TERAPIA GÉNICA APLICADA AL SÍNDROME DE INMUNODEFICIENCIA COMBINADA SEVERA POR DÉFICIT DE ADA

La terapia génica se ha establecido como un campo emergente de la medicina; el número de ensayos clínicos ha ido aumentando desde que se aprobó el primer ensayo de terapia génica para el tratamiento de la deficiencia de ADA (1989).

El Síndrome de Inmunodeficiencia Combinada Severa por déficit de ADA ha sido la diana de la terapia génica por varias razones. Primero, la deficiencia de ADA es la enfermedad congénita de inmunodeficiencia más estudiada, porque la secuencia de cDNA y del genoma que codifica para ADA fueron tempranamente identificadas (1983); además la función del enzima está claramente comprendida. Segundo, no es necesaria una regulación muy estricta de la expresión del enzima para establecer una función inmune en el paciente sin tener efectos adversos; con el 10% de los niveles normales de ADA ya existe una función inmunitaria correcta y por el otro lado, niveles 50 veces por encima de lo normal tan sólo dan una ligera anemia hemolítica. Tercero, las células genéticamente corregidas han demostrado tener una ventaja selectiva en cuanto a crecimiento frente a las células no modificadas.

Antes de realizar un estudio sobre terapia génica el protocolo clínico debe ser revisado y aprobado por la FDA (Food and Drug Administration), y si se diseña un protocolo nuevo e innovador, por la RAC (Recombinant DNA Advisory Commitee). Para llevarse a cabo un ensayo clínico de terapia génica se requieren esfuerzos multidisciplinarios.

La evolución histórica de la investigación a nivel molecular sobre el déficit de ADA podría resumirse en las siguientes fechas:

1983 obtención del cDNA del enzima ADA.

1986-87 el cDNA se incluye en células enfermas in vitro, utilizando como vector un retrovirus.

1989 se aprueba el primer ensayo clínico de terapia génica humana para el tratamiento del déficit de ADA, aplicado a dos pacientes.

1990-91 se transfieren células genéticamente modificadas a ratones y primates

1990 primer estudio de terapia génica en humanos, realizada por el NIH

1990-00 se han estudiado unos 10 pacientes en ensayos clínicos, por diferentes instituciones de diferentes países del mundo.

DIFERENTES EJEMPLOS DE ENSAYOS CLÍNICOS

1. Ensayo NIH (septiembre 1990)

En este estudio fueron incluidos dos pacientes, a la edad de 4 años y de 9 años. Antes de ser introducidos en el ensayo estos ninños habían demostrado tener una respuesta incompleta al tratamiento con reemplazamiento enzimático y no tenían un donante de médula ósea compatible.

Se les realizó una extracción de sangre aislándose por aféresis los linfocitos T periféricos; los motivos de elegir esta población celular fueron dos: primero,estudios previos en primates con stem cell hematopoyética habían dado pobres resultados, y segundo, las células supervivientes de un paciente curado por transplante de médula ósea eran los linfocitos T.

Estos linfocitos fueron estimulados con IL-2 y anticuerpos anti-CD3 durante 72h, y transducidos con vector retroviral LASN (que contiene el gen ADA), cultivados durante 9-12 días y posteriormente reinyectados. Los pacientes recibieron un total de 10-12 infusiones durante dos años. Como resultado de esto, la función inmune de

ambos llegó a niveles mucho más altos que durante el periodo de tratamiento con únicamente sustitución enzimática, y se mantuvieron estables hasta dos años tras el último tratamiento. Ambos pacientes tuvieron una respuesta variable a los antígenos, mantuvieron un crecimiento normal de linfocitos T y tuvieron el mismo tipo de infecciones que los demás niños de su edad.

La toxicidad consecuencia del ensayo (protocolo y reintroducción del retrovirus) fue nula. Ambos pacientes mantuvieron durante el periodo de estudio el tratamiento de reemplazamiento enzimático con PEG-ADA (Polyethylene Glycol-ADA).

2. Ensayo italiano

Dos pacientes de 2 años fueron estudiados en condiciones similares a los anteriores. Ambos tenían respuesta incompleta al tratamiento con reemplazamiento enzimático y no eran candidatos al transplante de médula ósea.

La terapia génica ex vivo tenía una principal diferencia con el estudio anterior: los linfocitos T periféricos y los progenitores de médula ósea fueron separadamente transferidos, cuyos vectores podían ser diferenciados entre sí. Recibieron linfocitos T y progenitores durante 10 y 24 meses.

La respuesta fue positiva al principio. Al cabo de 6-12 meses las células T periféricas fueron disminuyendo. Concomitantemente la función inmunitaria fue mantenida gracias a la producción de ADA por linfocitos, granulocitos y eritrocitos.

En ambos pacientes la función fue mantenida por un año tras el último tratamiento, lo que les permitió mantener una vida más o menos normal durante todo este tiempo. Ambos pacientes fueron tratados con terapia de reemplazamiento enzimático durante el periodo de estudio. La toxicidad fue nula.

3. Ensayo en neonatos

En este ensayo la terapia génica se hizo en base a un diagnóstico prenatal en tres pacientes.

Inmediatamente después de nacer, las células CD34+ fueron aisladas en cultivo. La transferencia se hizo ex vivo con retrovirus modificado conteniendo el gen ADA.

Las células modificadas fueron introducidas a partir del 4º día de vida. El logro de la terapia fue conseguir implantar estas células sin ninguna terapia citoablativa. Entonces los pacientes deberían tener una continua población de células productoras de ADA en su médula ósea.

Todos los pacientes toleraron el tratamiento sin problemas. En todos hubieron evidencias de leucocitos genéticamente correctos en sangre y médula ósea tras 18 meses. Sin embargo, las cantidades relativas de estas células fueron bajas y no contribuían a obtener niveles normales de ADA. Todos los pacientes fueron mantenidos con reemplazamiento enzimático PEG-ADA.

4. Ensayo en Japón (agosto 1995)

Este ensayo se realizó a un niño japonés de 5 años.

El paciente comenzó a presentar síntomas de deficiencia en la inmunidad celular y humoral a los 8 meses; tras presentar un síndrome de distrés respiratorio fue hospitalizado y estudiado, donde se le realizó el diagnóstico de Sindrome de Inmunodeficiencia Combinada Severa debido a déficit de ADA. A continuación se le buscó un donante, y al no encontrarse un donante HLA compatible se le inicia tratamiento con sustitución enzimática y con suplemento de Ig a los 15 meses de edad. Pero los niveles de Ig se mantuvieron siempre bajos y tuvo recurrencia de linfopenia al segundo año de reemplazamiento enzimático.

El análisis de la secuencia de la amplificación del cDNA del ADA (por PCR) demostró que había una mutación en G632 a A, transición que daba como resultado una sustitución del residuo Arginina por Histidina en el codón 211. Esta mutación elimina el lugar de reconocimiento del enzima de restricción Rsa I. Según el patrón de restricción, mediante el enzima Rsa I, se observó que la mutación del gen no era homozigota. Para determinar la herencia, aplicó el mismo procedimiento para los alelos de los padres, resultando que el padre tenía un mismo patrón de restricción que su hijo. El otro alelo mutado provenía de la madre, el cual presentaba un cDNA normal pero un mRNA no funcional., debido a una mutación en un exón. La mutación encontrada en el sugundo exón da como resultado de la digestión mediante el enzima BspM I un patrón de restricción diferente al normal.

A los 4 años, el paciente fue incluido en un ensayo de terapia génica, repitiendo el protocolo del primer ensayo realizado por el NIH en 1990. Las células periféricas del pacientente (obtenidas por aféresis) fueron estimuladas con IL-2 y anticuerpos anti-CD3. Tras 72h de estimulación, fueron expuestas durante las 48h próximas al vector retroviral del ADA, llamado LASN. Después fueron cultivadas por 6 días, y posteriormente reinfundidas al paciente. El porcentaje de células que contenían el vector en su DNA, detectado por PCR, era del 3 y 7%, en la 1ª y 2ª infusión respectivamente. El paciente recibió un total de 10 infusiones en un periodo de tiempo de 18 meses.

Primero subieron mucho los linfocitos, y después bajaron a un nivel basal.Esto fue seguido de un incremento sostenido a partir de la 8ª infusión, hasta que se mantuvo en niveles normales. A partir de la 4ª infusión, debido a un aumento absoluto de células CD8+, hubo una progresiva inversión de la relación CD4/CD8. Esto se cree que es debido a un crecimiento preferencial de las células CD8+ durante el cultivo in vitro. La actividad del enzima ADA, casi indetectable antes de la terapia génica, también aumentó progresivamente después de la 7ª infusión (día 252), y el día 476 llegó a niveles casi iguales que un portador heterozigoto.

El número de células trasnducidas en la sangre periférica fue estudiado semicuantitativamente por PCR obteniendo una muestra de sangre antes de cada infusión. La frecuencia de células genéticamente modificadas aumentaba conforme aumentaban el numero de infusiones de linfocitos transducidos, llegando a sobrepasar el 10% del total de las células monocelulares circulantes justo antes de la 5ª infusión, a partir de la cual se mantuvo más o menos estable (10-20%).

Para evaluar las consecuencias funcionales de la terapia, comparamos la función inmune del paciente antes y después del tratamiento:

ANTES DESPUÉS

Isohemaglutininas Ig G <2 16

Test cutáneo DTH(mm) Candida 3x3 18x19

Tétanos N.D. 6x5

Igs IgG 720 811

IgA 20 53

IgM 84 128

Las isohemaglutininas ascendieron, y las reacciones al test cutáneo fueron mayores. Los niveles de Ig séricos ascendieron gradualmente aunque se suspendiera eventualmente el aporte de Ig exógeno, y se mantuvieron en niveles normales durante medio año sin tratamiento con Ig exógenas. Estos resultados sugieren que la acumulación de células T genéticamente correctas en la sangre del paciente está asociada con una mejora en la respuesta humoral y celular.

Aunque el paciente algunas veces tuvo febrícula transitoria tras las infusiones, no mostró serias reacciones adversas a los tratamientos. El niño ha ganado 3kg y actualmente acude a la escuela pública, sin presentar más infecciones que los demás niños. Continua con el tratamiento de sustitución enzimática con PEG-ADA. Aun así, el tiempo que lleva de observación no es suficiente para valorar la respuesta.

CONCLUSIÓN

Los avances durante las últimas décadas han sugerido que la transferencia genética podrá proporcionar una nuerva aproximación para el tratamiento de enfermedades hereditarias, así como muchas adquiridas como cáncer y SIDA. Hasta el momento, 10 pacientes con Síndrome de Inmunodeficiencia Combinada Severa por déficit de ADA han sido incuidos en ensayos de terapia génica, utilizando diferentes estrategias, diseños de vectores retrovirales y poblaciones de células diana.

Los resultados se pueden considerar buenos, aunque todavía es temprano para evaluar resultados. Aunque estos ensayos dan información de que la terapia génica puede mejorar cambiando los vectores retrovirales, los métodos de transducción y la población de células diana, es dificil comparar la eficacia de estos ensayos por la diferencia intrínseca de sus estrategias (protocolo).

En el caso del ensayo NIH y el ensayo de Japón, que utilizaron idéntico protocolo, se puede observar la eficacia de aplicar el tratamiento a las células T periféricas. Los resultados clínicos en ambos fueron similares.