMALES:

Suero / Plasma 70-105 mg/dl (3.9-5.3 mmol/l)

Líquido cerebro espinal: 40-75 mg/dl (2.2-4.2 mmol/l)

COLESTEROL:

Fundamento: La determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica limitada. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado que las complicaciones arterioscleróticas prevalecen en individuos hipercolesterolemicos.

Estudios epidemiológicos demuestran que el riesgo de contraer enfermedad cardiaca coronaria para individuos de más de 40 años con colesterolemia menor a 2,10 g/l es 3 veces menor que entre individuos con más de 2,30 g/l y 6 veces menor que entre individuos con más de 2,60 g/l.

MATERIAL:

Espectrofotómetro capaz de dar absorbancias de 505nm

Pipetas automáticas

Mechero de Bunsen

Trípie

Tela de alambre

Cristalizadores

Cubetas para espectro

Agitador

Cronometro

REACTIVOS:

Standard: Solución de colesterol 2 g/l

Enzimas: Suspensión conteniendo lipasa fungal 300 U/ml, colesterol oxidasa (CHOD) 3 U/ml y peroxidasa (POD) 20 U/ml.

Reactivo 4-AF: Solución de 4-aminofenazona 25 mmol/l.

Reactivo Fenol: Solución de fenol 55 mmol/l.

TÉCNICA:

En tres cubetas para espectro marcadas B (blanco), S (Standard) y D (desconocido), colocar:

	Standard (S)	Desconocido (D)
Standard	20 ul	-
Muestra	-	20 ul
Reactivo de Trabajo	2 ml	2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37º C o 30 minutos a temperatura ambiente (25º C). Leer en espectrofotómetro a 505 nm, llevando a cero con el Blanco.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Colesterol (g/l)= D x f donde f = 2,00 g/l

S

VALORES DE REFERENCIA:

El panel de expertos del National Colesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de colesterol:

Deseable: < de 2.00 g/l

Moderadamente alto: 2.00 a 2.39 g/l

Elevado: > de 2.40 g/l

ACIDO URICO:

Fundamento: La uricaza sobre el ácido úrico para toma peróxido de hidrógeno y alantoina. El H2O2 es leído cuantitativamente por su reacción con el ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzosulfónico (DCHB) en presencia de peroxidasa y 4 aminofemazona, para formar un complejo quinoneimina de color rojo violeta.

MATERIAL:

Espectrofotómetro capaz de dar absorbancias de 520nm

Cubetas

Mechero de Bunsen

Tela de alambre

Trípie

Pipetas automáticas

Cristalizador

REACTIVOS:

Ácido Úrico Enzimático (liquido), Cat. No. 1044

Solución acuosa de ácido úrico, con estabilizadores y solubilizadores

TÉCNICA:

1. Pipetear en cubetas los siguientes volúmenes (ml) y mezcle bien

	Reactivo Blanco (RB)	Estándar (E)	Muestra (M)
Reactivo Estándar Muestra	1.0 - -	1.0 0.02 -	1.0 - 0.02

NOTA: El volumen puede ser incrementado si el instrumento requiere volúmenes mayores a 1ml. Use 2ml del reactivo y añada 0.05 ml del estándar o la muestra.

Incube todas las cubetas a 37º C por 5 minutos y deje enfriar o incube a temperatura ambiente por 15 minutos.

Lea E y M contra RB a 520nm antes de 15 minutos.

CONTROL DE CALIDAD:

2 niveles de sueros controles con concentraciones de ácido úrico conocidas, determinadas por este método se recomiendan utilizar en cada ensayo.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Se calculan mediante la ecuación:

Ácido Úrico en suero o plasma (mg/dl)= AM X 8

AE

VALORES NORMALES:

Hombres: 3.4-7.0 mg/dl

Mujeres 2.4-5.7 mg/dl

FOSFATASA ALCALINA:

Fundamento: Los niveles de fosfatasa alcalina sérica son de interés en el diagnostico de desordenes hepatobiliares y óseos asociados con el incremento en la actividad osteoblástica. Las elevaciones también se pueden observar en varias condiciones que no involucran al hígado o al hueso. Entre estos estan la enfermedad de Hodgkin, falla congestiva cardiaca, colitis ulcerativa, enteritis regional e infecciones bacterianas intra-abdominales. Las elevaciones también se observan durante el 3er trimestre del embarazo. El procedimiento esta basado en el trabajo de Bowers y McComb, en el cual se utiliza p-nitrofenilfosfato y en el de Schifren y Burnett el cual trata los efectos de los errores de la longitud de onda y el ancho de la banda del espectro.

La fosfatasa alcalina hidroliza el 4-nitrofenilfosfato para formar 4-nitrofenol y fosfatos.

MATERIAL:

Espectrofotómetro capaz de dar absorbancias de 405nm

Cubetas

Mechero de Bunsen

Tela de alambre

Trípie

Pipetas automáticas

Cristalizador

REACTIVOS:

Buffer de fosfatasa alcalina (R1)

Substrato Fosfatasa Alcalina (R2)

PREPARACIÓN DEL REACTIVO: El buffer y el substrato son reactivos líquidos listos para usarse. Prepare el reactivo de trabajo a razón de 5 partes de buffer (R1) y 1 parte substrato (R2) (ejemplo 50ml buffer y 10ml de substrato).

TÉCNICA:

Prepare el reactivo de trabajo de acuerdo a las instrucciones.

Ajuste a cero el espectrofotómetro con agua destilada.

Para cada muestra y control añada 1.0ml del reactivo de trabajo en una cubeta o tubo de prueba e incube a 37º C por 3 minutos.

Añada 20 (0.020ml) de suero al tubo respectivo y mezcle suavemente.

Lea y registre la absorbancia en 1 minuto. Continúe incubando a 37º C antes de cada lectura.

Determine el incremento de absorbancia por minuto (A/min. Y multiplique por el factor 2764 para obtener los resultados en U/l.

NOTA: Si la cubeta no esta a temperatura controlada incube las muestras a 37º C antes de cada lectura.

Los volúmenes se pueden incrementar al doble si el instrumento requiere un volumen mayor a 1ml.

CONTROL DE CALIDAD: El suero control normal Ser-T-Fy I Cat no. G427-86 y el suero control anormal Ser-T-Fy II Cat no. G427-86 son recomendables para verificar precisión y exactitud.

CALCULO DE RESULTADOS:

Los valores se derivan del “coeficiente de absorvatividad micromolar” a 405 nm. Una unidad por litro (U/l) de fosfatasa alcalina es la cantidad de enzima que produce 1 mmol/l de 4-nitrofenol por minuto.

VALORES NORMALES:

Rango Normal (Adultos) 34-114 U/l a 37º C.

NITRÓGENO DE UREA:

Fundamento: La urea es el principal producto de desecho del catabolismo de proteínas. Es sintetizada en el hígado a partir del amonio, el cual es producido como resultado de la desaminación de aminoácidos. Normalmente, el nitrógeno de urea en la sangre comprende sólo el 45% del nitrógeno no proteico. La importancia de la determinación del nitrógeno de urea es su valor como buen indicador del funcionamiento hepático y renal. La disminución de Nitrógeno de Urea (BUN) se ha visto en nefritis, destrucción hepática aguda, amiloidosis y embarazos. Valores elevados de BUN se han visto en casos de nefritis aguda y crónica, obstrucción urinaria e intestinal, uremia, envenenamiento por metales, neumonía, enfermedad de Addison, peritonitis, shock en cirugía y fallas cardiacas.

MATERIAL:

Espectrofotómetro capaz de dar absorbancias de 340nm

Cubetas

Mechero de Bunsen

Tela de alambre

Trípie

Pipetas automáticas

Cristalizador

REACTIVOS:

Regulador de BUN (R1)

Enzima BUN (R2)

Estándar de BUN - 30 mg/dl

PREPARACIÓN DEL REACTIVO: El buffer y los reactivos enzimáticos líquidos estan listos para su uso. Prepare el reactivo de trabajo en una porción de 5 partes Buffer (R1) y 1 parte de enzima (R2), (por ejemplo 25 ml de buffer y 5 ml de enzima).

Antes de utilizarse, mantener el reactivo de trabajo a temperatura ambiente, 15-25º C por lo menos 30 minutos.

TÉCNICA:

Prepare el reactivo de trabajo de BUN de acuerdo al instructivo.

Calibre a cero el espectrofotómetro a 340nm con agua destilada.

Por cada Muestra y Control, agregar 1.0ml de reactivo de trabajo a la cubeta y llevar a 37º C por 3 minutos.

Adicionar 10 (0.010ml) de suero a cada tubo respectivamente y agitar levemente.

Leer y anotar la absorbancia (A1) después de 30 segundos.

Exactamente a los 60 segundos después de leer (A1) lea y registre la absorbancia (A2).

Calcule el cambio de absorbancia por minuto (A) mediante la resta (A1-A2).

NOTA: Si la cubeta no está a temperatura controlada incube las muestras a 37º C entre lectura y lectura.

CONTROL DE CALIDAD: Los sueros control Normal Ser-T-Fy I y suero control anormal Ser-T-Fy II son recomendados en cada ensayo.

CALCULO DE RESULTADOS:

Los valores se derivan de la comparación de l cambio de absorbancia (A) de muestra (m) con la del estándar (s).

BUN suero (mg/dl)= Au X 30

As

Donde Au y As son los cambios de absorbancias (decrementos) de la muestra y del estándar, respectivamente y 30 es la concentración del estándar (mg/dl).

VALORES NORMALES:

BUN: 8-23 mg/dl

UREA: 17-49 mg/dl

INVESTIGACIONES

SUERO: Es una sustancia formada exclusivamente por agua y también por minerales o electrolitos, su lugar de almacenamiento de estas sustancias vienen siendo las células grasas razón por la cual, cuando una persona realiza ejercicio expulsa gran cantidad de agua.

El suero se observa en herida como esa parte amarillenta en la misma, tendrá un pH alcalino.

De las sustancias que se hayan formando el suero tenemos: Calcio, Sodio, Potasio, Magnesio, cloro. La deficiencia de alguna de estas sustancias se puede producir por una perdida elevada de líquidos, por ejemplo una sudoración excesiva, en la diarrea profusa, en el vomito, es decir, en todos aquellos casos fisiológicos y patológicos que se reflejen por una perdida total de líquidos.

GLUCOSA: Azúcar monosacárido, de fórmula C6H12O6. Se encuentra en la miel y en el jugo de numerosas frutas. El nombre alternativo azúcar de uva proviene de la presencia de glucosa en las uvas. Se produce en la hidrólisis de numerosos glucósidos naturales. La glucosa está presente en la sangre de los animales

Es un sólido cristalino de color blanco, algo menos dulce que el azúcar destinado al consumo. Las disoluciones de glucosa giran el plano de polarización de la luz a la derecha; de ahí el otro nombre alternativo dextrosa (del latín dexter, 'derecha'). La glucosa cristaliza en tres formas diferentes y cada una de ellas gira el plano de polarización de la luz en distinto grado.

La glucosa se forma en la hidrólisis de numerosos hidratos de carbono, como la sacarosa, maltosa, celulosa, almidón y glucógenos. La fermentación de la glucosa por la acción de levaduras produce alcohol etílico y dióxido de carbono. Industrialmente, la glucosa se obtiene en la hidrólisis del almidón bajo la acción de ácido diluido, o más frecuentemente, de enzimas. Su aplicación más importante es como agente edulcorante en la elaboración de alimentos. También se emplea en curtidos y tintes, y en medicina para el tratamiento de la deshidratación y alimentación intravenosa.

UREA: compuesto cristalino incoloro, de fórmula CO(NH2)2, con un punto de fusión de 132,7° C, conocido también como carbamida. Se encuentra abundantemente en la orina de los humanos y otros mamíferos. En cantidades menores, está presente en la sangre, en el hígado, en la linfa y en los fluidos serosos, y también en los excrementos de los peces y muchos otros animales inferiores. La urea se forma principalmente en el hígado como un producto final del metabolismo. El nitrógeno de la urea, que constituye la mayor parte del nitrógeno de la orina, procede de la descomposición de las células del cuerpo, pero, sobre todo, de las proteínas de los alimentos. La urea está presente también en mohos de los hongos así como en las hojas y semillas de numerosas legumbres y cereales. Es soluble en agua y en alcohol, y ligeramente soluble en éter. La urea se obtiene mediante la síntesis de Wöhler, que fue diseñada en 1828 por el químico alemán Friedrich Wöhler.

COLESTEROL: Colesterol, alcohol complejo que forma parte de todas las grasas y aceites animales. Actúa como precursor en la síntesis de vitamina D. El colesterol pertenece a un grupo de compuestos conocidos como esteroides, y está relacionado con las hormonas sexuales producidas en las gónadas y las hormonas de la corteza suprarrenal. Cuando el colesterol se eleva en la sangre por encima de unos niveles, considerados como normales, se produce una enfermedad conocida como hipercolesterolemia. Se consideran normales, valores de colesterol en la sangre iguales o inferiores a 200 mg/dl. En las hipercolesterolemias leves los valores de colesterol se sitúan entre 200 y 249 mg/dl; en las hipercolesterolemias moderadas se sitúan entre 250 y 299 mg/dl y en las hipercolesterolemias graves los valores de colesterol superan los 299 mg/dl. Sin embargo, hay que considerar que, aunque el colesterol es el factor de riesgo más importante de las cardiopatías isquémicas en pacientes menores de 50 años, existen otros factores de riesgo cardiovascular, como la hipertensión, la diabetes, el tabaquismo o la obesidad, cuyos efectos se suman a la hora de facilitar un evento cardiovascular.

CREATININA: Compuesto derivado de la degradación de la creatina...

Creatina: sustancia presente en el torrente sanguíneo de los vertebrados que se utiliza como molécula portadora de energía suplementaria en algunos sistemas del organismo (la arginina desempeña un papel equivalente en los invertebrados). El trifosfato de adenosina o ATP es la principal fuente de energía del organismo, pero las células del cerebro, corazón y músculos requieren enormes cantidades de energía, por lo que utilizan la creatina de forma complementaria. Esta sustancia se produce en los riñones y en el hígado, las células la absorben y en su interior se transfieren grupos fosfato de alta energía procedentes del ATP de las mitocondrias, como la creatina fosforilada o fosfocreatina, que almacena de forma temporal grupos fosfato de alta energía disponible para aportarla cuando se necesite.

TRIGLICÉRIDOS: Grupo de compuestos orgánicos existentes en la naturaleza que consisten en ésteres formados por tres moléculas de ácidos grasos y una molécula del alcohol glicerina. Son sustancias aceitosas, grasientas o cerosas, que en estado puro son normalmente incoloras, inodoras e insípidas. Las grasas y aceites son más ligeros que el agua e insolubles en ella; son poco solubles en alcohol y se disuelven fácilmente en éter y otros disolventes orgánicos. Las grasas son blandas y untuosas a temperaturas ordinarias, mientras que los aceites fijos (para distinguirlos de los aceites esenciales y el petróleo) son líquidos. Algunas ceras, que son sólidos duros a temperaturas ordinarias, son químicamente similares a las grasas.

FOSFATASAS ALCALINAS: Enzimas que liberan fosfatos inorgánicos de ésteres fosfóricos; se definen como ácidas o alcalinas según sean más activas a valores de

pH < o > 7

ACIDO URICO: compuesto nitrogenado, blanco, inodoro e insípido, de fórmula C3H4N4O3, que se forma en el cuerpo como resultado del metabolismo de las proteínas. Está presente en pequeñas cantidades en la orina humana, y en cantidades mayores en la orina de los pájaros y reptiles. El ácido úrico es muy poco soluble en agua e insoluble en alcohol y éter. Al calentarse forma urea, amoníaco y dióxido de carbono. La gota es el resultado de una alteración en el metabolismo del ácido úrico. Las piedras en los riñones formadas por sales de ácido úrico aparecen en personas con altos niveles de este ácido en la orina.

ESPECTROFOTOMETRO: El espectrofotómetro se usa para medir la intensidad de un espectro determinado en comparación con la intensidad de luz procedente de una fuente patrón. Esta comparación permite determinar la concentración de la sustancia que ha producido ese espectro. Los espectrofotómetros también son útiles para estudiar espectros en las zonas no visibles porque sus elementos de detección son bolómetros o células fotoeléctricas. Los primeros se aplican especialmente al análisis de espectros de infrarrojos, y los segundos al de espectros ultravioletas.

Las redes de difracción pueden emplearse, igual que los prismas, tanto en los espectrógrafos como en los espectrofotómetros.

OBSERVACIONES: Tenemos que estar atentos al realizar una prueba de cualquier parámetro ya que es difícil de realizar por los tiempos que te dan, a veces es muy poco y tenemos que apurarnos y estar atentos para hacer un buen análisis.

BIBLIOGRAFÍA: : Biblioteca de Consulta Microsoft ® Encarta ® 2005

Enciclopedia LAROUSSE Integral, Editorial LAROUSSE, pp. 108-154, “Ciencia y tecnología”

CONCLUSIONES: La práctica fue muy tediosa, pero al final me divertí haciendo todos los métodos ya antes citados, por lo que me gustó.