Determinación de la presencia de estreptococos y sulfito

Microbiología. Estreptococos fecales del agua. Sulfito reductor # Clostridium sulfito-reductors. Streptococs fecals

  • Enviado por: Noah
  • Idioma: catalán
  • País: España España
  • 5 páginas
publicidad

DATA D´INICI : 20 / 3 / 2003

DATA DE FINALITZACIÓ : 1 / 4 / 2003

TÍTOL : DETERMINACIÓ PRESSUMTIVA I CONFIRMATIVA DE ESTREPTOCOCS FECALS. I DETERMINACIÓ CONFIRMATIVA DE CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTORS.

OBJECTIU : Determinar pressumtivament i confirmar l´existència de estreptococs fecals de l´aigua d´un reactor,mitjançant la taula del NMP.

Determinar confirmativament els clostridium sulfit reductors d´un aigua d´un reactor.

FONAMENT TEÒRIC :

Potables

Sanitàriament permesa

clostridium sulfito-reductors

absència / 20/ mL

2 / 20 mL

streptococs fecals

absència / 20/ mL

10 / 100 mL

Solució tamponada estèril : Permet el creixement del microorganisme però no permet que es reprodueixi.

Dilució : passar de major concentració a menor mitjançant transferències de volum.

Medi d´enriquiment : medi on hi ha microorganismes que provoca la duplicació d´aquest concentrant-los encara , que sinó hi ha microorganismes no enriqueix1.5

Medi selectiu :afavoreix el creixement d´uns microorganismes determinats i inhibeix el creixement dels altres.

Estreptococs fecals :cocs gram positius anaerobis facultatius, fermenten sucres en producció d´àcid

Clostridium sulfito reductors :anaerobis estrictes.

PROCEDIMENT :

Preparar dilucions:

  • Agafar els tubs amb la solució tamponada estèril

  • Obrir la mostra de l´aigua del reactor, flamejant la boca del tap

  • Introduir 1mL de la mostra al primer tub

  • Flamejar el tub i tapar

  • Homogeneïtzar el tub (dilució 10-1)

  • Canviar la punta de la micropipeta

  • Agafar 1mL de la dilució -1

  • Introduir-la en un altre tub amb solució tamponada estéril.

  • Flamejar el tub i tapar

  • Homogeneïtzar el tub (dilució 10-2)

  • Canviar la punta de la micropipeta

  • Agafar 1mL de la dilució -2

  • Així fins arribar a la dilució desitjada, en aquest cas 10-5

Prova presumptiva d´estreptococs (medi rothe simple) :

  • Obrir el tub amb major dilució ( 10-5)

  • Flamejar el tub i el tap a la flama del bec bunsen

  • Introduir la micropipeta i pipetejar 1mL

  • Agafar el tub amb el medi rothe i obrir-lo flamejant el tap i el tub

  • Introduir el mil·lilitre de mostra

  • Homogeneïtzar per rotació suau

  • Repetir la sembra per triplicat de cada dilució

  • Incubar a 37ºC durant 48h com a màxim

  • Lectura de tubs positius

  • Consulta a la taula del NMP

Prova presumptiva d´estreptococs fecals (medi rothe doble concentrat) :

  • El procediment és el mateix però el medi de cultiu està preparat doblement concentrat

  • Es repeteix la sembra per triplicat per a cadascuna de les dilucions con al anterior

Prova confirmativa d´estreptococs fecals (medi EVA) :

  • Agafar la dilució més baixa que hagi donat positiva a la prova anterior

  • flamejant el tap i el tub

  • Introduir la micropipeta i pipetejar 0.5mL

  • Agafar el tub amb el medi EVA obrir-lo flamejant el tap i el tub

  • Introduir la mostra

  • Homogeneïtzar per rotació suau

  • Repetir la sembra per triplicat de cada dilució

  • Incubar a 37ºC durant 48h com a màxim

  • Lectura de tubs positius

Prova de la determinació confirmativa de Clostridium sulfito-reductors (medi SPS):

  • Començar per la dilució inicial (10-5)

  • Flamejar el tub i el tap a la flama del bec bunsen

  • Introduir la micropipeta i pipetejar 1mL de la dilució

  • Agafar el tub amb el medi SPS i obrir-lo flamejant el tap i el tub

  • Introduir el mil·lilitre de mostra sembrant-lo des de la part inferior fins a la part superior del medi expulsant-lo molt poc a poc

  • Homogeneïtzar per rotació molt suaument

  • Deixar solidificar

  • Fer les sembres per duplicat

  • Anar a la campana i posar 5mL de vaselina estèril.

  • Incubar a 46ºC durant 24h

  • Observar els tubs

  • Fer la lectura

MATERIAL :

  • Bec bunsen

  • Homogeneïtzador

  • Tubs d´assaig grans i petits

  • Gradeta

  • Vas de precipitats 500mL

  • Proveta 100mL

  • Proveta 10mL

  • Espàtula

  • Vareta de vidre

  • Trespeus

  • Reixeta

  • Encenedor

  • Micropipeta

  • Puntes de micropipeta estèrils

  • Pipeta pasteur

  • Campana estèril

REACTIUS :

  • Solució tamponada estèril

  • Potassi hidrogen fosfat

KH2PO4

p.m:136.09 g/mol

puresa:98%

  • Sulfat de magnesi

MgSO4

p.m:246.48g

puresa:100%

  • Medi rothe simple i doble concentrat ( R22 , S45 )

  • Medi àcida i violeta lila (EVA) (R22 , S45)

  • SPS

  • Aigua destil·lada

  • Vaselina estèril

FRASES DE SEGURETAT:

Medi Rothe i EVA:

  • R22 nociu per ingestió

  • S45 en cas d´accident o malestar anar immediatament al metge ( si es possible mostrar etiqueta)

DADES EXPERIMENTALS :

Pesos dels medis

MEDIS DE CULTIU

PES REAL EN GRAMS

Rothe simple concentrat

8.661

Medi àcida i violeta lila

5.390

SPS

1.500

Resultats de la lectura dels tubs ( reactor ):

10

1

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Rothe

3

3

3

3

3

3

1

EVA

3

3

3

3

3

1

1

SPS

------

------

incomptables

1900ufc

3500ufc

No creixement

50000ufc

CÀLCULS I RESULTATS :

Rothe simple

34.7g

250mL x --------------- = 8.675 g

1000mL

EVA

35.8g

150mL x --------------- = 5.37 g

1000mL

- Taula NMP (311) 75 / 0.01 = 7500ufc

Rothe simple

40 g

200mL x --------------- = 8.00 g

1000mL

Dilució 10-2

5 + 33 / 2 = 19 colònies ; 19*100/1 = 1900ufc

Dilució 10-3

7 + 2 / 2 = 3.5 colònies ; 3.5*1000/1 = 350ufc

Dilució 10-4

No es detecta creixement

Dilució 10-5

1 + 0 / 2 = 0.5 colònies ; 0.5*100000/1 = 50000ufc

Dilució 10-2 + Dilució 10-3 : 1900 + 3500 / 2 = 2700ufc clostridium

OBSERVACIONS I CONCLUSIONS :

  • La prova en medi EVA només és fa per a les dilucions que en el medi rothe hagin donat positives.

  • Per fer les sembres si se sembra de menys a mes concentrat no cal canviar la punta de la micropipeta.

  • La sembra en el medi rothe és per a la determinació presumptiva d´estreptococs fecals.

  • A mesura que augmentava la dilució la contaminació era menor.

  • La lectura dels tubs era positiva degut al sediment verdós i la turbidesa del medi

  • Suposo que aquest aigua té una gran contaminació ja que en totes les dilucions ha sortit almenys un tub positiu.

  • Crec que hauríem d´haver elevat el grau de dilució degut a la elevada contaminació del reactor.

  • La sembra en el medi EVA és per a la determinació confirmativa d´estreptococs fecals.

  • Només es sembren els tubs que han donat positiu a l´anterior prova.

  • En els tubs positius es forma turbidesa i sediment blau

  • La majoria de tubs han donat positiu en la confirmativa i el nombre de UFC d´estreptococs fecals és de 7500/mL

  • Aquest aigua té una elevada contaminació fecal.

ANNEX :

Medi Rothe ( 34,7 g per litre, esterilitzar 15 minuts a 121ºC )

Composició g/L

Sodio azida 0.2

D(+) Glucosa 7.5

Extracte de carn 4.5

Peptona 15.0

Clorur sòdic 7.5

Medi EVA ( 35.8 g per litre, esterilitzar 15 minuts a 121ºC)

Composició g/L

Sodio azida 0.4

D(+) Glucosa 5.0

Violeta de etilo 0.0008

Mescla de Peptona 15.0

Clorur sòdic 5.0

Potasio dihidrogeno fosfato 2.7

Medi SPS ( 40 g per litre, esterilitzar 15 minuts a 121ºC)

Composició g/L

Sulfit de sodi 0.5

Sulfat de polimixina 0.01

Sulfadiazina 0.12

Peptona de caseina 15.0

Extracte de llevadura 10.0

Citrat de ferro 0.5

Agar bacteriològic 13.0