Metodología en Bioquímica

Cromatografía. Desintegración de tejidos, células, orgánulos. Fraccionamiento subcelular. Centrifugación analítica, preparativa. Enzimas marcadores. Métodos ópticos. Espectrofotometría Visible-Ultravioleta. Electroforesis. Técnicas Isotópicas

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TEMA 1.

DESINTEGRACIÓN DE TEJIDOS, CÉLULAS Y ORGÁNULOS.

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR Y CENTRIFUGACIÓN.

ENZIMAS MARCADORES.

CENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA Y PREPARATIVA.

* DESINTEGRACIÓN DE TEJIDOS, CÉLULAS Y ORGÁNULOS.

* INTRODUCCIÓN.

Cuando aislamos un tejido, sus células poseen una cantidad mínima de enzimas y compuestos que no se excretan y necesitamos hacer la desintegración del tejido y de las células para poder aislarlos y estudiarlos.

Para observar lo que hay en el interior de la célula tenemos que romperla, pero no basta con esto pues hay compuestos unidos a la membrana, de manera que por centrifugación podemos precipitarlos y obtener los distintos componentes.

También existen tampones que incluyen detergentes; los más conocidos son los detergentes no iónicos del tipo TRITÓN x100 o TRITÓN x114.

También existen sales biliares que son compuestos hidrofóbicos que extraen los componentes de la membrana.

En algunos casos los que interesa es romper la célula pero no los orgánulos, es lo que se llama fraccionamiento subcelular, y mantiene intactos los orgánulos.

* MÉTODOS DE RUPTURA DEL TEJIDO.

* FÍSICOS:

* Trituradosres (minipimer)

* Picadores.

* Batidoras como el politrón que es una batidora con un cilindro que está relleno y al final lleva un espacio vacío con astas de cuchillas.

* Los tejidos más consistentes como la epidermis de rana, se rompen con abrasivos en un mortero con arena de mar, el resultado se somete a centrifugación, donde precipita el resto del tejido y en la suspensión se nos queda la muestra.

* Fuerzas de cizalla (máquina de taladrar); se usa un homogenizador potter que tiene un émbolo que encaja perfectamente en el tubo, la fuerza generada por el émbolo en el tubo hace que se rompan las células.

*Ultrasonización: rompe las células de procariotas de bacterias y de levaduras, se mete una varilla que genera ultrasonido, se producen burbujas de vacío llamadas de cavitación. La variación de presión externa generada por las burbujas hace que las células se rompan.

* NO FÍSICOS:

* Tratamientos térmicos.

* Congelación-descongelación (formación de cristales).

* Desecación; pérdida de presión que provoca un intento de salida por el agua que provoca la ruptura de la célula.

* Choque osmótico.

* Enzimas líticas que atacan a la membrana celular.

* Tratamientos ácidos extremos o alcalinos extremos; aunque este método no es bueno.

* FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR Y CENTRIFUGACIÓN.

Se usa en el caso de querer romper las células pero los orgánulos queremos obtenerlos intactos y por separado. Por ejemplo la extracción de enzimas mitocondriales, ADN del núcleo...

Con este fundamento se obtienen 5 fracciones fundamentalmente.

Ejemplo: tenemos un hígado de ratón y queremos romper los hepatocitos pero no los orgánulos.

* 1º Homogenización del tejido.

* Para ello por ejemplo usamos un potter.

* Obtenemos una mezcla roja en un tampón poco drástico.

* El tampón lleva:

* Sales adecuadas para no romper los orgánulos como puede ser el TRIS clorhídrico a pH 7.

* Sacarosa 0,5 M que rompe la membrana plasmática pero no los orgánulos.

* Sales de cloruro de magnesio por que las mitocondrias necesitan del ión Cl- para mantener la integridad.

* Con la homogenización obtenemos una mezcla viscosa, en estado de semigel.

* 2º centrifugación a 2500 rpm durante 10 min.

1º precipitado que tiene partículas de mayor peso y volumen como son los núcleos.

2º sobrenadante con el resto de orgánulos.

* 3º sobrenadante se centrifuga a 9300 rpm durante 10 min:

1º precipitado con mitocondrias (2º orgánulo de mayor volumen de la célula).

2º sobrenadante con el resto de componentes celulares.

* 4º centrifugación a mayor velocidad, 13000 rpm durante 15 min.

1º precipitado que contiene a los lisosomas.

2º sobrenadante que contiene todos los componentes no separados anteriormente.

* 5º ultracentrifugación: 33000 rpm durante 60 min.

1º precipitado compuesto por microsomas que son las fracciones de RE, Golgi ...

2º sobrenadante: es la fracción soluble del citoplasma que no esté dentro de los orgánulos.

* ENZIMAS MARCADORAS.

* Comprobación de resultados.

Recurrimos al microscopio electrónico para saber si la fracciones son realmente puras, aunque esta técnica es cara y podemos recurrir a otras técnicas como por ejemplo el uso enzimas marcadoras de orgánulos.

* Uso enzimas marcadoras de orgánulos:

Consiste en que cogemos una fracción de cada precipitado y medimos la actividad característica de un orgánulo.

Fracción nuclear: medimos la concentración de ADN de las distintas fracciones. La mayor concentración de ADN debe estar en la fracción nuclear.

Fracción mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las fracciones, el mayor pico debe salir en la fracción mitocondrial.

Fracción lisosomal: actividad de la fosfatasa ácida o alcalina.

Fracción microsomal: actividad de la glucosa-6 fosfatasa.

Fracción soluble: lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad de actividad de las otras enzimas por que supondría que algunos orgánulos se han roto.

* CENTRIFUGACIÓN.

*TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN.

* Analítica: que sirve para determinar propiedades de unos componentes determinados.

Tuvo mucho éxito en los años 70-80 pero necesitaba gran cantidad de material y lo que se analiza este tipo de centrifugación se puede hacer por otros métodos más fáciles.

* Preparativa: sirve para obtener grandes cantidades de algún compuesto. Es la más usada. Hay de varios tipos.

La centrifugación se usa mucho en los laboratorios por que da mucha información. Podemos saber el peso molecular de sustancias determinadas, la forma general de las moléculas y podemos separar distintos compuestos.

También se denomina sedimentación, por que es el proceso que se consigue con la centrifugación.

* TEORÍA DE LA CENTRIFUGACIÓN.

Cuando algo gira alrededor de un eje a una distancia R con una velocidad angular  se genera un componente centrífugo que se dirige hacia el exterior de donde gira. Este componente centrífugo se llama G.



G= ²r

r

Unidades:

 = radianes/segundo

r = cm

G = rpm o "g".

Un giro completo equivale a 2 radianes, expresado en  sería:

 = 2 /60 = (radianes/segundos)

G= (2 /60)² ·r = cm/seg²

Lo que se hace es extrapolar a un múltiplo de la gravedad llamado g = 980 cm/seg². Y así podemos expresar esta fuerza G en función de una "g" determinada, para ello definimos RCF (son unidades relativas y por tanto no posee unidades):

RCF= G/ 980= "g"

Cuando decimos "centrifugamos a 100000g" queremos decir que centrifugamos con una fuerza de 100000 veces mayor que la de la gravedad.

SEDIMENTACIÓN DE PARTÍCULAS EN UN CAMPO.

Tenemos un rotor que gira con una velocidad equivalente a la velocidad angular 

Ff

Fflot

Fc

Tenemos un tubo con una partícula en su interior, hay fuerzas que actúan sobre la partícula cuando el tubo gira alrededor del eje central, así pues tenemos:

Fuerzas a favor de la sedimentación

Fuerza centrífuga (Fc) : son fuerzas que quieren que la partícula sedimente: Fc = m··r

Fuerzas que se oponen a la sedimentación:

Fuerzas de flotación ( Fflot): sigue los principios de Arquímedes.

Fflot = Vp ·  · ² · r

Vp= volumen de la partícula.

 = Densidad del líquido donde está disuelta la partícula.

Fuerza de fricción: está relacionada con el rozamiento de la partícula con el medio.

Fz = · F

= velocidad del movimiento.

F= coeficiente de fricción.

Si examinamos la velocidad en función del tiempo, se obtiene que al principio del experimento aceleramos la velocidad y cuando las tres fuerzas están en equilibrio, la partícula comienza a llevar una velocidad constante. El tiempo que tarda en llegar al equilibrio es de nanosegundos, por tanto asumimos que desde el tiempo T=0 la velocidad es constante.

Velocidad Velocidad constante

Nanosegundos tiempo

En equilibrio: "Fzas=0 y por tanto Fc - Fflot - Ff = 0.

m²r - Vp  ² r -  f = 0

la masa la podemos poner en función de peso molecular: m = M/N donde

N = número de avodgrado= 0,6022· 10²º

M = masa molecular.

Vp =  ·m = · M/N = volumen de la partícula

= volumen especial parcial = variación de volumen que experimenta un líquido al introducir en él una cierta cantidad de sólido.

El valor de =0,73 cm³/gr en la mayoría de las moléculas y  es la inversa de  =gr/cm³ (densidad)

Despejamos  de la ecuación anterior y obtenemos que:

m²r - Vp  ² r -  f = 0 (M/N) ²r - (· M/N)  ² r =  f

(1-  ) M/N ²r =  f

 = (1-  ) M ²r = velocidad de sedimentación o velocidad que lleva una

N · f partícula cuando se somete a centrifugación

La velocidad de centrifugación aumenta con la masa molecular

Las unidades que se dan para determinar como sedimenta una partícula es lo que se denomina "coeficiente de sedimentación" ("S").

Por ejemplo el término que usamos para denominar a los ribosomas 16 S, surge de la relación que existe entre la velocidad lineal y la angular:

S =  = (1- ·) M = cm³/gr· gr/cm³· gramos = segundos

²r N·F gr/seg

 = gr/cm³ M/N= gramos. =cm³/gr F= gr/seg

Las proteínas poseen un valor de sedimentación "S" tan rápido que se define una unidad llamada Svelverg que equivale a 10 ¹³ segundos llamada S.

Por ejemplo:

La mioglobina tiene un valor de S=4·10 ¹³ seg= 4 S

El ribosoma 16 S= 16· 10 ¹³ seg.

CLASES DE SEDIMENTACIÓN:

INSTRUMENTACIÓN NECESARIA: CENTRÍFUGAS.

Los aparatos que se usan se llaman centrífugas y existen de distintos tipos.

Tienen las siguientes propiedades:

Trabajan a velocidad constante.

Trabajan a temperatura constante

Existen de dos tipos de centrífugas que definen los dos tipos de centrifugación que existen:

Analítica:

Es una técnica bastante en desuso puesto que lo que se consigue con ello también se consigue con otros técnicas más económicas y más fáciles.

Sirven para conocer el grado de pureza de las disoluciones y para conocer el peso molecular de las partículas.

También se puede hallar con la centrifugación preparativa, electroforesis o cromatografía.

Consta de una cámara blindada por que las velocidades usadas son muy altas (por eso deben estar blindadas).

Poseen:

Un sitio para el rotor.

Un motor para mover el rotor.

Un sistema de refrigeración, puesto que las velocidades a las que se mueve producen un gran calentamiento.

Un Sistema detector óptico: tiene una bombilla que emite un haz de luz que pasa por la cubeta y es recogido por un espejo y un detector.

Tiene otro espejo con otro haz de luz que se usa de referencia.

En todo momento observamos como la muestra se mueve por la cubeta.

El rotor visto desde arriba es circular con dos orificios donde se ponen las cubetas.

Las cubetas son de cuarzo y si hacemos un corte transversal tiene la siguiente forma.

Se hace así para que todas las moléculas tengan la misma posibilidad de moverse.

Con diferentes tiempos se puede calcular el coeficientes de sedimentación de la molécula de la cubeta.

Absorbancia

tiempo

Sirve para purificar por que si ponemos moléculas con diferentes valores de S, observamos picos que nos dicen que la muestra tiene tantas moléculas diferentes como picos nos aparecen en la gráfica.

Homogenea:

No homogenea:

Giran a 60000 rpm.

Un punto de la superficie del rotor lleva una velocidad dos veces la del sonido.

Se le acopla una bomba de vacío para poder conseguir esa velocidad (evita el rozamiento).

Preparativa:

Centrífuga formada por:

Cámara

Rotor con motor para poder moverlo.

Sistema de control de la temperatura.

Bomba de vacío.

Existen dos tipos de centrífuga preparativa:

Ultracentrífugas que trabajan a velocidades entre 15000 rpm y 75000 rpm, deben estar blindadas y con sistemas de vacío.

Preparativa propiamente dicha que trabajan con velocidades hasta de 15000 rpm. No es necesaria las cámaras blindadas con sistema de vacío.

Tipos de rotores: (Rotor; es donde se mete la muestra.)

Rotores Vasculantes o flotantes: tienen forma de champiñon y lleva colgado el tubo. Cuando está parado el rotor, el tubo está en una posición vertical y cuando está en movimiento, el tubo está en una posición horizontal.

Se usan para dos tipos de centrifugaciones:

Centrifugaciones zonales.

Centrifugaciones isopícnicas o de equilibrio.

Rotores de ángulo fijo: el rotor mantiene un ángulo fijo.

Se usan para Centrifugación diferencial o Centrifugación de frente de sedimentación

Se usa para purificación de material biológico como proteínas.

Ambos son formados por aleación de aluminio o de titanio

CENTRIFUGACIÓN PREPARATIVA.

Centrifugación diferencial o de frente de sedimentación:

Inicialmente los componentes de una mezcla ocupan todo el tubo.

Primera centrifugación: aquellas moléculas de alto peso molecular migran más rápidamente hacia el fondo del tubo y resbalan hacia el fondo por la pared del tubo. Van hacia la pared contraria y resbalan por ella.

centrifugación sobrenadante

precipitado

Al final tenemos dos fases o fracciones: precipitado y el sobrenadante.

El sobrenadante es prácticamente puro y el precipitado no es puro por que las moléculas pequeñas del fondo del tubo pueden ser arrastradas hacia el fondo y quedar atrapadas por las más grandes.

Segunda centrifugación: la impureza del precipitado se soluciona cogiendo el precipitado, redisolviéndolo y haciendo otra centrifugación, lo que enriquece el precipitado en moléculas de alto peso molecular.

Centrifugación zonal.

La centrifugación zonal separa a las moléculas según su densidad y su peso molecular.

Usa el rotor vasculante.

La muestra se deposita al principio del tubo en la zona de arriba. Encima del líquido de centrifugación

La separación de las moléculas se consigue por que el líquido del tubo es más denso que el líquido donde se aplica la muestra.

Se suele usar una disolución que contiene sacarosa para separar las muestras. La sacarosa aumenta la densidad del medio de centrifugación.

La muestra está disuelta en una disolución acuosa.

Al final nos sale:

Una franja con moléculas de bajo peso molecular.

Una franja con moléculas de peso molecular intermedio.

Una franja de moléculas de alto peso molecular

Muestra bajo peso molecular

centrifugación

Disolución peso intermedio

de centrifugación

alto peso molecular

Es dependiente del tiempo por que aunque podemos cambiar la densidad del medio puede que no consigamos tener una densidad igual a la de las moléculas que queremos separar y si aumentamos el tiempo de centrifugación pueden caer todas las moléculas en la misma zona.

También se pueden usar como medio de centrifugación, gradientes de sacarosa que pueden ser discontínuos o contínuos:

Gradientes discontinuos:

1º Ponemos una primera disolución al 20% de sacarosa.

2º disolución de sacarosa al 15% (arriba de la de 20%).

3º disolución de sacarosa al 10% (arriba de la de 15%).

4º disolución de sacarosa al 5% (arriba de la de 10%).

Esto genera un gradiente de densidad discontínuo.

Gradientes continuos:

Por ejemplo para hacer un gradiente que vaya desde 5% hasta 25%.

Es fácil de hacer por que se usan formadores de gradientes que apelan al principio de los vasos comunicantes.

5% 25%

llave agitación 5%

25%

Al principio entra disolución de 25% conforme se abre la llave , va bajando la concentración.

El aumento de la densidad de medio por el tubo representa también un aumento de viscosidad del medio.

Aumento de la concentración de sacarosa, aumenta la densidad y la viscosidad.

[sacarosa]% densidad (g/cm³) Viscosidad(unidades relativas).

10 1,04 1,33

20 1,08 1,94

30 1,13 3,18

Ley de Stokes: la velocidad está en función de la viscosidad del medio.

La velocidad de una partícula en una disolución sometida a un campo centrifugo G es:

V= d² (p - ) ·G

18 

d= diámetro.  p= densidad de la partícula.  = densidad del medio,  = viscosidad,

La viscosidad baja la velocidad de la partícula en el medio

Los avances en esta técnica ha hecho que se puede usar con fines analíticos, así podemos determinar el peso molecular de un componente o determinar su grado de pureza.

Lo que hay que hacer es poner junto con la disolución de una proteína desconocida, una mezcla de marcadores de peso molecular conocido de manera que podemos determinar su absorbancia (coloración) o la actividad de la proteína (actividad enzimática).

En la centrifugación cada marcador se distribuye a lo largo del tubo y se separan según la ley de Stokes.

Pinchamos en el fondo del tubo y lo conectamos a un colector de fracciones.

El marcados lo identificamos midiendo su actividad enzimática o por absorbancia.

marcadores

4º 3º 2º 1º

Representamos el peso molecular frente a la absorbancia de los marcadores de peso molecular conocido y podemos extrapolar la absorbancia de la molécula desconocida a la gráfica y conocer su peso molecular.

Absorbancia

X

Y Peso molecular

Centrifugación de equilibrio, de sedimentación en gradiente de densidad o isopícnica.

Isopícnica: procede del griego ISO (igual) y PICNOS (densidad).

Hasta ahora hemos considerado que las macromoléculas tienen una densidad mayor que el disolvente. ¿qué ocurre si las macromoléculas tienen igual densidad que el disolvente?.

Ley de Stokes: define la velocidad de sedimentación de una partícula.

Si en algún momento la densidad de la partícula es igual a la del disolvente la velocidad de sedimentación se 0 y no sigue emigrando.

Se usa un disolvente que contiene una disolución de cloruro de cesio que es un compuesto de bajo peso molecular pero de alta densidad.

Los gradientes de cloruro de cesio tienen una propiedad:

Cuando echamos cloruro de cesio y lo centrifugamos, la densidad se distribuye formando un gradiente, siendo mayor la densidad en el fondo del tubo y menor en el menisco.

Cuando colocamos una molécula de densidad intermedia en el menisco y se centrifuga, llega un momento en que la partícula se sitúa en una zona donde la densidad de la molécula es igual a la densidad del cloruro de cesio y no sigue bajando en el gradiente, no sigue emigrando.

Para hacer esta técnica se usa una concentración de cloruro de cesio de 5-7 M.

Se diferencia de la centrifugación zonal (dependiente del tiempo) en que la centrifugación isopícnica es independiente del tiempo, por mucho que aumentemos el tiempo de centrifugación la molécula no se mueve.

No es muy útil para separar proteínas por que entre ellas la densidad es muy parecida y tendríamos a todas las proteínas en la misma banda del gradiente de cloruro de cesio.

Se usa mucho para separar ácidos nucleicos, virus, orgánulos subcelulares y ribosomas.

Usando esta técnica en 1958 Meldenson y Stall demostraron que la duplicidad del ADN es semiconservativa, lo que hicieron fue:

Crecieron bacterias en medio rico en nitrógeno radiactivo (N15, más denso).

Trasladaron las bacterias con ADN marcado con el N15 a un medio con N14 durante dos generaciones.

Sometieron a las bacterias a una 1ª centrifugación isopícnica a generación 0: observaron que todo el ADN correspondía a una sola banda, debido al N15.

Absorbancia ADN2c

N15

N15-N15 tiempo

2º centrifugación isopícnica de la 2º generación: observamos un pico de menor densidad que corresponde a ADN con una hebra pesada (N15) y una hebra ligera (N14).

Absorbancia + ADN2c

N15-N14

tiempo

N14-N15

3º centrifugación de la 3º generación: observamos dos picos una con densidad igual a la obtenida en la 2º centrifugación ( ADN con una hebra N14 y otra N15) y otro pico de menor densidad que corresponde a ADN con dos hebras de N14.

Absorbancia 2 ADN2c + 2 ADN2c

N14-N15c N14

tiempo

N14-N14 N15-N14

Por tanto sólo se conserva una hebra de ADN la otra es replicada.

TEMA 3.

MÉTODOS ÓPTICOS DE ANÁLISIS.

ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE-ULTRAVIOLETA.

DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ÓPTICOS DE ANÁLISIS.

Los métodos ópticos de análisis son los más usados, sobre todo los de microscopía de ultravioleta.

Se definen como métodos ópticos de análisis a aquellos métodos que miden la radiación electromagnética que emana de la materia o que interacciona con ella.

Dentro de los métodos ópticos se consideran todos aquellos que se incluyen dentro del espectro electromagnético, que van desde las ondas  hasta las ondas de radio.

Se estudian todas las fuentes de obtención de radiación electromagnética, así como su interacción con la materia, como puede ser emisión, absorción, dispersión, refracción, reflexión y la polarización.

Los métodos ópticos de análisis se clasifican en dos tipos:

ESPECTROSCÓPICOS.

Se basan en la medida de la intensidad y longitud de onda de la energía radiante. Por lo tanto su característica común es que se basan en espectros de absorción y de visión.

Son espectros debidos a transiciones electrónicas entre distintos estados de energía

Son los métodos ópticos más usados y entre ellos tenemos:

Espectrofotometría visible-ultravioleta.

Espectrofotometría infrarroja.

Espectrofotometría de emisión

Espectrofotometría de resonancia magnética nuclear (RMN).

Espectrofotometría de Spin electrónico (EPR).

Espectrofotometría de Raman.

NO ESPECTROSCÓPICOS.

No miden espectros ni están relacionados con transiciones de energía.

Se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia y en el cambio que se produce debido a esta interacción.

Métodos no espectroscópicos:

Refractometría.

Difracción de rayos X.

Polarimetría.

PROPIEDADES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA.

Se define radiación electromagnética como la propagación a través del espacio de una perturbación electromagnética producida en algún punto del mismo.

Ejemplo: Lo que vulgarmente llamamos luz es un tipo de radiación electromagnética que puede ser detectada por el ojo humano.

Ejemplo: estamos en un estanque, tiramos una piedra y cuando cae se produce una perturbación que genera ondas en el agua.

Toda radiación electromagnética para su estudio puede ser tratada desde un punto de vista corpuscular (fotones de energía) o también desde un punto de vista ondulaturio.

En algunos casos apelamos a un punto de vista corpuscular y en otros casos apelamos al ondulatorio. Algunos espectroscopios están basados en un punto de vista u otro.

Una onda electromagnética desde un punto de vista ondulatorio es el resultado de la oscilación de campos eléctricos y magnéticos que se propagan a lo largo del espacio y también a lo largo del tiempo.

Y



X



Z

El campo eléctrico  va generando ondas a través del tiempo y del espacio.

Posee un componente magnético  que es perpendicular al vector eléctrico

Cuando las ondas se mueven en el aire llevan asociada una determinada velocidad.

Cuando las ondas se mueven en el vacío, viajan con una velocidad igual a la de la luz (300000 Km/s).

También se pueden estudiar bajo un punto de vista temporal.



 X

tiempo

Esta onda no está polarizada, si ponemos un círculo por donde pase la onda en una dirección X, el vector  va en todas las direcciones del espacio, esto significa que la radiación electromagnética no está polarizada.

Cuando cualquier onda de esta radiación se encuentra con una materia que se encuentra cargada, lo que se produce es una transferencia de la radiación a la materia o viceversa. (absorbe energía)

I Q+ I*

CARACTERÍSTICAS DE UNA ONDA:

I). La longitud de onda ():

Distancia existentes entre dos puntos en el que el vector  es idéntico, no sólo en módulo sino también en dirección y sentido.

Si observamos una onda que se desplaza por el espacio y la representamos:





Dependiendo del espectroscopio que usemos, hablaremos en unidades de cm o de nm (UVA).

También sirve para clasificar a las radiaciones electromagnéticas.

II). Número de ondas (v):

En otros espectroscopios se usa otro parámetro llamado número de ondas, que es el número de oscilaciones contenidas en la unidad de longitud. Por ejemplo en un metro cuantas oscilaciones vamos a tener.

Unidades = cm ¹. Es la inversa de la longitud de onda: v=1/ .

III) frecuencia :

Número de oscilaciones por unidad de tiempo. Su valor es igual a la velocidad que lleva la radiación entre la longitud de onda.

= v/ = seg ¹ En el vacío: = c/  donde c= velocidad de la luz.

IV) Intensidad de una radiación electromagnética:

Está asociada al módulo del campo eléctrico.

Es la energía que atraviesa una unidad de área perpendicular a la dirección de la radiación por unidad de tiempo.

I= K·ø  0ø

K= constante que depende de la onda.

ø  0ø= módulo del máximo campo eléctrico asociado a la radiación.

DUALIDAD ONDA-PARTÍCULA.

Hace referencia a que la luz se comporta como onda y está formada por fotones, energía de radiación o cuantos de energía.

Toda la radiación lleva asociada una energía.

Existe una ecuación que relaciona la teoría ondulatoria con la teoría cuántica:

E= h ·= h · (v/ )

H=6,6252 ·10³¹ J·seg

Radiaciones con mayor longitud de onda tienen menor energía.

Podemos usar la longitud de onda para definir el espectro electromagnético.

1 10 10² 10³ 10 10 10 10 10 

 UVA-visible microondas

X

Infrarrojos ondas de radio

Existe una clasificación dependiendo de la región que ocupan las ondas en el espectro:

Rayos  (gamma): hasta 1 nm

Rayos X: 1-10² nm

Rayos UVA-visible: 10² - 10³ nm

Rayos infrarrojos: 10³ - 10º nm

Rayos microondas: 10º- 5·10¹ nm

Ondas de radio: 5·10¹- 10º nm

Los rayos X son peligrosos por que tiene baja longitud de onda y por tanto mucha energía, son capaces de producir transiciones de electrones internas. Cuando nos irradian, los electrones saltan a otros niveles de energía y pueden mutar y cambiar.

Radiación visible-UVA no son dañinos (visible), aunque a veces pueden serlo (UVA), producen transición de electrones externas, no es muy drástico por que vuelven a su posición.

Infrarrojo: tienen alta longitud de onda y baja energía, produce vibraciones moleculares.

Microondas: Producen la rotación de las moléculas. Por ejemplo cuando se pone alimento a descongelar en el microondas, las moléculas de agua rotan a alta velocidad y produce calentamiento rápido en todos los puntos del alimento

Existen estudios de inhibición de proteínas no térmicas y de los efectos térmicos o no térmicos asociados con distorsiones debidas a microondas

INTERACCIÓN DE LA RADIACIÓN CON LA MATERIA.

Dispersión:

Se aplica para calcular la refracción y en polarografía

Cuando se produce la dispersión al interaccionar la radiación con un cuerpo o materia se observa un retardo de la radiación que corresponde a un cambio en su velocidad de propagación , así como un cambio en la intensidad de la radiación.

Absorción:

La absorción la aprovechan las técnicas de espectroscopia de visible-ultravioleta.

Por ejemplo: tenemos moléculas en una disolución y las irradiamos, se produce el paso al estado de transición de las moléculas irradiadas.

X + h · ! X* ! X

!

calor

Lo que hace posteriormente esa molécula es volver al estado inicial por al emisión de calor.

Lo que es importante es la cuantificación de energía pues X pasa a estado excitado cuando recibe una cierta cantidad de energía, por eso se dice que la energía está cuantificada.

h *

E1*

h  E0

Emisión:

La aprovecha la fluorimetría y la fosforescencia.

La molécula excitada vuelve al estado inicial por la emisión de energía.

X + h · ! X* ! X

!

h ·´

ESPECTROFOTOMETRÍA DE VISIBLE-UVA.

Fue una de las primeras espectrofotometrías que se aplicó para el análisis cuantitativo así como para el análisis de estructuras.

Hoy solo tiene interés cuantitativo ya que para conocer la estructura tenemos técnicas más resolutivas.

Las regiones del espectro electromagnético que corresponden al visible-UVA son:

170-250 nm= UVA lejano.

250-350 nm = UVA próximo.

350-1000 nm= visible.

Al UVA lejano también se le llama UVA de vacío ya que el CO2 absorbe a esta longitud de onda y es preciso eliminarlo de la disolución cuando queremos medir algo.

La absorción de energía en el espectro del visible-UVA se debe a la excitación de los electrones hasta niveles de energía superiores.

TIPOS DE BANDAS DE ABSORCIÓN.

Teoría de los orbitales: Cuando tenemos 2 átomos con su orbital atómico, al unirse forman una molécula y se generan dos tipos de orbitales moleculares:

El primer orbital que se forma es de baja energía y tiende a unir la molécula, a este orbital se le llama enlazante.

El otro orbital que se forma es de alta energía y su tendencia es a que se separen los átomos, se le llama antienlazante.

Los electrones con spin diferente son los que pasan de un nivel a otro cuando se excitan.

Orbitales en orden decreciente de energía son:

Orbital  enlazante: se da cuando se forma un simple enlace, es el de menor energía.

Orbital  enlazante: se forma cuando tenemos dobles enlaces o triples enlaces.

Orbital n: se forma cuando una molécula tiene un heteroátomo como N o O2

Orbital  antienlazante es la versión de alta energía, cuando se forma solamente un enlace simple (*)

Orbital  antienlazante (*) es la versión de mayor energía cuando forman dobles o triples enlaces.

Ejemplo: Tenemos electrones en . Cuando llega energía suficiente para subir a un nivel superior la absorbe y sube al siguiente nivel.

*

*

n





UVA vacio

La energía necesaria para pasar de  a * se da en radiaciones de UVA de vacío.

Las transiciones de visible-UVA son las que pasan a electrones del orbital  a un orbital * y las que pasan de n a *.

Esto nos dice como debe ser una molécula para absorber energía en visible-UVA: debe tener dobles enlaces o que contenga algún heteroátomo.

Por ejemplo:

o absorbe mucha energía en el visible-UVA

o

dobles enlaces

OH3-OH3 no absorbe energía con visible pero si la absorbe con UVA de vacío.

Enlace peptídico= UVA lejano

Triptófano, grupos hemos= UVA a 400 nm.

ECUACIÓN DE LAMBERT-BEER.

Relación entre la luz UVA y su absorbancia, concentración y el coeficiente de extinción molar que se representa como E.

Ley de lambert:

Tenemos una lámina cargada de una sustancia con un índice de radiación de luz visible-UVA de intensidad I0. Hay unos compuestos llamados cromatóforos y cuando pasa I0 parte se absorbe IA y otra parte se irradia I que es radiación resultante.

I= I0- IA

I0 IA I

Absorbe por que los electrones de los átomos son capaces de saltar a un nivel superior.

La ley que gobierna este comportamiento se llama Ley de Lambert.

d IX = -K·dX ! " d IX= -K·" dX ! LnI-LnI0=-K·X ! I=I0·e

IX IX

Ecuación de Lambert: I=I0·e

X

K= coeficiente de absorción que depende de las moléculas que hayan en cada medio

X= grosor de la lámina.

La energía se va perdiendo conforme va pasando por el material, sigue una ecuación exponencial.

Cuando trabajamos con moléculas biológicas se usa disolventes que no absorban la radiación UVA por tanto se suele trabajar en agua y podemos ser capaces de conocer la concentración de la molécula absorbente.

Ley de Beer:

Observamos como se reduce la intensidad I. Para esto se usa la Ley de Beer que pone la ecuación de Lamber en función de la concentración y del coeficiente de extinción molar.

Ecuación de Beer: I=I0·e

L= paso óptico que vamos a poner.

K= -2,303· E·C:

C= concentración de soluto

E= coeficiente de extinción molar, tiene unidades de M¹cm¹, es una característica típica de un cromóforo, se puede definir como la absorbancia que tendría esa sustancia a una concentración 1 M cuando se para a través de un paso óptico de 1 cm.

Un espectrofotómetro siempre mide absorbancia o transmitancia:

Transmitancia: se define como T, es el porcentaje de luz transmitida y se define como la luz que sale entre la luz que entra por 100.

T= (I/I0)·100

Es adimensional, no se usa mucho porque no posee relación lineal con la concentración de soluto.

Absorbancia :Lo que se usa mucho es la absorbancia que es el valor del logarítmo decimal de la relación de intensidad de la luz incidente y emergente.

A= log I0/I

Ecuación de Lambert Beer: Abs

Vamos a la ecuación de la Ley de Beer y sustituimos

A= E·C·L

La absorbancia es proporcional a la concentración que tenemos. [ ]

Normalmente usamos cubetas de 1 cm (L), en este caso la ecuación se ve reducida a :

A= E·C

Cada compuesto tiene un espectro de absorción determinado. Si medimos la absorbancia de ese compuesto frente a la longitud de onda incidente observamos que ese compuesto a distintas longitudes de onda presentan distintos coeficientes de extinción dando lugar a un patrón característico de ese compuesto.

 máx

Abs

 (nm)

APARATOS UTILIZADOS PARA MEDIR ABSORBANCIA: ESPECTROFOTÓMETRO.

El espectrofotometro consta de tres partes:

Fuente de energía.

Se denomina lámpara, para la luz visible se usan lámparas halógenas de tunsteno, para UVA se usan lámparas de Deuterio.

En algunos casos también se usan lámparas de Xenón o de mercurio que se usan cuando se requiere mucha luz.

Filtro o monocromador.

Se necesita de un filtro por que la lámpara no emite luz de una sola longitud de onda, emite todo el espectro de longitudes.

El monocromador que suele ser un prisma, descompone la luz en todas las longitudes de onda, existen de dos tipos:

Prismas de refracción o de cuarzo: Cuando llega la luz blanca la separa.

luz

Redes -->[Author:MMZ]de difracción: moléculas de cuarzo que cuando les llega la luz la devuelven en distintas longitudes de onda.

Detector:

Es un mecanismo electrónico formado por:

Célula fotovoltaica.

Fototubos.

Tubos fotomultiplicadores.

Detecta la intensidad que les llega y la transfoman en absorbancia, detectan como a variado la intensidad.

La Cubeta es el dispositivo para poner la muestra:

Para medir en el visible se usan de vidrio o plástico

Para medir en el UVA se usan de cuarzo ya que el vidrio y el plástico absorben el UVA.

Fuente monocromador detector

cubeta

APLICACIÓN DE LA ESPECTROFOTOSCOPÍA VISIBLE-UVA.

De proteínas.

Normalmente hay tres tipos de cromóforos:

Enlaces peptídicos.

Cadenas laterales de algunos aminoácidos.

Grupos protéticos.

El espectro de visible de una proteína con los tres grupos cromóforos presenta tres máximos de absorción en una representación de la absorbancia frente a la longitud de onda absorbida por esa proteína:

Abs

A b c

200 280 visible  (nm)

Enlaces peptídicos.

Es el más importante cuantitativamente hablando en cuanto a la absorción .

Se tienen tantos enlaces peptídicos como aminoácidos tenga la proteína menos uno (nº de enlaces peptídicos =nº de aac - 1).

Su banda está aproximadamente entorno a los 200 nm y se debe a transiciones fundamentalmente del grupo carbonilo del enlace peptídico.

Se van a dar dos tipos de transiciones:

De n * :El coeficiente de extinción molar a 200 nm es de 7000 M¹cm¹ (E).

De  *.

Normalmente no se usa para determinar proteínas por que a 200 nm absorbe prácticamente todo, incluido el disolvente en el que vaya la proteína.

Cadenas laterales de aminoácidos:

Presenta bandas de absorción significativas de 230 nm a 300 nm (UVA próximo). Los tres aminoácidos que presentan absorbancia son:

Fenilalanina (Phe): es un aminoácido aromático. Cuantitativamente es el menos importante, aunque presenta bandas de absorbancia con un máximo a 260 nm, su coeficiente de extinción (E) es muy pequeño de unos 200 M¹cm¹. Su absorbancia a 280 nm es prácticamente nula.

Tirosina (Tyr): su absorbancia es debida al grupo OH que presenta su anillo fenólico y su coeficiente de extinción es mayor de 1350 M¹cm¹ a 280 nm.

Triptófano (trp) (aromático): presenta un coeficiente de extinción a 280 nm de 5800 M¹cm¹.

Grupos prostéticos:

Suelen tener su absorbancia en la zona visible por lo que la mayoría de las proteínas con grupos prostéticos suelen ser coloreadas como la hemoglobina (rojizo debido al grupo hemo).

Suelen tener un coeficiente de extinción bastante importante.

Dos grupos de proteínas:

Transaminasas: son proteínas cuyo grupo prostético les da un color amarillo.

Hemoproteínas: son proteínas con grupos hemos como grupo prostéticos (Hb,Mb, peroxidasas.....)y les da un color rojizo-marrón.

Hemoproteínas:

Presentan el siguiente espectro de absorción:

Abs

280 400 500 550  (nm)

& Obtenemos un pico de absorción a 280 nm, debido a los aminoácidos de la proteína.

& Máximo de absorción a 400 nm debido ala absorción del hierro del grupo hemo.

& De 500 a 550 una banda de absorción producida por el propio grupo hemo.

E400=100000 M¹cm¹.

Esto hace que la espectroscopía visible-UVA haya conseguido grandes avances en el estudio de las proteínas.

Las Transiciones o cambios en la oxidación del hierro del grupo hemo producen diferentes espectros, de manera que se puede estudiar los mecanismos de oxidoreducción de estas encimas.

Muchos de los estudios realizados para saber como se transporta el oxígeno en la sangre se han realizado con esta técnica, pues el espectro cambia cuando a la proteína se le unen ligandos.

Se realizaron estudios de las constantes de unión del O2 y CO2 en la hemoglobina:

Oxi-Hb

Carboxi-Hb

Desoxi-Hb

Sabiendo el espectro de absorción de la proteína se puede conocer el mecanismo de reducción.

Conocer la pureza de una muestra enzimática es más difícil. En las hemoproteínas es más sencillo pues existe un factor llamado Rz que mide el cociente de la absorbancia medida a 400nm y la absorbancia a 280:

Rz= A 400/ A280

De esta manera se sabe cuanto contribuye a la absorción el hierro del grupo prostético y la proteína en sí misma:

þ Si Rz =3-3,2: la hemoproteína es en un 99,9% pura.

þ Si hay contaminación, la absorbancia a 280 aumentaría y Rz baja.

Espectro normal de la hemoproteína

contaminación

280 400 500 550  (nm)

Transaminasas:

Tienen como grupo prostético a la vitamina B6 que puede estar en 2 formas:

& PLP (fosfato de piridoxal es de color amarillo) presenta zonas intensas entre 360 nm y 420 nm

& PMP (fosfato de piridoxamina es incolora) absorbe a 330 nm

330 420

Por ejemplo:

D-ala + PLP ! Piruvato + PMP

-cetoglutarato + PMP ! D-Glu + PLP

Estas reacciones se pueden estudiar por los cambios que se producen en la absorbancia de las proteínas.

Aplicaciones de la espectroscopía visible-ultravioleta en proteínas:

  • purificación de proteínas: se utiliza detectores de visible-UVA en todos los procesos de purificación.

  • Cuantificación: existen dos ecuaciones que dan una idea aproximada de la cantidad de proteína en una disolución:

  • [ proteína]mg/ml= 1.55 (A280) - 0,76 (A 260)

    (A 260) = Absorbancia debida a los ácidos nucleicos que pueden haber en la disolución.

    [proteínas]g/ml= 144 (A215-A225)

  • Determinación del Pk de la tirosina en proteínas: El único grupo disociable que absorbe es la tirosina.

  • Tyr-OH Tyr-O + H

    !

    !pH

    Abs295

    Abs

    Tyr-OH Tyr-O-

    280 295  (nm) pKa pH

    Tyr-OH: no absorbe a 295 nm. Medimos su absorbancia a 280 nm

    Tyr-O: absorbancia máxima a 295 nm.

  • cálculo del número de triptófanos que hay en una proteína.

  • Estudios de desnaturalización-renaturalización.

  • Estudios de unión de ligandos a proteínas.

  • De Ácidos nucleicos.

    Mayoritariamente sus aplicaciones son para estudiar las propiedades ópticas de las bases nitrogenadas (U,G,C,T,A) que son estructuras altamente aromáticas con muchos dobles enlaces y absorben muy bien en la zona del visible-UVA.

    La absorbancia se debe sobre todo a transiciones  *.

    Espectro de absorción Adenina : E257= 15400 M¹cm¹.

    257 nm

    Espectro de absorción Guanina: E257= 11400 M¹cm¹.

    257 280

    Espectro de absorción de la Timina: E257=9700 M¹cm¹

    Espectro de absorción de la citosina: E257=9200 M¹cm¹.

    Aplicaciones:

  • Detectar y cuantificar: hay que medir la absorbancia a 280 y a 260. Se considera que la muestra de ácidos nucleicos es homogénea cuando tiene una relación A260/A280= 1,8-2,0 (bastante pura). Si es más baja estará contaminada con alguna proteína.

  • Estudiar las curvas de desnaturalización-renaturalización del ADN con la temperatura; es la base de la PCR, cuando las bases están sueltas absorben muy bien, pierden absorbancia al estar en la doble hélice del ADN (efecto hipocrómico).

  • Abs

    Tªm Tª

    Tm= temperatura media de fusión, es útil para programar los ciclos de la PCR.

  • calorimetrías: muy aplicadas para determinaciones metabólicas biológicas (ley de Lambert Beer).

  • ELISA: se utiliza para determinar anticuerpos frente a virus como el SIDA, herpes...

  • Estudios cinéticos: propiedades de las encimas.

  • TEMA 2. CROMATOGRAFÍA.

  • INTRODUCCIÓN Y GENERALIDADES.

  • CLASIFICACIÓN

  • TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

  • CROMATOGRAFÍA DE REPARTO.

    Cromatografía de gases.

    Cromatografía en papel.

    Cromatografía en capa fina.

    Cromatografía de permeabilidad: De filtración en gel

    CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN.

    Cromatografía electrostática.

    Cromatografía hidrofóbica.

    Cromatografía de afinidad.

    Cromatografía de interacción inespecífica.

  • HPLC.

  • INTRODUCCIÓN Y GENERALIDADES.

    El término cromatografía fue acuñado en 1906 por un botánico ruso llamado Mikkail Tsweet. Usó este termino para hacer referencia a la separación de pigmentos contenidos en extractos vegetales.

    Actualmente incluye un grupo importante y muy variado de técnicas o métodos que se usan para separar compuestos que están estrechamente relacionados.

    La definición actual de cromatografía es:

    " La cromatografía es una técnica analítica que permite separar los compuestos de una mezcla, aprovechando su diferente distribución entre una fase móvil y una fase estacionaria".

    La fase móvil provoca el avance de la muestra.

    La fase estacionaria provoca su retención.

    Dos etapas globales:

    1º Disolver la mezcla que tiene los componentes que queremos separar en la fase móvil. Normalmente la fase móvil puede ser gaseosa o líquida.

    2º Hacer pasar la fase móvil que lleva la mezcla por una fase estacionaria inmiscible y la cual se mantiene fija en una columna o en un papel.

    Abc a b c

    Fase móvil fase estacionaria

    Las dos fases deben de elegirse de tal forma que los componentes de la mezcla se distribuyan entre las dos fases.

    En la fase móvil, aquellos compuestos que interaccionan débilmente con la fase estacionaria se mueven más rápido y aquellos compuestos que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria se mueven más lentamente.

    Debido a la diferente movilidad de los compuestos de la mezcla se van a dividir en bandas o picos, mucho más puros.

    Las ventajas de la cromatografía frente a otras técnicas de separación (centrifugación y electroforesis) es que son técnicas más rápidas, más simples, económicas y se pueden obtener gran cantidad de componentes puros (cromatografía preparativa).

    Además permite cuantificar la muestra y saber que componentes hay en una muestra (cualitativa).

    CLASIFICACIÓN.

    Existen varios criterios para clasificar a las cromatografías:

    Según la naturaleza de la fase móvil y/o estacionaria:

    Cromatografía de gases (CG).

    Cromatografía líquida (CL): que según su fase estacionaria:

    Cromatografía líquido-sólido (CLS): a través de un sólido se puede hacer pasar una fase líquida siempre que haya algo que retenga al sólido.

    Fase móvil es líquida.

    Fase estacionaria es sólida.

    Cromatografía líquido-líquido (CLL): el líquido de la fase estacionaria se inmoviliza sobre un soporte sólido (tierra de diatomeas) pudiéndose usar como CLL.

    Fase móvil es líquida.

    Fase estacionaria es líquida.

    según el soporte que se use:

    Soporte de superficie plana: cromatografía en papel o de capa fina.

    Soporte en columna: cromatografía en columna. (es el más usado)

    según el modo o la causa por la que se separan los compuestos de la mezcla.

    Fenómeno que provoca la separación

    Clase de reparto o de interacción

    Tipo de cromatografía

    Fase preferida

    Subtipo de cromatografía

    Reparto: se reparte entre fase móvil y estacionaria

    Solubilidad entre las dos fases

    De reparto

    polar

    Fase normal

    apolar

    Fase reversa

    Tamaño de las moléculas

    De penetrabilidad o filtración en gel

    Interacción

    Electrostática

    De intercambio iónico

    aniónica

    De intercambio catiónico

    catiónica

    De intercambio aniónico

    hidrofóbica

    De Interacción hidrobóbica

    Afinidad biológica

    Afinidad

    Interacciones inespecíficas

    Adsorción

    Hidroxiapatito

    TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

    CROMATOGRAFÍA DE REPARTO.

    Se basan en el hecho físico de que si dos fases se encuentran en contacto con un sustrato va a existir una distribución de ese soluto entre cada una de las fases de acuerdo con el coeficiente de reparto.

    Coeficiente de reparto = K= Cs .

    Cm

    Cs= concentración en fase estacionaria.

    Cm= concentración en la fase móvil.

    Cromatografía de gases.

    Es muy importante para estudios químicos de compuestos, por ejemplo estudios de compuestos de bajo peso molecular como fenoles, azúcares sueltos. Pero no es muy usada en bioquímica debido a que la mezcla de los componentes debe administrarse en forma de gas.

    Tenemos que hacer la volatilización de los componentes de la muestra.

    Se usa mucho para detectar nuevas drogas en deportes (dopping).

    La fase móvil es un gas y la fase estacionaria puede ser sólido (CGS) o líquida (CGL).

    Ejemplo:

    Tenemos una columna con una fase estacionaria sólida o líquida y pasamos un gas (fase móvil) cargado con tres componentes ( X, Y, Z), al final lo que obtenemos es una separación de los tres componentes por su interacción con la fase estacionaria.

    Vamos recogiendo muestras conforme pasan por la columna.

    En todas las cromatografías al representar la absorbancia frente al tiempo obtenemos un pico de máxima absorción que sale en un determinado tiempo llamado pico de retención o Tr.

    Abs X Y Z

    Gas

    Fase móvil Fase estacionaria

    Columna

    Tiempos de retención

    Fase móvil:

    La fase móvil es un gas inerte (neón, Helio, Argón), tenemos que controlar la presión con la que entra en la columna para eso tenemos en el sistema un barómetro.

    La muestra se introduce en la fase móvil por el inyector que trabaja a una temperatura de 100º C.

    Todo lo que sea volátil a 100ºC y entre en el gas (fase móvil) , va a una columna que se encuentra en el interior de un horno:

    muestra

    Inyector fase estacionaria (columna)

    (100ºC)

    (200-300 A)

    barómetro detector

    gas

    inerte horno (150-180º)

    Fase estacionaria:

    La fase estacionaria de la columna debe tener las siguientes características:

    Debe ser un compuesto no volátil a 180ºC

    Debe tener baja viscosidad para que no retenga el gas que pasa.

    Debe ser inerte, no debe interaccionar químicamente con los compuestos de la mezcla.

    Tipos de cromatografía de gases:

    En fase reversa:

    La fase estacionaria debe ser apolar (sin carga); se usan polímeros de 18 carbonos, llamados columnas C18

    Las moléculas muy polares pasan rápidamente por la columna.

    Las moléculas muy apolares pasan lentamente o se quedan dentro.

    En fase normal:

    La fase estacionaria es polar

    Los compuestos polares son retenidos en la columna.

    Los compuestos apolares pasan rápidamente

    Detectores: Los más usados son los de espectrofotometría de masas.

    volatilización de las muestras.

    Muchas muestras que no se podían analizar por esta cromatografía (CG) por que no eran volátiles ahora se pueden analizar haciéndolas volátiles.

    Por ejemplo: El fenol no es volátil a 100ºC por tanto no será volátil cuando lo inyectemos (inyector está a 100ºC). Para volatilizarlo podemos recurrir a dos mecanismo:

    Siliación: se trata la mezcla con cloruro de trimetilsilano y se produce un derivado del silano que es volátil

    CH3 CH3

    R-OH + Cl-Si-CH3 R-O-Si-CH3 + HCl

    CH3 CH3

    Metilación. Se trata la muestra con metanol en presencia de trifluoruro de boro. I3B es un catalizador, no se consume durante la reacción.

    O

    R-COOH + I3B + CH3OH R-C-O-CH3 + F3B

    Columnas de gases: Son largas (5m) y muy finas (1-2 mm de diámetro)

    Cromatografía en papel.

    Es otra cromatografía de reparto donde la fase estacionaria no va a ser el papel sino las moléculas de agua retenidas en las fibras de celulosa. La fase móvil es un disolvente orgánico o una mezcla de disolvente.

    Puede ser:

    Ascendente: Es una cubeta tapada para evitar la evaporación del disolvente. En la cubeta metemos el papel de celulosa. Por capilaridad el disolvente va subiendo por el papel.

    muestra

    Disolvente papel

    Descendente: es un reservorio de fase móvil donde colgamos un papel y el paso del disolvente es por capilaridad y por gravedad, por tanto es más rápido.

    El soporte suele ser papel de filtro.

    La muestra ha de ser depositada en forma de gota sobre el papel.

    La aplicación de la muestra debe ser en una pequeña zona, ya que al depositar la gota sobre el papel se produce su difusión y por eso la gota debe ser muy pequeña.

    Se deposita con capilares de vidrio de 1 mm de diámetro,

    Hay que aplicarla de forma que quede por encima del disolvente.

    El disolvente sube por capilaridad pero arrastrando la muestra y los componentes se separan dependiendo de su coeficiente de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

    Antes de que llegue la fase móvil al final de papel, se para la cromatografía, es decir, se saca el papel de la cubeta y hay que dejarlo secar al aire.

    Una vez seco puede detectarse las manchas por que aparecen coloreadas o por tinción.

    Al final obtenemos una separación de los componentes de la muestra por reparto.

    El parámetro que define como se ha movido cada sustancia en el papel no es un valor absoluto sino que es un valor relativo llamado factor de retraso o Rf.

    Es la distancia que ha avanzado el soluto correspondiente, entre la distancia hasta la que ha avanzado el frente.

    Rf = distancia soluto = X/f

    distancia frente f x

    Cromatografía en capa fina.

    Es una cromatografía de reparto. Se le llama PCL ("thin laye chromatography")

    Se trata de una optimización de la cromatografía en papel.

    Una fase móvil o disolvente pasa a través de la fase estacionaria por capilaridad y hace que las moléculas se separen por el Rf.

    Soporte:

    En vez de papel se usa un sólido pulverizado extendido en forma de capa fina, tiene entre 0,15 - 0,5 mm de grosor.

    Puede ser de celulosa, poliacrilamida, albúmina o gel de sílice.

    Este sólido se extiende sobre un soporte de plástico o cristal.

    sólido

    plástico

    Ventajas frente a cromatografía en papel:

    Presenta mayor acción capilar: por tanto mayor rapidez.

    Presenta mayor superficie de contacto entre fase estacionaria y fase móvil lo que implica mayor eficacia en la cromatografía (se separan mejor).

    Presenta una reducida dispersión de los solutos al aplicar la muestra, esto implica a parte de mayor eficacia cromatográfica una mayor sensibilidad para detectar las manchas.

    Se suele hacer una cromatografía en dos dimensiones:

    1º dimensión:

    Aplicamos la muestra .

    Lo sumergimos en la cubeta con el disolvente.

    Obtenemos la separación de las distintas sustancias arrastradas por el disolvente.

    1ª dimensión

    2º dimensión:

    La sumergemos otra vez pero dándole la vuelta en otra dirección.

    2º dimensión

    1ºdimensión

    Se tiñe la muestra y vemos los distintos picos que componen la muestra.

    Cromatografía de penetrabilidad o permeabilidad.

    Es de los más sencillos conceptualmente hablando.

    Aparecen con distinto nombre: " filtración en gel", "cromatografía de tamizado molecular" o " cromatografía de exclusión por tamaño"

    Separa los componentes de una muestra por su tamaño molecular y lo que avanza más rápidamente son las moléculas de mayor peso molecular, los que tienen peso molecular más pequeño se quedan retenidos en el gel, salen reterdados.

    Soportes:

    El soporte es la resina del interior de la columna.

    La fase estacionaria es el disolvente que pasa por la columna (o soporte) que retiene las moléculas de la muestra.

    Los soportes más usados son los polímeros fuertemente hidrofílicos que al ponerse en contacto con el agua forman una especie de gel.

    Entre ellos los más usados en bioquímica son polisacáridos tipo dextronas o agarosas.

    Cuando se mete en una columna y entran en contacto con el agua forman una especie de bolas que tienen infinidad de agujeros por el que pueden entrar cosas con un peso determinado.

    Todos estos geles están comercializados y tienen nombres como "biogel", Empresas farmacéuticas venden polímeros llamados "sephanyl" y "sephadex".

    Tenemos que elegir el tamaño de poro que queremos usar para ellos tenemos que saber que queremos purificar y saber el peso molecular de lo que vamos a purificar para elegir el tamaño del poro.

    Los geles Sephadex que hay en el mercado son:

    Sephadex Pm

    G10 7000

    G15 15000

    G25 1000-5000

    G50 1500-30000

    G75 3000-80000

    G100 4000-100000

    G150 5000-150000

    G200 5000-600000

    Separación de las moléculas en las columnas:

    aplicación

    1º se hace una aplicación zonal de la muestra: zonal de la muestra

    grifo

    Cuando se trata para filtración en gel necesitamos una columna de cromatografía muy fina y muy larga.

    2º Cuando abrimos el grifo de la columna separamos las moléculas por su peso molecular.

    Al final obtenemos la elución de los componentes a través de la columna.

    En la representación aparecen picos en forma de campana de Gauss debido a que hay una dispersión de la muestra en el gel.

    Tr

    Si no hubiera dispersión y sólo hubiera separación por tamaño nos daría una representación gráfica así:

    Tr = tiempo a la mitad del pico de la campana de Gauss, es el tiempo de retención, es característico de cada molécula.

    Matriz:

    La matriz está formada por bolas y entre las bolas hay huecos que están llenos de disolvente que suponen el volumen muerto de la columna.

    Volumen muerto o volumen que queda entre la columna= V0

    Vi= volumen interno que queda dentro de las bolas.

    Vtotal o volumen del disolvente= Vs =V0 + Vi

    Vt= Vs+ Vmatriz.

    Vt es el volumen total.

    V matriz es el volumen que ocupa el polímero

    Aunque Vt es prácticamente igual al Vs por que el Volumen que ocupa la matriz es muy pequeño.

    Cálculo de V0:

    Moléculas de alto peso molecular no entran por los poros de la matriz, se cuelan por los huecos que dejan las bolas y eluyen rápidamente. Por tanto una molécula que no entre en el gel (poros de las bolas) sale con V0 de la columna, esto ocurre con el azul de dextrano (Pm = 2 millones).

    Absorbancia

    azul de dextrano

    Vo Volumen

    Usando estos "marcadores" podemos calcular el volumen de exclusión de esa columna y el tiempo de retención.

    Cálculo de VS:

    Para calcular Vs es más complicado se necesita una molécula que entre por todos los poros de la matriz.

    Para ello usamos azul de bromofenol.

    Un problema de estas moléculas es que se producen interacciones hidrofóbicas por que pasan mucho tiempo en la columna y da lugar a un retraso adicional.

    Una molécula que funciona bien es la acetona que tiene bajo peso molecular y no tiene problemas de interacción con la columna, pasa por todas partes, detectamos la absorbancia y calculamos el valor de Vs.

    Ve

    Azul dextrano (vo) acetona (Vs)

    La acetona por su alto peso molecular va a ser la última molécula que salga de la columna

    Todo lo que queramos separar estará en medio de esos los picos (azul de dextrano y acetona) y salen con su correspondiente Ve (volumen de elución).

    Todos estos volúmenes se pueden calcular experimentalmente y con ellos podemos calcular Kav o coeficiente de distribución de cada una de las moléculas que se separan por la columna.

    Kav = Ve - Vo = Ve - Vo

    Vi Vs - Vo

    Aplicaciones de esta cromatografía:

    Determinación del peso molecular.

    El Coeficiente de reparto está inversamente relacionado con el peso molecular de las moléculas que inyectamos en la columna.

    Log Pm

    Kav

    Si metemos en la columna una molécula de la que no conocemos el Pm podemos extrapolar a la recta su valor de Kav y obtenemos así el Pm de la molécula.

    La Limitación es que deben ser proteínas de un mismo tipo: globulares, fibrosas.

    Para evitar interacciones de otro tipo se hace correr las muestras con una alta concentración de sal, de manera que se evitan interacciones hidrofóbicas con la matriz.

    Obtener muestras puras (aplicaciones preparativas).

    La pega que tiene esta aplicación de la cromatografía es que solo se puede aplicar en un volumen de muestra que sea del 10% del volumen total de la columna.

    Esto es por que si aplicamos un 50% de volumen habrá moléculas de igual peso molecular que no estén juntas y no les dará tiempo a juntarse.

    separación de grupos

    Por ejemplo para cambiar de tampón o para desalar

    Al final sale la sal, igual ocurre con el tampón.

    CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN.

    Las muestras que queremos separar van a quedar unidas a la matriz (fase estacionaria).

    Esto significa que el volumen de muestra que podemos meter es todo lo grande que queramos siempre que no se saturen los grupos que están interaccionando. Así esto nos permite trabajar con volúmenes grandes de muestras.

    Para sacar lo que ha quedado pegado en la matriz hay que cambiar las condiciones del disolvente.

    Las columnas son de mayor diámetro y cortas (dan mejor separación de los picos).

    Normalmente esta cromatografía se hace en columna pero no siempre, pues a veces se hace una cromatografía en baño que tiene tres etapas:

    1º retención:

    Tenemos un vaso de precipitado en el que tenemos la fase estacionaria.

    Añadimos la fase móvil junto con la muestra y agitamos.

    Al final tendremos la fase estacionaria con el componente unido y una 2ª fase donde estará la fase móvil con lo no unido.

    Descartamos la fase móvil y nos quedamos con la fase estacionaria y lo unido.

    2º lavado:

    El lavado supone enriquecer la fase estacionaria y eliminar las cosas que se han unido inespecíficamente. Para ello a la fase estacionaria con las moléculas unidas se le añade la fase móvil inicial, agitamos y obtenemos 2 fases:

    Fase móvil.

    Fase estacionaria con el componente unido y con el componente puro.

    Finalmente se decanta.

    3º elución:

    Consiste en echarle una fase móvil nueva con algo que haga que se despegue el componente que queremos purificar. Ejemplo, NaCl 0,5 M.

    Agitamos y tenemos:

    fase móvil con el componente unido

    fase estacionaria.

    Se decanta y tenemos en la fase móvil nuestro componente purificado

    Para quitar el ClNa se utilizaría la filtración en gel

    Cromatografía electrostática.

    Fase estacionaria:

    La fase estacionaria tiene grupos cargados que van a interaccionar electrostáticamente con iones de signo contrario de la fase móvil.

    La fase estacionaria está formada por una matriz inerte que puede ser dextrano, agarosa o polietileno, a la que se le une mediante un brazo un intercambiador iónico (con carga positiva o negativa).

    Carga positiva: intercambio de aniones.

    Carga negativa: intercambio de cationes.

    La mayor o menor basicidad de los grupos que pongamos van a determinar que el intercambio sea fuerte o débil.

    De aniones:

    Fuertes:

    CH2_CH3

    |

    -CH2N_CH2_CHOH_CH3

    |

    CH2_CH3

    Dietil-2-hidroxipropilaminoetilo.(QAE)

    Débiles:

    CH2_CH3

    |

    CH2_CH2N_H Dietilaminoetilo (DAE)

    |

    CH2_CH3

    De cationes:

    Fuertes:

    CH2_CH2_CH2_SO3 Sulfopropilo (SP)

    Débil:

    CH3-COO Carboximetilo (CM)

    Cualquier intercambiador de iones va a tener sus grupos cargados unidos electrostáticamente a contraiones de forma que el conjunto sea electrostáticamente neutro.

    Para un intercambiados catiónico:

    En la fase móvil metemos un soluto con carga positiva que desplaza al sodio o a los protones y se va a unir al anión (carga negativa).

    Intercambiador

    A- Na+ (H+) S(+)

    soporte brazo

    Los contraiónes más usados en bioquímica ordenados de mayor a menor afinidad van a ser para intercambiadores catiónicos:

    Ca > Mg > K > NH4 > Na > H

    Para un intercambiador aniónico:

    Los distintos intercambiadores pueden tener diferente afinidad por un contraión u otro.

    Intercambiador

    C+ Cl- (OH-) S(-)

    soporte brazo

    Los contraiónes para intercambiadores aniónicos más usados en bioquímica ordenados de mayor a menor afinidad van a ser:

    Citrato > oxalato > cloruro > formiato > acetato > OH-.

    Los otros iones que hay que tener en cuenta durante una cromatografía de intercambio iónico son los solutos cargados que van a ir en la fase móvil y que son los que queremos separar durante el proceso:

    Grupos ácidos desprotonados aportarán cargas negativas mientras que los grupos básicos desprotonados aportan cargas positivas.

    En el caso de polielectrolitos (proteínas por ejemplo) en el que hay presentes grupos ácidos y básicos, lo que define que se comporten como cationes o aniones es el pH de medio, según sea mayor o menor que el punto isoeléctrico del polielectrolito. Punto isoelétrico es el pH en el que el sumatorio de las cargas sea 0.

    Cationes; pH < pI.

    Aniones; pH>pI.

    Así pues tenemos un soluto catiónico (s*) que viaja en la fase móvil a través de la resina de intercambio de cationes, cuyo contraión es el sodio.

    Se da un equilibrio entre la resina con el sodio unido y el soluto catiónico que provoca el desplazamiento del sodio de la resina por el soluto catiónico.

    Resina(-)_ Na(+) + S(+) Resina(-)_S(+) + Na(+)

    K = [Resina(-)_S(+)][Na(+)]

    [Resina(-)_ Na(+)][S(+)]

    K viene definido por la afinidad que tiene el Na+ o el S- por la resina.

    Podemos alterar algunos factores que modifican las constantes de equilibrio:

    1º podríamos modificar pH:

    El cambiar el pH nos modifica la carga neta positiva de S(+) y desplaza el equilibrio a la derecha o a la izquierda.

    PH>pI: todo S(+) está con carga positiva, se desplaza el equilibrio a la derecha, favorece la unión a solutos.

    PH=pI ; S tiene carga neta igual a 0. Todo el equilibrio va hacia la izquierda, no se une soluto a la resina.

    2º concentración de contraión:

    Según la ley de acción de masas; el equilibrio puede ser modificado por la concentración de sodio.

    Altas concentraciones de sodio desplazan la reacción hacia la izquierda.

    Etapas del intercambio iónico:

    1º elegir columna:

    Pensar que es lo que queremos separar y según esto elegimos la columna que vamos a utilizar ( catiónica o aniónica).

    2º elegir tampón:

    Tampones aniónicos (acetato) para intercambio de cationes

    tampones catiónicos (TRIS clorhídrico) para intercambiadores de aniones.

    Si fuera al revés, es decir usar un tampón aniónico para un intercambiador aniónico, el tampón se pegaría a la resina y generaría un gradiente de pH en la columna.

    3º Punto isoelectrico

    Hay que conocer el punto isoeléctrico del componente a separar y trabajar entre 0,75-1,5 unidades de pH:

    Por enzima del punto isoeléctrico en el caso de que sea un intercambiador de aniones.

    Por debajo del punto isoeléctrico en el caso de que sea un intercambiadores de cationes.

    4º Cromatografía:

    Al hacer la cromatografía trabajamos con dos reservorios:

    Reservorio A: tenemos 1 tampón por ejemplo Acetato.

    Reservorio B: tenemos un tampón, por ejemplo acetato con ClNa (1M).

    Inyectamos muestra y la pasamos por una columna de intercambio de iónes. La muestra va en el tampón de acetato.

    Tenemos un registrados para seguir la absorbancia en el tiempo según el aumento de la concentración de NaCl en el medio.

    [NaCl]

    Abs Aplicación elución Acetato muestra lavado

    Acetato

    NaCl 1M

    P1

    muestra

    Tiempo

    Al principio se aplica la muestra con 0% de NaCl.

    Nuestro componente P1 se pega a la columna.

    Otros componentes no se pegan (P2,P3, P4...) y se observa un aumento de la absorbancia debida a las proteínas que no se pegan y que salen de la columna.

    Hacemos un periodo corto de lavado para que terminen de salir los componentes que interaccionan de forma más débil con la resina.

    El proceso final es el de elución, se crea un gradiente entre el tampón A y el B para que aumente la concentración de NaCl.

    Llegará un momento que debido a la alta concentración de NaCl no se separe la proteína P1 y salga de la columna.

    Resina(-)_ Na(+) + S(+) Resina(-)_S(+) + Na(+)

    Durante la aplicación de la muestra se desplaza el equilibrio (S+=P1) a la derecha.

    Si aumenta la concentración de NaCl se desplaza a la izquierda y P1 se despega.

    Se sube la concentración de NaCl hasta 1M y se mantiene un cierto tiempo, posteriormente se baja la concentración de la sal a 0 para regenerar la columna y volverla a usar en iguales condiciones que inicialmente.

    Cromatografía hidrofóbica.

    La cromatografía hidrofóbica y la cromatografía de afinidad comparten los mismo planteamientos experimentales que la cromatografía iónica:

    Retención de solutos en la columna.

    Posterior elución por cambios en las propiedades de la fase móvil.

    Se diferencian en la naturaleza de la interacción.

    Consiste en un soporte con un brazo donde pegamos el grupo hidrofóbico. El grupo hidrofóbico es normalmente una cadena de carbonos , como el grupo fenilo.

    La proteína a separar lleva un aminoácido hidrofóbico (fenilalanina).

    L H proteína

    Alrededor de los grupos hidrofóbicos el agua se encuentra más ordenada que en la disolución.

    L proteína proteína

    H20 sal sulfatada

    Si añadimos una sal 4M (ClNa 4M) y (NH4)2SO4(2H); El (NH4)2SO4(2H) se lleva el agua de los grupos hidrofóbicos y las sales se solvatan, lo que se consigue es que el grupo hidrofóbico de la matriz y el aminoácido hidrofóbico de la proteína se unan.

    Es un proceso similar a la desnaturalización de proteínas por concentración de sales pues las sales quitan el agua del interior de las proteínas donde se encuentran los grupos hidrofóbicos.

    En una proteína plegada la mayoría de los residuos hidrofóbicos se encuentran en el interior de la proteína (para evitar el contacto con el agua). Sin embargo siempre queda algún residuo en el exterior y va a ser responsable de esa interacción.

    Cuantos más residuos hidrofóbicos hayan en el exterior de la proteína, esta será más hidrofóbica desde el punto de vista cromatográfico y mejor será para pegarse a este tipo de resinas.

    Permite separar proteínas atendiendo a la diferente hidrofobicidad.

    Fase estacionaria:

    Suelen ser polímeros hidrofílicos como la agarosa.

    A estos polímeros se les une covalentemente grupos hidrocarbonados como los grupos metilo, butilo, fenilo u octilo (muy hidrofóbico).

    En el mercado encontramos fenilagarosa u octilagarosa.

    Las sales usadas para la elución suelen ser sulfato amónico (NH4)2SO4 o ClNa.

    Ejemplo de cromatografía:

    Pegamos con alta concentración de sal: tampones con alta concentración de sal

    Separamos con baja concentración de sal; hacemos gradientes decrecientes de sal.

    [sal]

    Abs(260nm) Aplicación elución tampón tampón muestra lavado

    +

    (NH4)2SO4 2M

    P1

    muestra

    en tampón

    +(NH4)2SO4

    Tiempo

    Columna de fenilsepharosa.

    Pasos de la cromatografía:

    1º Aplicamos la muestra a una concentración inicial de 2M, algunas proteíns se pegan en la columna y otras eluyen.

    El incremento inicial de la absorbancia en la fase de "aplicación de la muestra" se debe a proteínas hidrofílicas que eluyen.

    2º Lavado con tampón para evitar moléculas que se hayan pegado inespecíficamente.

    3º Hacemos un gradiente bajando la sal y conseguimos que nuestra proteína eluya

    Cromatografía de afinidad.

    Está basada en interacciones inespecíficas entre dos moléculas por ejemplo: hormona-receptor, proteína-ligando, antígeno-anticuerpo.

    Lo complicado es que una vez unida a la columna la podamos separar.

    Para separarlo se suele usar altas concentraciones de sale, incrementos de pH o moléculas análogas como inhibidores potentes.

    TEMA 4. ELECTROFORESIS.

    INTRODUCCIÓN.

    La electroforesis es una técnica de separación que se basa en el fenómeno físico por el que una molécula cargada se va a mover dentro de un campo eléctrico.

    Una molécula cuando se somete a un campo eléctrico se va a mover con una velocidad constante que viene determinada por la fuerza eléctrica que depende de la carga y del campo eléctrico y por una fuerza de fricción que depende de la velocidad de la molécula y de la constante de fricción.

    Fe= Q x E Ff= V x f.

    Cuando Fe= Ff , la velocidad es constate y por tanto la velocidad es:

    V= Q x E Q x E = V x f.

    f

    E= unidad de campo eléctrico

    Se define movilidad electroforética () como:  = V / E = Q / F.

    La movilidad depende de su carga y del coeficiente de fricción:

    Cuando aumenta la carga, aumenta la movilidad.

    Cuando baja el coeficiente de fricción, aumenta la movilidad.

    El coeficiente de fricción depende del tamaño y de la forma de la molécula.

    Las moléculas se rodean de una esfera de solvatación que tiene una carga diferente a la molécula que rodea.

    La electroforesis es uno de los métodos que más se usan.

    TIPOS DE ELECTROFORESIS.

    Existen dos procesos para realizar una electroforesis:

    Electroforesis de frente libre o móvil:

    Diferencia de potencial que se aplica a una disolución o a una suspensión. Prácticamente está en desuso, el primero que la utilizó fue Tiselius (1948).

    Q(+) Q(-)

    Compuestos con Q(-) Compuestos con Q(+)

    Electroforesis de zona:

    El campo eléctrico se aplica a un soporte estabilizante y la muestra se aplica a una zona estrecha del soporte.

    Cuando se aplique el campo eléctrico la muestra se mueve por todo el soporte.

    Tipo I: soportes no restrictivos:

    No oponen resistencia al paso de las moléculas a su través,como por ejemplo:

    El agar, es agarosa y agaropeptina, se usa para separar ácidos nucleicos.

    El papel; es similar al de filtro.

    El acetato de celulosa; son tiras estrechas, y una vez que se han teñido los compuestos de la muestra si se deshidrata se queda transparente y se puede usar un densitómetro para medir la absorbancia del papel de manera que obtenemos un registro en papel. El área del pico es proporcional a la cantidad de proteína que se está midiendo.

    Tipo II: soportes restrictivos:

    Oponen resistencia al movimiento de moléculas a su través.

    El más conocido es el de poliacrilamida, es un medio poroso en el que el diámetro de poro hace que se muevan más o menos las moléculas por el gel. Usamos una concentración que permita que las moléculas de bajo diámetro se muevan mejor que las de mayor diámetro.

    FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS.

    Campo eléctrico:

    Diferencia de potencial (voltios):

    Viene dado por el aparato y de la diferencia de potencial depende el movimiento o movilidad de la molécula.

    Un incremento del potencial, produce un aumento de la movilidad de la molécula y por tanto un aumento de la velocidad.

    Normalmente las electroforesis son entre 10-500 V se llaman electroforesis de bajo voltaje.

    Para electroforesis de 500-10000 V hacen falta aparatos más complejos y se llaman electroforesis de alto voltaje.

    Intesidad ( Amperios):

    Para una diferencia de potencial dada su valor que normalmente está entre 5-50 mA, nos determina la resistencia del soporte por ello el movimiento de las moléculas dependen de la intesidad

    Resistencia (ohmios).

    A mayor resitencia del soporte menor movilidad electroforética.

    La resistencia depende de la naturaleza del soporte y de sus dimensiones.

    Temperatura:

    El paso de la corriente por el soporte genera calor. Hay que tenerlo en cuenta por que si corremos proteínas y queremos mantenerlas en forma nativa se puede desnaturalizar por el calor.

    Los aparatos de electroforesis suelen llevar sistemas de refrigeración o si no lo metemos en la cámara frigorífica.

    Muestra:

    La muestra debemos tenerla en el mismo tampón donde se realice la electroforesis. La movilidad por tanto es mayor conforme aumenta la carga y baja el tamaño de la molécula.

    Tampón:

    La electroforesis se realiza en un medio tamponado por que se produce la hidrólisis del agua en los dos electrodos de manera que en el ánodo se producen protones y oxígeno y en el cátodo se produce H+ y OH-.

    Ánodo: 2H2O 4H+ + O2

    Cátodo: 4H2O 2H2 + 2OH- + 4 e-

    Las burbujas que se forman durante la electroforesis se deben al O2 y al H2 liberado

    En el ánodo baja el pH y en el cátodo aumenta el pH, estos cambios de pH cambiarían la carga de las moléculas por eso se realizan tampones que son capaces de mantener el pH constante

    Fuerza iónica:

    Los tampones hay que elegirlos de manera que no afecten a las moléculas que se quieren separar y deben tener una fuerza iónica baja ya que una fuerza iónica alta afecta a la esfera de solvatación de las moléculas y por tanto a la movilidad.

    La fuerza iónica viene dada por la concentración de los iones de la disolución.

    Una concentración adecuada está entre 0,05-0,1 M

    PH del tampón:

    También lo debemos controlar pues determina la carga de la proteína, depende

    del tipo de molécula que queramos separar.

    ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS.

    Las proteínas son polielectrolitos y su carga neta depende de su contenido en una serie de aminoácidos: glutámico; aspártico, lisina, Arginina e histidina (son aminoácidos con carga en la cadena lateral).

    Dependiendo del pH las proteínas tendrán un determinado grado de ionización en esos aminoácidos.

    ELECTROFORESIS SOPORTES NO RESTRICTIVOS:

    Electroforesis en papel y acetato de celulosa.

    En electroforesis de soporte no restrictico el tamaño de las proteínas es muy pequeño en comparación con el tamaño de los poros del soporte de modo que el entramado del soporte no interfiere en el movimiento de las moléculas.

    La separación depende de la densidad de carga a un pH seleccionado.

    La densidad de carga es la relación carga/masa de la molécula.

    1º Aplicación de la muestra:

    La muestra está disuelta en tampón de electroforesis y se deposita en una pequeña zona, la zona más estrecha posible, en el centro o en el extremo del soporte (papel o acetato de celulosa).

    Se depositan unos 10l de muestra.

    Si nos vemos en la necesidad de aplicar más, ponemos unos 10 ml, secamos y otros 10 l.

    Debemos humedecer el papel con el tampón para asegurarnos de que la corriente pasa por todo el papel.

    2º Aplicamos una diferencia de potencial:

    V=20 V/cm para que cada componente se mueva hacia los distintos electrodos.

    Los electroforesis finaliza cuando se produce la máxima separación entre los componentes de la muestra sin sobre pasar los límites del soporte.

    Debemos poner marcadores con una movilidad mayor que la de la muestra que queremos separar (marca el frente de la electroforesis). Los más usado son la dinitrofenillisina (DNF-Lys =Q(+)) y el azul de bromofenol (Q(-)), de manera que cuando alcancen los extremo del papel paramos la electroforesis, y así nos aseguramos de que no se escapa nuestra muestra.

    3º tinción:

    Negroamida al 1% (peso/volumen) en ácido acético.

    Azul brillante de goomasi al 0,1% en una mezcla de metanol, agua y acético (9:9:2)

    4º desteñir:

    Para eliminar el colorante que no se ha unido.

    Permite observar cantidades de proteínas del orden de 1gr.

    La electroforesis en papel se usa poco para proteínas, se usa más para separación de aminoácidos o de péptidos de pequeño tamaño.

    El acetato de celulosa se usa en bioquímica para separación de proteínas de fluidos biológicos como suero o la orina.

    La electroforesis sobre papel de alto voltaje ( V= 200 V/cm):

    • Al aumentar V aumenta la temperatura, hay que refrigerar el sistema.

    • Mejora la resolución, al disminuir el tiempo disminuye la difusión.

    ELECTROFORESIS EN SOPORTES RESTRICTIVOS:

    Electroforesis en geles de poliacrilamida.

    • Se usa para separación de proteínas y en ocasiones para ácidos nucleicos de pequeño tamaño.

    • Es útil por el alto poder de resolución o de separación, debido al efecto de tamizado que ejerce el propio soporte. Se puede preparar geles de tamaños de poro muy variados de manera que las proteínas a separar puedan tener un tamaño similar a las del poro del gel. El gel por tanto participa en el proceso de separación.

    • La separación de las moléculas en el gel depende de la densidad de carga y del tamaño de la proteína. Las de mayor tamaño se retrasa por que les cuesta más pasar por el gel

    • Los geles son químicamente inertes frente a la mayoría de las moléculas biológicas, también son estables en una amplio intervalo de pH, temperatura y fuerza iónica.

    • Son transparentes y por tanto se pueden someter a densitometría.

    • Son resistentes a agentes desnaturalizantes que muchas veces acompañan a la muestra como la urea o los detergentes.

    • Son mecánicamente estables. Se pueden someter a deshidratación, se convierten en una lámina fina que facilita el almacenaje y someter a autoradiografía, por ejemplo; lo tratamos con agentes radiactivos y el gel seco lo ponemos encima de una película fotográfica, si alguna molécula está unida al agente radioactivo se puede observar en el revelado.

    Se forman por la polimerización de dos compuestos; acrilamida y bisacrilamida. Se añade persulfato (S2O8) para la polimerización, el persulfato se descompone y da lugar a radicales libres que atacan al doble enlace de la acrilamida formando radicales acrilamida. Estos radicales hacen que la poliacrilamida polimerice.

    Si en el medio sólo hay acrilamida se forman polímeros lineales de acrilamida por eso es necesario añadir bisacrilamida que sirve de puente entre las cadenas lineales de acrilamida, formando un entramado.

    Al medio se añade también TEMED que estabiliza los radicales libres y acelera el proceso de formación del polímero. Está preparado a pH básico.

    También podemos encontrar electroforesis que no usan S2O8 y que usan riboflobina y para que polimerice el gel lo tenemos que acercar a la luz, polimeriza por el componente UVA de la luz.

    • El tamaño de poro de los geles de acrilamida dependen de la concentración de acrilamida en el medio. A concentraciones altas, obtenemos menor tamaño de poro.

    • Para una determinada concentración de acrilamida, el tamaño de poro depende también de la concentración de bisacrilamida. El tamaño de poro baja conforme aumentamos la concentración de bisacrilamida, hasta llegar a un mínimo en el que la concentración de bisacrilamida en igual al 5% de total de la mezcla de acrilamida y bisacrilamida (5%C).

    %T= tanto por ciento de acrilamida con bisacrilamida, expresado en gr/100ml de disolución:

    Acrilamida + bisacrilamida gr/ 100 ml disolución.

    %C= cantidad de bisacrilamida con respecto del total de acrilamida y bisacrilamida.

    A partir del 5%C conforme aumenta la concentración de bisacrilamida ya no baja el tamaño si no que aumenta el tamaño del poro por que se forman cadenas lineales con las cadenas de las acrilamidas.

    Ejemplo: preparar disolución: 30:2,67

    30= %T ; son 30 gr en 100 ml de disolución

    2,67= %C; es el 2,67% de bisacrilamida de los 30 gr, por tanto 0,8 gr de bisacrilamida

    Resultado: pesamos 29,2 gr de acrilamida y 0,8 gr de bisacrilamida.

    La elección de la concentración final de acrilamida depende del rango de tamaño de las proteínas que queremos separar.

    • A concentraciones altas como concentraciones de 30% tiene un límite de exclusión de unos 2000 daltons. Moléculas de más de 2000 Daltons no entran en el gel.

    • Geles con 2,5 % de acrilamida tienen un límite de exclusión de 1 millón de daltons.

    • Lo normal es usar concentraciones de 7,5%, 10% o 12%.

    Al polimerizar toma la forma del recipiente que lo contiene.

    Tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida:

    Según el recipiente que contiene el gel:

    En tubo:

    Se realizan en tubos de vidrio de dimensiones variables que se rellenan de la disolución de polimerización.

    Normalmente sólo se usan como primer paso de la electroforesis bidimensional. Se usa poco.

    También se usa electroforesis preparativas y en el caso de que las preparaciones sean radioactivas.

    El problema de la electroforesis en tubo es sacar el gel del tubo para poder teñirlo.

    Cuando realizamos una electroforesis bidimensional, el gel sacado del tubo con la muestra la ponemos arriba del gel en placa, en lugar de hacer los pocillo en el gel:

    Electroforesis bidimensional

    En placa:

    La electroforesis en placa es más habitual que en tubo. Puede ser:

    Vertical: se suele usar para proteínas.

    Horizontal: se suele usar para ácidos nucleicos.

    En ambas consta de dos placas de vidrio, una junto a otra con separadores que determinan el grosor del gel. En medio de las dos placas se pone la disolución del gel y un peine para dejar los huecos para los pocillos cuando polimerice el gel.

    En esta electroforesis todos los pocillos están sometidos a la misma electroforesis, en cambio en la electroforesis en tubo puede que cada vez que realicemos la electroforesis el gel polimerice de forma diferente.

    El tampón de electroforesis debe estar en contacto por encima y por debajo del gel.

    El aparato de electroforesis tiene un electrodo de platino conectado a la fuente de voltaje, cuando se aplica la diferencia de potencial se produce un campo eléctrico a lo largo del gel.

    Según la composición del gel:

    geles homogéneos o contínuos:

    La concentración de todos los componentes es la misma a lo largo de todo el gel.

    geles en gradiente:

    La concentración de acrilamida varia a lo largo de todo el gel, la concentración aumenta progresivamente desde la parte superior a la inferior de gel. El gradiente suele ser lineal y produce bandas muy finas. Tiene alto poder de resolución y alto poder de separación.

    Las proteínas se mueven a lo largo del gel hasta que encuentra una zona de concentración tal de acrilamida que no las deja pasar.

    La separación depende por tanto del tamaño de las moléculas a separar.

    El gradiente en el gel se forma por el sistema de los vasos comunicantes acoplado a un sistema de agitación.

    Ejemplo:

    En un vaso tenemos gel al 20% y en otro al 5% ambos están comunicados.

    Primero dejamos salir disolución del vaso con la concentración al 20% y conforme va saliendo abrimos la llave se separación de los dos vasos dejando pasar disolución al 5% al recipiente que contiene la disolución al 20%, de manera que se van mezclando ambas disoluciones y en la placa va bajando la concentración de forma gradual hasta llegar al final a una concentración casi del 5%:

    5% 20%

    llave agitación

    5%

    20%

    Lo dejamos polimerizar, debido a la diferencia de concentración en los extremos del gel, tendrán distinta consistencia; es más blando por arriba (5%) que por abajo (20%).

    Las proteínas con mayor densidad de carga se mueven más rápido pero si tienen mayor tamaño le costara más trabajo pasar que otra proteína con igual densidad de carga pero más pequeña.

    Normalmente se tiene en electroforesis durante 12 horas

    geles discontínuos:

    La composición del gel y la concentración de acrilamida es distinta en una parte del gel y en otra.

    Según el tratamiento de la muestra:

    no desnaturalizantes:

    La muestra no se somete a ningún tratamiento especial y las proteínas mantienen su conformación nativa.

    Se diluye con un tampón para que esté a pH adecuado. El tampón tiene además:

    sacarosa o glicerol para hacer más densa la muestra y que no flote en el gel (en el pocillo).

    Un colorante llamado Azul de bromofenol cuya función es:

    Poder ver la muestra en el gel.

    Permitir seguir el avance de la electroforesis y detenerla cuando interese. El bromofenol es la molécula que más rápido avanza en el gel.

    La cantidad de proteína que se carga en el pocillo depende de la concentración de gel y el método de tinción que empleamos al final.

    • Si teñimos con Coomassie hay que cargar una alta cantidad de proteína (1-2 gr).

    • Si teñimos con plata (es más sensible) hay que cargar 20-100 ngr.

    • Tinción de actividad: Las proteínas en este gel mantienen su conformación nativa, normalmente mantienen también su actividad y podemos detectarlas por teñido de actividad. Mantienen su estructura cuaternaria.

    Desnaturalizantes:

    La muestra se somete a tratamientos desnaturalizantes empleándose diferentes agentes como SDS, urea, DTT, calor, etc.

    Electroforesis no desnaturalizante en sistema contínuo.

    Las proteínas se mueven por su propia carga al pH de la electroforesis, normalmente se realiza a pH alcalino 8-9.

    La mayoría de las proteínas tienen un valor de pI entre 4-7 por tanto tienen carga negativa a pH 8-9. (pI<pH), por tanto se desplazan hacia el extremo positivo del electrodo (ánodo).

    Cátodo(-) Q(+)

    Ánodo (+)

    Importante:

    • saber la carga intrínseca de la proteína que queremos correr en el gel.

    • el pH al que se hace la electroforesis.

    • conocer la forma de la proteína,. Dependiendo de la forma pasará mejor o peor por los poros del gel.

    En el caso de las histonas o lisozimas que tienen un pI próximo a 10 ponemos los electrodos al revés. Aunque si usamos un pH 4 serán positivas

    ánodo(+) Q(-)

    Cátodo(-)

    Electroforesis no desnaturalizante en sistema discontínuo.

    También se llama "electroforesis disco" o sistema de Davis y Ornstein

    Tenemos un gel con dos partes:

    1º gel separador o de resolución:

    Tiene un pH=8.8.

    La concentración de acrilamida es alta (7-12).

    El Tamaño de poro es pequeño.

    Soporte restrictivo.

    Es el lugar de separación de las proteínas (igual que en sistema contínuo)

    2º gel concentrador o apilador:

    Tienen un pH= 6,5

    La concentración de acrilamida es baja, de 3-4%.

    Tiene un tamaño de poro grande.

    No es restrictivo.

    En este gel las proteínas se acumulan en una banda muy estrecha de modo que entran en el gel separador como una banda muy fina, lo que mejora la separación entre las distintas proteínas y permite aplicar mayor volumen de muestra en los pocillos obteniendo buena resolución.

    muestra

    CÁTODO (-)

    Gel concentrador

    Gel separador

    ÁNODO (+)

    Como tampón de recorrido (con la muestra) se usa el TRIS-glicina a pH = 8,3

    Es importante que se de un cambio de pH entre los dos geles:

    • En el gel concentrador hay iones cloruro que tienen carga negativa, son pequeños y se mueven muy rápido hacia el ánodo.

    Tendremos los iones cloruro por delante de nuestra muestra (movimiento rápido)

    • La glicina del tampón de recorrido se puede disociar y queda con carga negativa, de manera que entra en el gel concentrador y se dirige hacia el ánodo.

    El gel concentrador tiene un pH próximo al punto isoeléctrico de la glicina y solo una parte de la glicina tendrá dentro de este gel carga negativa, el resto tiene carga=0, la movilidad de la glicina será por tanto muy baja. Se moverá muy lentamente.

    Tendremos la glicina por detrás de nuestra muestra (movimiento más despacio).

    CÁTODO (-)

    glicerina

    Gel concentrador proteínas

    cloruros

    Gel separador

    ÁNODO (+)

    Entre el cloruro y la glicina queda una zona de poca densidad de iones que produce una zona con alta resistencia eléctrica.

    Al aumenta la resistencia en esa zona, aumenta la diferencia de potencial con lo que la glicina aunque su movimiento era menor, como el voltaje es mayor acaba viajando a igual velocidad que el cloruro, apilando a las proteínas en la zona de unión de los dos geles.

    Se forma una banda fina que entra a la misma vez en el gel separador.

    Banda fina

    de proteínas

    Electroforesis desnaturalizante con SDS.

    SDS es el dodecilsulfato sódico o Lauril sulfato sódico, es un detergente aniónico con carga negativa.

    Las proteínas unen 1,4 gr de SDS/gr proteína, lo que equivale a un SDS cada 2 aminoácidos.

    Antes de la electroforesis la proteína se hierve 3-4 minutos en tampón con 2% SDS y frecuentemente el tampón contiene además -mercapto etanol al 5% o ditiotreitol (DTT), que son agentes con grupos SH que rompen los puentes disulfuro de las proteínas. Cuando se usan estos agentes se dice que se usa "electroforesis en condiciones reductoras".

    Efecto del SDS:

    • Aporta carga negativa: Cada molécula de SDS tiene carga negativa. Aporta mucha carga negativa a la proteína y por tanto las proteínas se mueven más rápido hacia el extremo positivo.

    • Neutraliza las diferencias en la carga intrínseca de las proteínas: Hay proteínas con aminoácidos básicos y ácidos en diferente proporción, el SDS hace que todas las proteínas tenga carga negativa y sea despreciable esa diferencia de proporción.

    • Anula el efecto del pH.

    • Desnaturaliza proteínas. Las despliega de modo que todas las proteínas adoptan la misma forma de elipsoide, anula por tanto las diferencias de forma entre las proteínas.

    • Rompe las uniones no covalentes entre subunidades de proteínas. La mayoría son uniones por puentes disulfuro y como normalmente se hace el tratamiento en condiciones reductoras esos puentes disulfuro se rompen con lo que las subunidades se separan.

    Consecuencias del SDS:

    Los polipeptidos se separan únicamente en función de su tamaño, de modo que los más pequeños migran más rápido.

    Anula diferencias de carga (pI) y de forma

    Esto convierte a la electroforesis con SDS en un método muy usado y que permite calcular el Pm de las subunidades de las proteínas.

    Existe una relación lineal entre el log Pm y la distancia recorrida por la proteína.

    Cuanto menor Pm , más avanza la proteína.

    Log Pm

    X

    X Distancia recorrida

    Moléculas de Pm conocido

    En una de los pocillos cargamos moléculas de Pm conocido, hacemos la electroforesis y de cada banda, medimos la distancia recorrida y representamos frente al log Pm.

    Medimos la distancia recorrida por nuestra proteína y extrapolamos a la recta.

    La relación se mantiene dentro de un rango de concentración del gel:

    15% de acrilamida: 12-45 Kb

    10% acrilamida: 15-70 Kb

    5% acrilamida: 25-200 Kb

    En general hay una relación entre el Pm y la movilidad pero existen excepciones en las que el Pm no es muy exacto:

    • Las glicoproteínas:

    Contienen azúcares que no se unen SDS y dan un tamaño mayor del que tienen en realidad.

    Si se le quitan los azucares avanza más.

    • Las Histonas H1:

    Tienen mucha carga positiva (25% lisinas) aunque añadamos cargas negativas con el SDS queda demasiada carga positiva y se mueve más despacio. Su Pm real es de 21000 kd y en SDS da un valor de 31000 kd.

    Electroforesis desnaturalizante en urea.

    La urea es un compuesto que interfiere en las interacciones hidrofóbicas de las proteínas.

    A altas concentraciones de urea (6-8 M) prácticamente todas las proteínas se encuentran desnaturalizadas.

    El tampón en el que está la muestra también se trata con urea, al igual que los tampones de gel.

    Tiene dos aplicaciones:

    • Separación de proteínas peculiares: por ejemplo para la separación de las histonas, se tratan con urea y en medio ácido. La urea no aporta carga a la proteína.

    • Estudios del análisis conformacional de la proteína:

    Se usan geles con gradiente transversales de urea. No se usan calles en el gel. La muestra se coloca a lo ancho del gel.

    Las proteínas al empezar a migrar se encuentran con diferentes concentraciones de urea. A altas concentraciones la proteína está desnaturalizada, tiene un mayor tamaño, por tanto avanza menos en el gel y a bajas concentraciones la proteína no estará desnaturalizada y tendrá un menor tamaño, avanza más en el gel.

    En el gel obtenemos una línea continua con diferente movilidad a lo ancho del gel.

    Migración de las proteínas proteínas desnaturalizadas.

    0M 8M

    [urea]

    Este tipo de gel se usa para estudios de los procesos de desnaturalización y renaturalización. También para observar la presencia de los estados intermediarios en el plegamento de las proteínas.

    En estudios de renaturalización se trata primero con urea y observamos a que concentración obtenemos la proteína plegada.

    Podemos encontrarnos varios escalones con la aparición de estructuras intermedias en el plegamiento de las proteínas.

    ISOELECTROENFOQUE.

    Es un tipo especial de electroforesis en el que los componentes anfóteros ( componentes que tienen cargas negativas y positivas, como las proteínas) se separan según su punto isoelectrico cuando se les somete a un gradiente continuo de pH.

    pI = pH cuando Q=0.

    El gradiente de pH se consigue añadiendo a la disolución de polimerización una mezcla de anfolitos.

    Los anfolitos son compuestos anfóteros de pequeño tamaño que tienen varios grupos ionizables, normalmente tienen grupos COO- y NH3 que tienen alta capacidad tamponadora en las proximidades de su punto isoeléctrico.

    Se añaden anfolitos de diferente punto isoeléctrico.

    Nada más polimerizar, el gel con los anfolitos es homogéneo, tenemos el mismo pH en todo el gel.

    Se somete a un campo eléctrico antes de la aplicación de la muestra de manera que los anfolitos dependiendo de su carga se mueven hacia el cátodo o el ánodo. El campo eléctrico hace que el gel deje de ser homogéneo y se hace más ácido en las proximidades del ánodo y más alcalino en las proximidades del cátodo.

    Los anfolitos se mueven hasta que llega un momento en que llegan a una zona de pH en la que su carga se hace nula (pH=pI) y dejarán de moverse.

    Obtenemos un gradiente de pH y de anfolitos.

    Ahora aplicamos la muestra:

    Las proteínas empezarán a moverse a lo largo del gel hasta que pH=pI, en esa zona como la carga neta de la proteína será 0, dejará de moverse.

    Por tanto da igual donde pongamos la muestra, aunque normalmente la ponemos a pH básico (tiene carga negativa).

    Permite separar proteínas según su pI.

    Se utilizan principalmente con concentraciones de acrilamida entre 4-5% que tengan poco efecto tamiz y que dejen que las proteínas se muevan libremente.

    En ocasiones se añaden detergentes siempre que no sean iónicos ( no aporten carga).

    Utilidad:

    Conocer pI de la proteína.

    conocer proteínas que aparecen juntas en las electroforesis convencionales ya que es capaz de separar varias formas moleculares de un misma proteína: proteína glicosilada y fosforiladas.

    Primer paso de una electroforesis bidimensional.

    Se pueden llegar a separar proteínas que se diferencian en 0,01 unidades de pH.

    ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL.

    Es la sucesión de dos electroforesis diferentes o en diferentes condiciones, sobre la misma muestra. Si no se dice nada:

    Primera electroforesis es un Isoelectroenfoque normalmente en tubo.

    Segunda electroforesis es un SDS-PAGE.

    La 1º electroforesis se hace en tubo, se saca el gel y se coloca en tampón de PAGE-SDS.

    Se usan como criterio de pureza, si nos da una sola mancha es que está compuesta por una sola proteína.

    METODOS DE VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN EL GEL.

  • Azul brillante de commassie:

  • se prepara a 0,1% en una mezcla de metanol, acético y agua, durante más o menos una hora y se destiñe con etanol, acético y agua.

    Tinción con Azul = cuantitatica; mayor tinción = mayor concentración.

  • Sales de plata:

  • En la zona donde hay proteína se produce la reducción de la plata Ag+ a Agº y se deposita la Ag donde hay proteína. No se sabe el mecanismo por el que las proteínas reducen la Ag+ a Agº aunque se piensa que están implicadas las cadenas laterales de la Cys, Lys y Met. Esta tinción es más sensible, detecta nanogramos de proteínas pero no es cuantitativa.

    Tinción con sales de Ag = no cuantitativa; a veces proteínas en baja concentración dan mayor tinción que otras con mayor concentración.

  • Electrotransferencia a papel: Western blotting.

  • El gel se pone en contacto con una membrana de celulosa y se prensa con papeles (servilletas).

    Se realiza la electroforesis de forma lateral (izda a drch). Todas las proteínas se transfieren al papel.

    El papel lo bloqueamos con albúmina de suero bovino (BSA) para que la zona donde no hay proteína se llene de otra proteínas

    Ponemos anticuerpos contra la proteína a visualizar, se lava para eliminar el exceso de anticuerpos y se pone en contacto con anticuerpos secundarios que reconocen al anticuerpo primario y que están marcados con una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa).

    Ponemos la disolución de teñido que lleva el sustrato de la enzima, se produce la reacción enzimática y se observa color donde aparece el producto de la reacción (coloreado).

    ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

    Es un método habitual para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN o ARN.

    Lo normal es que en los tampones, los ácidos nucleicos tengan carga negativa. (una carga negativa por nucleótido), debido al grupo fosfato.

    La relación carga/tamaño no varia de una molécula a otra, es independiente del tamaño que tengan.

    La densidad de carga permite que en los geles restrictivos se separen según su tamaño.

    Se llevan a cabo en geles de agarosa, poliacrilamida o en mezclas de ambos.

    Lo normal son geles de poliacrilamida para fragmentos de ADN de pequeño tamaño y para moléculas de ARN. Son parecidos a los que se usan para proteínas.

    Para moléculas de ADN más grandes se usan geles de agar.

    Para ADN< 50 kb: se usa un campo eléctrico constante no solo en intensidad sino también en dirección.

    Para ADN> 50 kb: se usa una electroforesis de campo pulsante. Se cambia momentáneamente la intensidad y la dirección del campo eléctrico.

    La cantidad de ADN que se añade a los pocillos depende del tamaño y de la variedad de moléculas de ADN que tengamos en la muestra.

    Lo normal es de 0,5-1 g para un solo tipo de ADN.

    Si tenemos varios fragmentos de diferentes tamaños se puede cargar más.

    La cantidad mínima que se va a cargar depende del sistema para detectar los ácidos nucleicos.

    • Bromuro de etidio: > 5ng por pocillo.

    • Compuestos fluorescentes (más sensible): 10 pg.

    • Radiactividad: concentraciones mucho más bajas.

    TEMA 5: TÉCNICAS ISOTÓPICAS.

    INTRODUCCIÓN.

    Su utilidad se debe a que los elementos radioactivos al degradarse generan una serie de emisiones fácilmente detectables.

    Los elementos radioactivos son escasos en la naturaleza pero se pueden sintetizar en grandes cantidades en reactores nucleares.

    Los núcleos atómicos constan de protones y neutrones.

    Las especies nucleares se representan con:

    símbolo de elemento.

    subíndice Z representante del número atómico o número de protones. superíndice A representante del número másico o número de protones y neutrones.

    Para especies neutras A=Z.

    ISÓTOPOS.

    Los elementos se pueden encontrar como diferentes especies nucleares que se denominan isótopos.

    Los isótopos de un mismo elemento tendrán el mismo número atómico y ocuparán la misma posición en el sistema periódico, tendrán la misma reactividad química.

    Los isótopos se diferencian unos de otros en el número másico. En realidad se diferencian en el número de neutrones. Esto hace que puedan tener diferencias en sus propiedades físicas.

    Ejemplo: H H H

    Igual número atómico y diferente número másico.

    Los elementos radioactivos se suelen encontrar en la naturaleza como una mezcla de diferentes isótopos.

    El carbono por ejemplo tiene 7 isótopos diferentes el más importante es el C12 que se encuentran en el 98% de la naturaleza.

    Tipos de isótopos:

    Los isótopos los podemos clasificar en:

    Isótopos estables:

    Son aquellos con núcleo estable. No tienen tendencia a desintegrarse.

    Para los elementos con números atómico bajo, los isótopos estables son aquellos con el mismo número de protones que de protones.

    Dentro de los isótopos estables aquellos con número de neutrones mayor al de la especie más abundante se llaman isótopos pesados, por ejemplo el Deuterio es el isótopo pesado del H.

    Isótopos inestables:

    Aquellos cuya composición nuclear no está estabilizada; o le sobran protones, o le sobran neutrones o le sobran de los dos.

    Para alcanzar la situación estable se desintegran emitiendo lo que les sobra. Sus núcleos pueden cambiar de número atómico o número másico o los dos.

    Esa emisión se conoce como radioactividad o desintegración radioactiva por eso se les llama isótopos radioactivos o radioisótopos.

    TIPOS DE DESINTEGRACIONES RADIOACTIVAS.

    EMISIÓN 

    Emisión de partículas .

    Es frecuente en radioisótopos con alto número atómico, lo que hace que tenga poca importancia en bioquímica (es poco abundante en la especie humana).

    Una partícula  es un núcleo de helio. Contiene 2 protones y 2 neutrones.

    La emisión de una partícula  hace que el radioisótopo baje en dos unidades su número atómico y en 4 su número másico.

    La especie nuclear cambia a una especie nuclear diferente: por ejemplo el radio pasaría a Radón, deja de ser radioactivo.

    EMISIÓN .

    Es la emisión más frecuente. Es la emisión de partículas .

    Corresponde a una partícula que tiene la masa del electrón y que puede tener carga negativa o positiva.

    Si la emisión tiene carga negativa se llama emisión - y si tiene carga positiva se llama emisión +.

    Los más importantes son las emisiones -. Se producen cuando en el núcleo un neutrón se transforma en un protón emitiendo una partícula -.

    Una emisión - hace que el número atómico suba una unidad y el número másico se quede como estaba.

    EMISIÓN .

    En muchos casos cuando un elemento radioactivo emite emisiones  o , la especie nuclear resultante se encuentra en un estado nuclear con exceso de energía.

    Para pasar a un estado estable, libera esa energía como emisiones  o rayos .

    Son emisiones electromagnéticas, no tienen carga ni masa. Suelen tener una energía elevada y un alto poder de penetrabilidad.

    La emisión  no produce cambios ni en el número atómico ni en el número másico. Lo que pasa es que antes de la emisión  se da la radiación  o  que sí produce el cambio en el número atómico o en número másico.

    PARÁMETROS MÁS USADOS EN BIOLOGÍA.

    Cinética de la desintegración radioactiva:

    La desintegración radioactiva es un proceso espontáneo que tiene lugar a una velocidad definida que es característica de cada radioisótopo.

    La velocidad de desintegración es directamente proporcional al número de isótopos radioactivos, multiplicado por la constante  que es la constante de desintegración.

     es característica para cada radioisótopo, da una idea de la mayor o menor tendencia que tiene el isótopo a desintegrarse.

    -dN = N : integramos de 0 a t y obtenemos: N= Noe.

    dt

    La desintegración ocurre por tanto siguiendo una cinética exponencial negativa.

    Vida media o periodo de desintegración:

    Un parámetro que se usa mucho es la vida media o periodo de desintegración que es el tiempo que tiene que transcurrir para que el número de radioisotopos baje a la mitad.

    La vida media es inversamente proporcional a la constante de desintegración. Isotipos con una alta constante de desintegración, tienen una vida media muy corta.

    El periodo de desintegración es importante por que nos dice su un isótopo es útil para usar en laboratorios o no. Radioisotopos con una vida media baja son poco útiles en el laboratorio, es lo que ocurre con I150 (2 min) o con N13 (10 min). El tritio es el más usado, dura unos 12 años.

    Para autoradiografía es mejor tener una vida media baja y emisiones más altas.

    Actividad radioactiva.

    La Actividad de una muestra radioactiva es la velocidad de desintegración de esa muestra.

    La actividad absoluta se puede expresar de diferente forma:

    En unidades del sistema internacional: Becquerel o desintegración por segundo (dps).

    En Curios, es el número de desintegraciones por segundo de un gramo de radio, vale 3,7*10¹º dps, como este valor resulta un número demasiado alto es hablamos de milicurios o microcurios.

    Una muestra con alta actividad nos puede indicar que:

    Su Número de isotipo radioactivo es alto.

    Su tendencia a desintegrarse es alta.

    La medida de la actividad absoluta nos da idea de el número de radioisotopos presentes en la muestra.

    Para medirla contamos las desintegraciones conforme se van produciendo, por eso se habla de "contaje".

    Si el método de contaje tiene una eficacia del 100%, el contaje es igual al número de desintegraciones. Cpm=dpm.

    Lo que ocurre normalmente es que no es del 100% y entonces obtenemos valores de actividad relativos.

    Si conocemos la eficacia de contaje del aparato, podemos a partir de la actividad relativa conocer el valor de la actividad absoluta.

    Actividad específica.

    Es la actividad por unidad de masa; dpm/g,cpm/g, Ci/mol.etc.

    MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA RADIOACTIVIDAD.

    Métodos basado en la ionización de gases.

    Entre estos métodos se encuentra el detector Geiger-Müller.

    Se basan en que cuando una partícula cargada atraviesa un gas, su campo electrostático es capaz de ionizar a los átomos que se encuentren los suficientemente próximos.

    Detector de Geiger-Müller:

    El detector de Geiger-Müller consiste en una cámara que contiene un gas noble como Argón o Helio y un par de electrodos entre los que se establece una diferencia de potencial.

    Las emisiones radioactivas penetran por una ventana y producen ionización del gas de manera que los iones que se producen irán al electrodo del signo opuesto.

    Se establece una corriente eléctrica que es detectada por una unidad de medida.

    Estos detectores se usan para encontrar escapes de radiaciones, suelen ser portátiles y llevan una aguja que indica si hay radioactividad pero no nos dice la naturaleza de la radiación.

    El detector de Geiger-Müller solo son válidos para emisiones  y . No para .

    Métodos basados en la excitación.

    Los dispositivos se llaman contadores de centelleo.

    Es necesario el uso de un compuesto que tenga la propiedad de emitir luz cuando se desexcita.

    Las emisiones radioactivas producen la excitación de ese compuesto que cuando se desexcita emite luz. Esta luz se transforma en una señal eléctrica medible.

    La magnitud de esa señal será proporcional al proceso radioactivo.

    Dos tipos de contadores de centelleo basados en la excitación:

    Sólidos o externos:

    La muestra se coloca muy próxima a cristales de un material fluorescente y se emplea para radiaciones , por lo que se les denomina contadores .

    Líquidos:

    La muestra se mezcla con un disolvente en el que hay un compuesto que pasa a un estado excitado. La mayoría de compuestos orgánicos cuando se desexcitan emiten luz de una longitud de onda baja y difícil de detectar. Esto se solventa añadiendo compuestos fluorescentes y se da un proceso de transferencia de energía.

    Se usan dos fluorescentes:

    PPO: coge energía del compuesto D cuando este se desexcita y PPO pasa a un estado excitado.

    POPOP, coge energía de PPO.

    Lo compuestos fluorescentes se mezclan en el disolvente.

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