UNIDAD DIDÁCTICA 4.

TINCIONES HEMATOLÓGICAS

La realización de extensiones y tinciones es práctica habitual en el laboratorio. Pese a no realizarse a todas las muestras, al no ser considerado procedimiento de rutina, es necesario en aquellos casos en los que se detecte mediante análisis previos alguna alteración.

La correcta realización, así como una buena interpretación de lo observado, permite en muchos casos el diagnóstico de hematopatías.

1. INTRODUCCIÓN.

Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visual izadas microscópicamente con mayor facilidad.

2. TIPOS DE TINCIONES.

Las tinciones hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios:

• Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales.

• Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el diagnóstico hematológico, se dividen en tinciones tradicionales y especiales.

2.1. TINCIONES VITALES Y NO VITALES.

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno.

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol.

2.2. TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES.

Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la anilina (tinciones tradicionales o clásicas). Estos colorantes se reúnen en 4 grupos:

• Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.

• Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.

• Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno.

• Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante. Uno de ellos es el Sudán III empleado para teñir las grasas.

También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas.

El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó.

Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante ácido (eosina) y de colorantes básicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilación oxidatiya (colorantes ­tipo azur).

Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que más frecuentemente se emplean en el diag­nóstico hematológico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinación con la de May-Grünwald).

También hay tinciones panópticas rápidas que producen una coloración fácil y rápida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales sólo se usan en circunstancias específicas. Son de dos clases:

• Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un color característico. Los fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro.

• Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, más o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos.

Sirven para reconocer células leucocitarias (normales o anómalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas células leucocitarias inmaduras a la línea granulocítica o a la monocítica.

3. DENOMINACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS.

Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las siguientes formas:

• Estructuras acidófllas u oxifilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza ácida.

Si el colorante ácido que captan es la eosina, se dice que son eosinófilas. Con las tinciones tradicionales adquieren un color rosado.

• Estructuras basófllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina.

Con las tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófllas.

4. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUÍNEOS.

Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a:

• Un pH bajo del colorante.

• Un tiempo de coloración insuficiente.

• Un lavado excesivamente prolongado.

• Si la tinción es demasiado azul, posiblemente, esto esté causado por: un grosor excesivo de la extensión, o un pH alto del colorante.

• Una coloración excesivamente prolongada.

• Un lavado insuficiente.

Si tras la tinción aparecen artefactos o/y precipitados en la extensión, probablemente esto se deba a:

• Un empleo de portaobjetos sucios.

• Una falta de filtración del colorante.

• Una coloración excesivamente prolongada.

• Un secado del colorante durante la tinción.

• Un lavado insuficiente.

Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teñidores automáticos de las extensiones sanguíneas. Actualmente, no suelen emplearse en la práctica clínica.

5. TINCIÓN GIEMSA.

Las tinciones hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, azur B y azur C) como colorantes básicos, combinándolos con la eosina como colorante ácido.

De este modo, obtenemos una tinción diferencial, es decir, una tinción que es capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares según se tiñan éstas con el colorante ácido, con el básico o con la mezcla de ambos.

Según la proporción de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante tendremos distintos méto­dos de tinción. Entre ellos, los más conocidos son el método de Giemsa, el de Wright, el de Leishman y el pan óptico de Pappenheim.

Metódica

Es un extracto de las técnicas de tinción hematológicas de la casa Panreac.

Fundamento

Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa.

Material necesario

• Microscopio óptico.

• Portas bien limpios.

• Cristalizador.

• Puentes de tinción.

• Pipetas Pasteur con chupete.

• Frascos lavadores.

• Tubos de ensayo.

Reactivos

• Colorante en solución según Giemsa de Panreac.

• Solución tampón pH 7,2 de Panreac.

• Metanol.

• Aceite de inmersión.

Muestra

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. El anticoagulante de elección es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar preparaciones defectuosas.

Técnica

• Preparamos un frotis sanguíneo según la técnica descrita con anterioridad.

• Colocamos el frotis sobre el puente de tinción, en el cristalizador y en posición horizontal.

• Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis.

• Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2. Es importante realizar esta dilución en el momento de la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para otro día.

• Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis con la dilución de colorante, dejándolo actuar durante 25 minutos.

• Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical.

Lectura de resultados

Una vez seca la tinción, echamos una gota de aceite de inmersión y examinamos al microscopio óptico con el objetivo de 100 x.

Los eritrocitos se tiñen de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta.

Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de un color violeta rojizo.

6. TINCIÓN DE WRIGHT.

Metódica

Extracto de las técnicas de tinción hematológica de la casa Panreac.

Fundamento

El colorante utilizado es una solución de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10 al 25%) junto con otros derivados del alcohol metílico.

Dada la presencia de metanol en la composición del colorante, no es necesario un paso previo de fijación antes de la coloración.

Sólo si se van a guardar las extensiones sin teñir de un día para otro precederemos a su fijación para evitar el deterioro del frotis.

Material necesario

• Microscopio óptico.

• Cristalizador.

• Puentes de tinción.

• Pipetas Pasteur con chupete.

• Frasco lavador.

• Guantes.

• Tubos de ensayo.

Reactivos

• Solución de eosina-azul de metileno según Wright.

• Solución tampón pH 7,2.

• Aceite de inmersión.

Muestra

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes más adecuados son la heparina y el EDTA.

Técnica

• Realizar un frotis sanguíneo muy fino. Dejar secar al aire.

• Sobre la extensión colocada horizontalmente en el puente de tinción verter 1 ml de eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.

• Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solución tampón pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilución la extensión. Teñimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del grifo. Volvemos a lavar con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.

Lectura de resultados

Depositamos una gota de aceite de inmersión y observamos con el objetivo de 100 x.

Las células se observan coloreadas de la misma manera que con la tinción de Giemsa.

7. TINCIÓN PANÓPTICO RÁPIDO.

Metódica

Extracto de la técnica Panóptico rápido de la casa QCA.

Fundamento

Este método de tinción diferencial es un sistema que aúna la policromía y la calidad que proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecución (15 segundos solamente).

Frente a las técnicas de tinción descritas anteriormente, donde el colorante se extendía sobre el frotis, ésta presenta la peculiaridad de ser un método de inmersión, donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado.

Material necesario

• Cubetas de Wertheim o similares.

• Cestillo para portas.

• Frasco lavador.

Reactivos

• Solución nº 1: Solución alcohólica de triarilmetano.

• Solución nº 2: Solución tamponada de xanteno.

• Solución nº 3: Solución tamponada de tiazina.

• Agua destilada.

Muestra

Frotis sanguíneo preparado recientemente y que se ha dejado secar al aire.

Técnica

En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solución nº 1, nº 2 y nº 3.

• Colocamos los frotis en el cestillo para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solución nº 1 durante 1 segundo. Repetimos la inmersión cuatro veces (en total 5 segundos). Dejamos escurrir.

• Sumergimos a continuación otras cinco veces, cada una de un segundo de duración, en la cubeta con la solución nº 2. Dejamos escurrir.

• Finalmente, sumergimos otras cinco veces de un segundo cada una en la cubeta con la solución nº 3. Lavamos con agua destilada y dejamos secar.

Lectura de resultados

Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100 x.

Las coloraciones obtenidas en las células sanguíneas son similares a las de la tinción de Wright y Giemsa. ­Sin embargo, podemos variar la intensidad de la tinción modificando el número de inmersiones en los colorantes nº 2 y nº 3, según se desee destacar las tonalidades rosas o las azules.

Notas sobre el método

• Las cubetas con las soluciones colorantes, especialmente la del nº 1, deberán guardarse siempre bien tapadas, con el fin de evitar una evaporación excesiva que podría inducir a desviaciones de color respecto a las tinciones habituales.

• Antes de agotar el contenido de una cubeta, debemos ir adicionando una nueva cantidad de solución colo­rante para mantener, día a día, un nivel apropiado del mismo. De vez en cuando se debe renovar todo el contenido de la cubeta.

• En aquellos laboratorios con pequeño número de fórmulas hemáticas, las cubetas de Wertheim pueden ser sustituidas ventajosamente por pequeños frascos de cristal con tapón a rosca.

LDC- Hematologia U.D. 4

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