Tema 1: Medios de cultivo.

Medios de cultivo.

Los nutrientes son necesarios para los microorganismos. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes que crean las condiciones necesarias para que crezca un microorganismo. Son preparados artificiales que intentan imitar las condiciones ambientales presentes en la naturaleza y se presentan en forma de:

• Desecados: en forma de polvo, tienen una mayor durabilidad

• Hidratados: preparados ya, listos para usar, la vida media de las placas es mas corta.

Tienen 4 componentes:

• Agua

• Fuente de carbono y energía

• Fuente de Nitrógeno, Fósforo y Azufre

• Sales minerales.

También pueden llevar algunas otras sustancias como:

• Factores de crecimiento.

• Agentes tamponantes.

• Agentes gelificantes.

• Colorantes.

• Indicadores de pH.

• Indicadores Redox.

• Etc.

La función de estos compuestos es porque cada microorganismo crece bajo determinadas condiciones.

Principales componentes de los medios de cultivo.

Agua

Todos los medios de cultivo tienen agua, se utiliza agua destilada sin Cloro, Calcio o magnesio, estos cationes podrían precipitar con el PO42- de las peptonas durante la esterilización, limitando la disponibilidad de estos elementos. Esta agua está a pH neutro.

Productos orgánicos

• Digeridos proteicos o pectonas.

Entre los más comunes están las peptonas, ya que la mayoría de los microorganismos no tienen proteasas, y son hidrolizados de proteínas de distintas fuentes, pueden ser de la carne, de la leche (caseína), o de las plantas. Se degradan mediante ácidos o álcalis, o mediante la hidrólisis enzimática. Dependiendo de la fuente de la proteína, como del mecanismo de hidrólisis, incluso de un lote a otro, obtendremos distintas características:

Digeridos enzimáticos de caseína.

Son aminoácidos libres y pequeños péptidos, ricos en Triptófano, y pobres en Carbohidratos. Son útiles para la fermentación de azúcares. Los más utilizados son Casitone, Trypticase peptone y Tryptone.

Digeridos enzimáticos de carne.

Son aminoácidos y péptidos similares a los digeridos de caseína, aunque de proporciones más variadas. Los mas utilizados son Bacto peptona, Proteosa peptona y Peptona bacteriológica

Digeridos enzimáticos de plantas.

Proceden de plantas como la soja, son ricos en carbohidratos, proteínas y vitaminas. Los más utilizados son Phytone, Soytone y Soya peptone

Hidrolizados ácidos de caseína.

Aminoácidos libres son pobres en Triptófano y Cisteína porque la hidrólisis ácida destruye aminoácidos y vitaminas. Se utilizan sobre todo Acidicase y Casamino acids.

Hidrolizados mixtos.

Se han desarrollado porque dan mejores resultados que las peptonas que usan una sola fuente.

• Biosate: Extracto de levadura y digerido de caseína.

• Polypeptone: Digeridos de caseína y carne.

• Tryptone: Digeridos de distintas fuentes.

• Extractos e infusiones.

Son concentrados de productos hidrosolubles de carne, órganos o tejidos de animales o vegetales, se obtienen mediante maceración, ebullición, y una posterior concentración y desecación hasta obtener una pasta o polvo.

Extracto de carne.

Sin carbohidratos fermentables, pero con ácido glicólico y láctico y creatinina que pueden servir como fuentes de Carbono.

Extracto de levadura.

Se pueden obtener mediante autólisis de levadura de panadería, incubando las células a temperatura alta y también por hidrólisis ácida o enzimática. Es rico en aminoácidos, péptidos, vitaminas hidrosolubles del complejo B y carbohidratos.

Extracto de glóbulos rojos.

Aparte de otros nutrientes, suministra los factores X o hemina y los factores V (difosfo - piridín - adenín nucleótido) encargado de la coagulación de la sangre.

Infusiones de hígado, corazón y cerebro.

Ricos en aminoácidos azufrados que reducen el potencial redox.

Extracto de suelo.

Cultivo como la esporulación de microorganismos del suelo como Azotobacter, Rizhobium,...

• Carbohidratos.

Son fuente de carbono y energía, estos compuestos suelen ser glúcidos:

• Monosacáridos: Glucosa.

• Disacáridos: Lactosa.

• Polímeros: Almidón.

• Hidrolizados: Extracto de malta.

A la hora de esterilizar los carbohidratos, tenemos que tener en cuenta la reacción de Maillard. Esta reacción tiene lugar por interacción de los aminoácidos y peptonas con los grupos hidroxilo de los azúcares dando lugar a un marcado oscurecimiento de los medios, en este caso, los carbohidratos se esterilizan por filtración, y una vez estériles, se adicionan en condiciones asépticas y no por temperatura.

• Fluidos corporales.

Se trata de sangre completa, desfibrinada, inmunizada, plasma o suero sanguíneo. La sangre no puede ser esterilizada, debe ser obtenida en condiciones asépticas directamente del animal sano (conejo, rata, caballo, cordero,...). Hay dos tipos de medios de cultivo con sangre.

• Agar-sangre:

Se adiciona la sangre al medio estéril en sobrefusión (45-50ºC). Es útil para pruebas de hemólisis (pruebas de patógenos).

• Agar-chocolate:

Los glóbulos rojos hemolizados, se adiciona la sangre desfibrinada al medio estéril a 80ºC, a esta temperatura, se produce la hemólisis y se liberan los factores X y V, es útil para el crecimiento de Neisseria y Haemóphilus.

• Otros suplementos.

Otros compuestos utilizados para la elaboración de medios de cultivo, en forma de suplementos son:

• Leche descremada (bacterias lácticas).

• Zumo de frutas o tomate (bacterias aisladas de vegetales).

• Suplementos vitamínicos.

Compuestos inorgánicos.

Aquí incluimos el NaCl, que regula la osmolaridad del medio (proporciona un equilibrio osmótico).

También encontramos K, Mg, Fe, Ca, etc.

La fuente de Fósforo, a veces es incorporada como PO42-.

La fuente de Azufre como SO42-.

Nitrógeno como NO3-, o como NH4+.

Agentes gelificantes.

Se usan para preparar medios de cultivo sólidos o semisólidos, gracias a estos, los primeros microbiólogos aislaron microorganismos en cultivo puro. Tenemos:

• Agar-agar:

Es el más utilizado, es un polímero polisacarídico, se obtiene de algas rojas del género Gelidium. Un 70% de agarosa, constituye el agente gelificante y un 30% de agaropectina.

Es insoluble en agua fría pero se disuelve en agua hirviendo, durante el enfriamiento se mantiene líquido entre los 45-50ºC para solidificar a 38-40ºC. Cuando solidifica forma geles transparentes y pocos microorganismos pueden degradarlo. Como inconveniente es caro, pero es el más utilizado. Se usa en alimentación como E-406.

• Carragenina:

Se extrae de algas rojas marinas, polímero muy utilizado en alimentos como E-407, es menos usado, solidifica a 50-60ºC y no es útil para la adición de compuestos en sobrefusión.

• Gelatina:

Fue el primer agente gelificante usado por R. Koch, procede del colágeno. Este se licua fácilmente por encima de los 28ºC, no se utiliza con frecuencia y también por la por la facilidad de degradación por parte de muchos microorganismos, mediante la actividad proteolítica.

• Gel de sílice o silicogel:

De origen inorgánico de silicato Na y K, se emplea al 10%, es raro su empleo por su dificultad de manejo y su elevado coste, su uso está restringido a la elaboración de medios definidos para el cultivo de bacterias autótrofas estrictas anaerobias.

Agentes selectivos.

Son compuestos que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero permiten el crecimiento de otros, pero solo a una concentración determinada. Los más utilizados son:

• Colorantes (cristal violeta, azul de metileno, verde brillante...).

• Bilis o sales biliares.

• Laurilsulfato sódico.

• NaCl.

• Azida sódica, selenito, telurito potásico, cloruro de litio, ...

• Antibióticos.

• Antifúngicos, que inhiben el crecimiento de los hongos y las levaduras.

El medio de McConkey contiene cristal violeta para inhibir el crecimiento de bacterias Gram - y sales biliares para favorecer el crecimiento de las enterobacterias.

Agentes reductores.

Permiten crear condiciones anaerobias para favorecer el desarrollo de gérmenes microaerofílicos o anaerobios, reducen el O2 y lo convierten en H2O. Tenemos agentes reductores como:

• Cisteína.

• Tioglicolato sódico.

• Sulfuro ferroso.

• Sulfuro sódico.

• Ditioteitrol.

• Citrato de Titanio (III).

Sistemas de amortiguación del pH.

Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro de unos rangos óptimos para el crecimiento de los microorganismos. Los microorganismos más comunes son los neutrófilos (pH = 7), aquí se emplean sales como los fosfatos disódicos o bipotásicos/monopotásicos.

Cuando se requieren pH ácidos, sobre todo para hongos y levaduras, se emplean tampones a base de citrato, acetato o succinato.

Indicadores de pH.

Son colorantes sensibles al cambio de pH y cambian de color según el pH, cada colorante tiene un rango de pH donde actúa.

Indicadores redox.

Son colorantes sensibles a los cambios de potencial redox del medio, nos informa sobre la capacidad de los microorganismos a aceptar o ceder electrones. El azul de metileno, cuando se oxida por completo, llega a 78 y es azul, mientras que si se reduce por completo, tiene un poder redox de -49 y es incoloro.

2.10 Sustancias cromogénicas o fluorogénicas.

Son sustancias que emiten color o fluorescencia al ser hidrolizados y nos informan sobre la utilización del sustrato por parte de la bacteria.

Clasificación de los medios de cultivo.

Según su estado físico:

• Sólidos: Contienen un solidificante (Agar) a una concentración de 1,5-2%. El Agar nutritivo contiene también 10g de peptona.

• Semisólidos: También tienen solidificantes pero en una concentración inferior al 0,5%.

• Líquidos: Son denominados “caldos”, no llevan agentes gelificantes como el agar; Ej.: agua de peptona.

Según su composición química:

• Medios indefinidos

Son naturales o complejos, son aquellos en los que se desconoce su composición precisa, ya que están preparados con peptonas, extractos de levadura, de carne, agar...; Ej.: Agar nutritivo.

• Medios definido.

Son sintéticos, se conoce de forma exacta su composición química tanto cualitativa como cuantitativamente. Ej.:

• Agua Peptona:

. Peptona: 10 g.

. NaCl: 5g.

. Agua destilada: 1000 ml.

Según su finalidad:

• Medios ordinarios o generales: Tiene nutrientes que permiten el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Ej.: TSA.

• Medios de enriquecimiento: Son líquidos, ya que estos favorecen el crecimiento bacteriano sobre la base de una caracterización física o química de los mismos. Ej.: el Agua de peptona alcalina, con pH básico, permite enriquecer al Vibrio Cholerae.

• Medios diferenciales: En su composición existen algunas sustancias que ponen de manifiesto una determinada actividad metabólica de la bacteria. Ej.: Medio para favorecer la fermentación de la lactosa.

• Medios selectivos: Son sólidos, con un a sustancia (selector) que inhibe el crecimiento de algunos microorganismos pero el no el crecimiento de otro. Ej.: Medio de McConkey, intervienen sales biliares y selecciona el crecimiento de Enterobacterias a partir de una muestra heterogénea.

• Preparación de un medio de cultivo.

Se pueden preparar de distintas maneras:

Siguiendo fórmulas comerciales listas para su uso según las instrucciones. Estos medios se suministran deshidratados y se hidratan con agua destilada, según el fabricante, después se esterilizan.

Adicionando nosotros los diferentes compuestos de forma individual, según la fórmula preestablecida. Ej.: Medio YM.

A veces, algunos componentes no soportan la esterilización en autoclave, y hay que adicionarles al medio, una vez en sobrefusión, y se esterilizan por filtración.

Ejemplo práctico: Preparación del medio Agar de Bard Parkes.

50 ml de yema de huevo 1:1

25 ml de yema de huevo

25 ml de suero salino

50ºC

3 ml de telurito potásico al 3,5%.

• Conservación

Una vez estériles y fríos, los medios se refrigeran a unas temperaturas de unos 4-8ºC para evitar la deshidratación. Evitar la deshidratación es crucial para que los componentes no lleguen a alcanzar unas concentraciones demasiado altas y el medio de cultivo quede inservible, para ello también las placas con el medio de cultivo se ponen boca abajo y en bolsas de plástico para evitar la contaminación y evitar en todo lo posible la excesiva evaporación.

Tema 2: Cultivo de microorganismos.

Cultivo de microorganismos

Introducción.

Una vez que ya tenemos los medios de cultivo preparados, hay que inocularlos, y para ello se necesita:

• Medio de cultivo.

• Condiciones óptimas de incubación como temperatura, pH, presión, condiciones atmosféricas (concentración de O2).

Estos medios de cultivo son sólidos (cultivos en reposo), o líquidos (para cultivos en agitación)

Temperatura de incubación.

Según a la temperatura en la que los microorganismos puedan desarrollarse de manera adecuada, tenemos 5 grupos de microorganismos en función de la temperatura.

• Psicrófilos: Crecen bien a 0º C y tienen una temperatura óptima de 15ºC o menos, y la máxima temperatura es de 20ºC. Estos microorganismos viven en hábitats como en el Ártico o el Antártico.

• Psicrotolerantes: También llamados Psicrótrofos, toleran bien el frío, crecen a 0ºC y su temperatura óptima es de 20-30ºC, con una máxima de 35ºC.

• Mesófilos: Viven en animales de sangre caliente y ambientes acuáticos terrestres de latitudes tropicales, crecen a una temperatura óptima de 20-45ºC, siendo la temperatura mínima de 15-20ºC y la máxima de 45ºC.

• Termófilos: Viven en ambientes calientes, como las fuentes termales, etc., crecen a una temperatura de 55ºC o más, siendo su temperatura mínima de 45ºC y un óptimo de entre 55-65ºC.

• Hipertemófilos: Crecen en ambientes muy calientes, tienen una temperatura óptima de 80-113ºC.

• pH

Cada especie tiene un rango de pH definido para su crecimiento, y un pH óptimo para su crecimiento. Según esto, podemos clasificar a los microorganismos en:

Acidófilos: Tienen un pH óptimo de 0 - 5,5.

Neutrófilos: Tienen un pH óptimo de 5,5 - 8.

Alcalófilos: Tienen un pH óptimo de 8,5 - 11,5.

Presión.

La mayoría de los microorganismos crecen a presión atmosférica, sin embargo existen microorganismos que viven en las profundidades, donde la presión aumenta 1 Atm. cada 10 metros, por tanto estos microorganismos que en el medios haya presión, estos microorganismos son los barófilos. Los barotolerantes crecen tanto a presión atmosférica como a altas presiones.

Condiciones atmosféricas.

Aquí nos referimos a la concentración de Oxígeno, existen microorganismos que viven en O2 y otros que no. En cuanto a sus requerimientos de Oxígeno tenemos:

Aerobios estrictos: Exigen la presencia de Oxígenos para su crecimiento.

Microaerófilos: Son aerobios, pero necesitan una proporción menor de Oxígeno que en el aire (21%), aquí la concentración de Oxígeno es del 2-10%. Esto se debe a que tienen una capacidad limitada de respiración o bien a que tienen alguna molécula sensible al Oxígeno. Estos microorganismos viven en la superficie.

Anaerobios facultativos: Viven tanto con Oxígeno como sin él, pero crecen mejor en presencia de oxígeno.

Anaerobios aerotolerantes: No usan el Oxígeno cuando está presente, aunque viven tanto en presencia como en ausencia de éste. Estos microorganismos son fermentadores, la diferencia está en que los facultativos si usan el Oxígeno, pero los tolerantes no.

Anaerobios estrictos: No viven en presencia de Oxígeno porque le es tóxico.

Para poner de manifiesto los requerimientos de Oxígeno, se usa un caldo de tioglicolato sódico que permite tener condiciones de anoxia y también se añade un potencial redox.

El cultivo en condiciones de anaerobiosis se consigue:

Siembra en profundidad en placa, aquí se trasfiere 1ml de inóculo a una placa de petri vacía y estéril, a continuación se añade un medio de cultivo con agar fundido y atemperado. Una vez sólido, se le añade una 2ª capa del medio de cultivo.

Siembra en tubo con medio sólido fundido. Se trasfiere 1ml de inóculo a un tubo con medio fundido y atemperado que previamente a sido hervido para permitir la expulsión del Oxígeno presente en el medio (cuando se solidifica se le añade vaselina estéril, pero es opcional). Los medios utilizados incluyen algún agente reductor como la cisteína o el tioglicolato sódico.

Siembra en tubo con medio líquido. Aquí el medio se hierve para expulsar el Oxígeno, una vez frío, se inocula con 1ml de cultivo y no se agita, se cubre con una capa de vaselina de 1cm. Esta capa impide la difusión del Oxígeno al medio.

Jarras de anaerobiosis. Sembramos como aerobiosis, son recipientes herméticamente cerrados, donde se colocan los cultivos donde se permite crear en su interior unas condiciones adecuadas. El Oxígeno se transforma en agua, las condiciones de anaerobiosis se producen por procesos químicos.

Se introduce un sobre comercial con borohidrato sódico y ácido cítrico, con un catalizador de Paladio. El sobre se abre y se le añaden 10ml de agua destilada estéril para generar la liberación de CO2 y H2 mediante las siguientes reacciones:

C6H6O7 + 2NaHCO2 Na (C6H5O7) + 3H2O + 3CO2

NaBH4 + 2H2O NaBO2 + 4H2.

El Paladio cataliza la reacción entre el H2 y el O2 presente en la jarra, esta reacción produce agua que se condensa en las paredes de la jarra.

Para los anaerobios estrictos, estos se cultivan e incuban en condiciones anaeróbicas, por lo que se incuban en cámaras de anaerobiosis, que permiten el manejo de estos microorganismos en condiciones de anaerobiosis.

Mantenimiento y conservación.

En cualquier laboratorio es fundamental el mantenimiento y conservación de las colecciones de microorganismos para investigar, educar, uso industrial...

El mantenimiento se hace para conservar los microorganismos durante cortos periodos de tiempo, generalmente días. La conservación se usa para conservar estos microorganismos durante largos periodos de tiempo, años. El principal objetivo de la conservación de las cepas es mantenerlas viables, mantenerlas en cultivo puro y evitar que sus caracteres genéticos y fenotípicos cambien, es decir, mantener la cepa lo más próximo posible a su estado original.

• Métodos de mantenimiento a corto plazo.

Subcultivo.

Es el más utilizado, consiste en una resiembra periódica del microorganismo cada cierto tiempo en un medio de cultivo adecuado. El intervalo de tiempo depende del tipo de microorganismo, como de las condiciones externas y del medio utilizado. La resiembra se realiza en un agar inclinado. Los medios utilizados usan agar inclinado, ya que se detectan mejor los contaminantes en medio sólido que en líquido. Al hacerlo inclinado, tiene por objetivo evitar la desecación rápida del medio, ya que se evapora menos.

La composición química tiene una composición mínima, son los más adecuados porque soportan una tasa metabólica menor. Algunas bacterias requieren medios complejos para su correcto crecimiento y almacenamiento, por tanto los periodos de conservación son cortos.

El periodo de resiembra es válido para cortos periodos de tiempo, generalmente 15- 20 días, ya que pierden la viabilidad al emitir toxinas producto de su actividad metabólica residual, a la pérdida de agua, o bien al aumento en la concentración de solutos, más de tres meses no se pueden tener así.

La refrigeración está entre los 4-8ºC porque la tasa metabólica disminuye excepto en pscrofilos, además, así también disminuye la evaporación del agua, evitando el aumento en la concentración de sales y otros componentes.

Bajo aceite de parafina.

Es el método más antiguo aunque todavía se utiliza hoy día, es útil para microorganismos que no se pueden conservar por otros métodos como los protozoos. Aquí el aceite se esteriliza a 130ºC durante 1 o 2 horas, se usa un cultivo en fase logarítmica de crecimiento del microorganismo, y se le añade una capa de 10mm de aceite de parafina estéril.

El aceite impide la difusión del Oxígeno al medio de cultivo, por lo que se evitan las oxidaciones y reducciones de la tasa de crecimiento. Los tubos se conservan en frío para evitar la evaporación de agua y que haya un acceso excesivo y una difusión de Oxígeno.

• Métodos a largo plazo.

Entre estos métodos está la desecación, que es la eliminación de agua mediante deshidratación que permite reducir drásticamente el metabolismo. No todos los microorganismos sobreviven a estos procesos, salvo sus formas de resistencia, es decir las esporas.

Desecación sobre tierra.

Es útil para microorganismos productores de esporas. En cuanto a soportes, usamos una mezcla de arena y tierra, aquí se toma una muestra de tierra de jardín y se mezcla con arena. La mezcla se esteriliza a 130ºC durante 2-3 horas 3 veces con aire caliente, no en autoclave. Una vez estéril, se le añade unas gotas de la suspensión de esporas y se deja secar a temperatura ambiente, a continuación de conservan a 4ºC.

Para la recuperación del cultivo, tomamos una pequeña cantidad de la fracción de tierra y la suspendemos en un medio de cultivo adecuado.

Se pueden usar otros materiales en vez de tierra como el silicogel, bolas de porcelana o incluso vidrio poroso.

Desecación sobre papel.

Método fácil y barato, consiste en usar discos o tiras de papel estériles y a continuación se le añaden los microorganismos y se seca al vacío. Hay una variante que consiste en usar gelatina en ves de papel que protege los microorganismos de la desecación. Aquí el cultivo se centrifuga, y el pélet se mezcla con gelatina nutritiva fundida a 28-30ºC y después se echan las gotas de la mezcla en el papel de filtro y se deja solidificar. Posteriormente se lleva a 10-15ºC a un desecador.

Congelación.

Es útil porque deprime el metabolismo al bajar la temperatura hasta el punto de congelación o por debajo se reduce el metabolismo drásticamente hasta casi anularlo con Nitrógeno líquido a -192ºC. Pero la congelación acarrea una serie de problemas como la formación de cristales de hielo, que pueden romper las células. Otro problema es que al eliminar el agua líquida y transformarse en hielo, existe una concentración de sales que puede ser perjudicial para la célula.

Para solucionar estos problemas se usan agentes crioprotectores (anticongelantes) que son productos que protegen la célula impidiendo el daño celular durante los procesos de congelación y descongelación. Estas sustancias son muy solubles y poco tóxicas. Las sustancias que normalmente se usan son:

• Penetrantes: entran en el interior celular, glicerol al 25% o dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%.

• No penetrantes: protegen desde fuera, albúmina de suero, leche descremada al 20%, sacarosa al 12% o dextrano al 10%, además de glucosa, lactosa, manitol, poliglicol, polivinilpirrolidona, ...

En cuanto a la forma de congelar, hay una controversia, ya que algunos recomiendan una congelación rápida y otros, gradual que consiste en bajar 1ºC/min. Hasta los -20ºC, para luego bajar rápido. Sin embargo la descongelación debe ser rápida.

También se puede congelar a una temperatura de -30ºC en congeladores normales o bien a -70ºC con nieve carbónica, este el método más utilizado en los laboratorios para la conservación de microorganismos.

La ultracongelación consiste en congelar con nitrógeno líquido a -196ºC, se usa para congelar bacterias, virus y líneas celulares.

Liofilización.

Es el método más empleado para el mantenimiento de colecciones de cultivo. Se ha usado para muchas bacterias y virus reteniendo la viabilidad hasta 50 años. Consiste en una congelación y posterior desecación al vacío (el agua sublima a baja presión).

Para evitar los daños del frío, se usan agentes crioprotectores como la leche o la albúmina. Aquí el cultivo se centrifuga y el sedimento se resuspende en una solución crioprotectora y se congela con nieve carbónica, a continuación se hace sublimar el agua.

Una vez desecado, la ampolla se cierra a la llama, manteniendo el vacío. Para evitar su oxidación, se llana de nitrógeno y después se guarda a 4ºC o a temperatura ambiente.

Para recuperar los microorganismos, rompemos la ampolla, adicionamos medio fresco e incubamos los viales a una temperatura adecuada. Para comprobar si la cepa es pura, se siembra o disemina una muestra.

Conservación de los distintos microorganismos.

• Algas y cianobacterias:

• Subcultivos a temperatura de 10-15ºC

• Algunas cianobacterias se pueden conservar bien desecadas ya que presentan akinetos.

• Las algas no aguantan bien la desecación ni la liofilización. La congelación es el mejor resultado con Nitrógeno líquido.

• Bacterias.

• Se han usado todos los métodos conocidos con malos y buenos resultados, el mejor método es la liofilización debido a su facilidad de transporte.

• Virus.

• Se recomienda para su conservación en mucho tiempo el Nitrógeno líquido.

• Hongos.

• La mayoría se conservan por desecación en suelo ya que tienen formas de resistencia.

Tema 3: Determinación del crecimiento de las poblaciones.

El crecimiento bacteriano se puede entender desde distintas perspectivas, y se puede llegar a medir el crecimiento mediante distintos métodos.

Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos o biólogos moleculares, una medida del crecimiento es la medida de la biomasa, para ello, la síntesis macromolecular, y un aumento de la síntesis de componentes celulares es una medida del crecimiento. Para otros el crecimiento bacteriano es la capacidad multiplicarse que tienen las células individuales.

Medida de la biomasa.

Es una medida de la masa de los constituyentes de la masa bacteriana usada para la medida de una actividad metabólica o de un constituyente metabólico o químico. Se puede realizar mediante métodos directos o indirectos.

Directos:

• Determinación del peso húmedo.

Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada tras su separación mediante filtro o centrifugación, para ello, el tubo se tara antes y luego se elimina el sobrenadante y se pesa el sedimento. Como desventaja tiene que al contener líquido en los espacios intercelulares, este líquido contribuye en el peso total de la masa celular.

• Determinación del peso seco.

Se obtiene por el secado de un volumen de cultivo bacteriano en un horno a 105ºC toda la noche hasta obtener un peso constante. Tiene la desventaja de que se pierden compuestos volátiles de la célula por el secado y también por alguna degradación.

• Determinación del Nitrogeno total (método Kjedahl).

Consiste en la determinación del nitrogeno total mediante la tecnica y consiste en la digestión de la muestra con H2SO4, a una temperatura de 338ºC que corresponde al punto de ebullición del H2SO4, así la muestra se carboniza y se forma (NH4)2SO4, tras esto se añade NaOH formándose NH3 y destilamos la disolución recogiendo el NH3. Posteriormente valoramos con HCl por titilación, y se valora la cantidad de NH3 y de ahí, el porcentaje total de Nitrogeno.

• Determinación de componentes característicos.

Consiste en determinar la cantidad de peptidoglicano, ADN, ARN, proteínas, ergosterol, ATP,…. el más usado es el ATP, porque juega un papel crucial en el metabolismo y esta presente en altas concentraciones , además todos los seres vivos tiene ATP y no está presente en las células muertas, también se puede fácilmente extraer y medir de la célula.

Se realiza en tres etapas:

• 1. Toma de muestras

• 2. Extracción.

• 3. Análisis.

La toma de muestras.

Se debe de realizar manteniendo la concentración de ATP constante durante el muestreo y conservación. La extracción se realiza aplicando distintos métodos, pero teniendo en cuenta unos requisitos como:

• Rápida muerte y lisis celular.

• Liberación completa de nucleótidos.

• Inactivación completa e irreversible de los enzimas.

• Estabilidad a largo plazo de los nucleótidos extraídos.

El análisis.

Puede ser medido mediante técnicas cromatografía, en climáticas o por radio isótopos. El método más utilizado es el de la luminiscencia, que es una reacción de oxidación sencilla donde la luciferina reducida se oxida en presencia de luciferasa y se necesita ATP produciendo la oxiluciferina que emite luz. Esta medida se establece por un luminoso metro y la luz es proporcional al ATP, con lo que se estima la masa microbiana.

ATP + luciferina reducida + O2 AMP + PPi + producto + luz

Indirectos:

• Medida del consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo.

Se mide en:

• Consumo de oxígeno.

• Consumo de dióxido de carbono.

• Producción de ácidos.

• Liberación del C14 a partir de procesos radiactivos.

Ejemp. Los radioisótopos.

La incorporación de precursores radiactivos es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una de una población microbiana en esta técnica se adiciona al medio compuestos marcados en efectivamente que pueden ser incorporados a las células durante el metabolismo. Se encuentra del carbono 14 la inhibida criticada.

Tras esto, se determina la cantidad de marca incorporada por toda la población, esta técnica determinada proporción de bacterias vivas, tasas de crecimiento, actividades fisiológicas y captación de nutrientes.

• Medidas de aumento de la densidad celular mediante métodos turbidimétricos.

Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio, y la base común consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano, es decir, las dispersiones bacterianas dispersando luz, igual que cualquier partícula (efecto Thyndal).

Un ejemplo de estos aparatos es un espectro fotómetro. La dispersión de la luz dentro de cierto límite es proporcionar a la masa del cultivo, y fuera de estos límites, la relación no es lineal.

• Otros efectos de la actividad metabólica.

Como consecuencia del metabolismo, hay varios cambios en el cultivo microbiano, como:

• Cambios de pH.

• Cambios en el potencial redox.

• Hidrólisis de sustratos cromogénicos o fluorogénicos.

• Dándose conductividad (impedancia) etc.

La impedancia:

También llamado espectroscopía dieléctrica. Es un conjunto de técnicas que permiten monitorear pontificar incluso identificar microorganismos en nuestra muestra procedentes de la industria de práctica médica. La impedancia se define como la resistencia al flujo de una corriente eléctrica alterna cuando esta pasa por un medio conductor.

La conductancia es el inverso de la resistencia de la impedancia, cualquier aumento la conductancia, produce un descenso de la impedancia y un aumento en la corriente.

Los medios de cultivo tienen sustratos que carecen de carga constantemente cargados, proteínas, carbohidratos, lípidos, éstos se degradan durante el metabolismo de producir aminoácidos, lactato, acetato, y esto da un aumento la conducta hacia (el medio se vuelve conductor) y baja la impedancia.

Un ejemplo es la degradación de la glucosa.

Esta se divide en dos moléculas de ácido láctico cargado y este se convierte en dióxido de carbono que es un conductor con lo que da lugar a un descenso en la impedancia.

Hasta ahora nos hemos referido a la impedancia directa, donde los electrodos están directamente introducidos en el cultivo, sin embargo, la mayoría de los medios de cultivo llevan altas concentraciones de sales dando medidas falsas de partida (medio de Baird-Parker que lleva altas concentraciones de cloruro de litio). Se ha desarrollado otro método que es la impedancia indirecta, que mide el dióxido de carbono despedido como consecuencia del metabolismo microbiano, el inoculo se incuba en una cámara hermética y separados de los demás electrodos, que están en contacto con una sal de hidróxido de potasio que reciben los gases desprendidos por el cultivo. El dióxido de carbono es absorbido por KOH, provocando un descenso en la impedancia.

Es muy utilizada en la industria alimenticia para determinar los recuentos totales de microorganismos en leche, cerveza, carne, pescado etc. también se usa en farmacia, en cosmética, industria petrolera, y la determinación en muestras químicas para determinar y cuantificar organismos específicos usando medios selectivos además para el análisis de biocidas (matan bacterias).

Medida del número de individuos.

Permite determinar la capacidad de los microorganismos para multiplicarse, también existen métodos directos o indirectos. Todos se basan en el recuento directo mediante técnicas microscópicas.

Métodos directos:

• Preparación en fresco, fijadas y teñidas.

• Uso de colorantes fluorescentes.

• Tinciones vitales.

• Inhibidores

• Reducción de colorantes

• Inmunofluorescencia.

• Sondas moleculares fluorescentes.

• Preparaciones en fresco.

Se usan cámaras de conteo en cuya superficie lleva 1 rejilla que tiene 25 cuadros grandes divididos en 16 cuadrados pequeños con 1 volumen de 0,02 ml y 1 superficie de 1 mm². Estas cámaras se denominan cámaras de Petroff-Hauser.

Número de microorganismos/mililitro es igual al número de contratos en los cuadrados grandes por el factor de dilución entre el número de cuadrados contados por el volumen del cuadro. (Ver fórmula página 14).

• Uso de colorantes fluorescentes.

Estos colorantes se unen a diferentes vías; por ejemplo el anaranjado acridina, colorante que cuando se une al ARN, producen fluorescencia rojo naranja y cuando se une al ADN se vuelve de color verde. Estas preparaciones se ven en el microscopio de fluorescencia y la proporción de células rojas y verdes es el cociente entre el ARN y el ADN y por tanto de la actividad metabólica, ya que el contenido de ARN aumenta con el metabolismo.

• Tinción Vital (yoduro de propidio).

Se basan en las diferentes propiedades tintoriales de las células vivas y las muertas usando colorantes como el azul de metileno y el azul de toluidina. El azul de metileno tiñe las células muertas en azul y las células vivas las deja incoloras ya que penetra en las membranas no intactas.

• Inhibidores de la división celular.

Impiden la replicación del material genético, inhibiendo la ARN girasa y por tanto la división celular. Por tanto, los microorganismos tratados crecen formando filamentos alargados al no existir división; en cambio las células muertas no crecen y forman estos filamentos.

• Reducción de colorantes derivados del tetrazolio.

Estos colorantes pueden ser reducidos gracias a la actividad deshidrogenasa de los microorganismos produciendo formazano en gránulos intracelulares insolubles de color rojo. Se añade colorante a la muestra y se incuba durante 20 minutos a continuación se observan las células que contienen gránulos, estas por tanto son las que están vivas.

El procedimiento es el siguiente:

• Se coge un cultivo bacteriano y se adiciona INt (colorante).

• Se incuban durante 20 minutos.

• Se observan las células que contienen gránulos, estas por tanto son las que están vivas.

Métodos indirectos.

Implican el crecimiento del número de individuos capaz de formar colonias así que sólo se tiene en cuenta el número de microorganismos viables según esto tenemos 2 métodos:

• Método del número más probable.

• Recuento de viables en placa.

• Método del número más probable.

Éste método se basa en el principio de que 1 célula viva puede desarrollarse producir 1 cultivo turbio. El procedimiento es:

La muestra es dispersada en suspensión de dilución y diluido adicionalmente a continuación sin inoculo en los tubos de cada dilución en réplicas de 5 a 10 tubos de medio específico y a continuación se incuba a las condiciones óptimas de crecimiento.

En estas placas el crecimiento se detectan por turbidez, también se puede determinar el crecimiento de 1 colonia mirando la producción del gas a la aparición o desaparición de 1 sustrato por lo tanto los tubos son positivos o negativos para el crecimiento, determinándose así el número más probable de microorganismos presentes de la muestra usando 1 tabla estadística disponible en Internet. Este método se usa mucho para determinar el número más probable de microorganismos presentes en el agua potable.

• Recuento de viables en placa.

1 célula es viable cuando colocado en 1 medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia, cada célula viable dar origen a 1 colonia después de 1 tiempo y contando las colonias y teniendo cuenta la dilución y volumen de la alícuota usada es fácil deducir el número de células viables en 1 solución original.

Éste método se realiza por:

• Extensión en placa:

Se vierte 0, 1 ml en la superficie de 1 medio sólido y se incuba.

• Vertido en placa:

La alícuota se mezcla con agar en sobrefusión a unos 45 °C, a continuación se vierte en la placa, se deja solidificar y por último se incuba en las condiciones óptimas.

El número de colonias visibles se calcula:

UFC/ml = Nº de contados en placa x Dilución x Volumen (0,1 ml)

Si hay pocos microorganismos, hay que concentrarlos por filtración y luego podemos usar el método que queramos. Si tenemos 1 volumen filtrado y los microorganismos se quedan retenidos en el filtro y este filtro se coloca 1 medio de agar nutritivo y después se incuba, posteriormente se cuentan las colonias y se multiplica por el volumen filtrado.

Tema 4: Antibióticos.

La penicilina fue el primer antibiótico aislado o descrito. Fue descrito por Alexander Fleming que lo aisló en 1929. Lo aisló a partir de un hongo llamado Penicillium notatum.

El uso de estos antibióticos en una enfermedad infecciosa exige:

• Conocimiento del agente causal de la infección y su sensibilidad a los antibióticos.

• Empleo del antibiótico más eficaz y al mismo tiempo menos tóxico y más barato.

• Utilización de las dosis adecuadas durante el tiempo adecuado.

• Vigilancia estrecha del paciente con control del funcionamiento renal y hepático.

Cualquier anomalía que surja en el paciente debe ser considerado en un principio como debida los antibióticos que recibe.

Efectos de los antibióticos sobre el crecimiento bacteriano.

Los antibióticos son agentes antimicrobianos de ciertos microorganismos y que afectan el crecimiento microbiano, se pueden observar 3 tipos de efectos:

puede

• Bacteriostático:

Se observa cuando se inhibe el crecimiento pero no se produce la muerte celular, estos agentes son inhibidores de la síntesis de proteínas y actúan unidos a los de 2 formas, dicha unión es reversible ya que al diluir el agente antimicrobiano, se reanuda el crecimiento; el número de células totales son las viables.

• Bactericida:

En este caso el agente microbiano produce la muerte celular pero estas células no se lisan, son agentes químicos que se unen fuertemente a sus dianas celulares y no se liberan por dilución, esto es irreversible.

• Bacteriolítico:

Cuando usamos un agente Bacteriolítico se produce una muerte celular acompañada de una lisis de sus paredes y membranas.

Dentro de los agentes Bacteriolíticos están los antibióticos que inhiben la síntesis de la parte celular como por ejemplo; la penicilina se degrada neonatales la membrana plasmática.

Métodos de ensayo para determinar la susceptibilidad de un microorganismo a los antibióticos.

Existen 2 métodos para determinar la susceptibilidad de un microorganismo ante un determinado antibiótico.

Métodos de difusión en agar.

Existen 3 técnicas:

• Difusión en disco.

También conocido como antibiograma. El procedimiento es en una placa de siembra. Se siembra de manera uniforme el microorganismo en cuestión de forma homogénea y se colocan discos de papel filtrado impregnados con diferentes antibióticos. Luego se cubre desde el disco a través del agar y se difunde, por lo que la concentración del antibiótico disminuye conforme se desplaza del disco hasta que la concentración del antibióticos tan baja que no puede inhibir el crecimiento bacteriano. El área de inhibición es el grado de inhibición y el diámetro se mide según este diámetro se puede dividir en diferentes categorías; susceptible, intermedio resistente. Esto viene determinado por Comité nacional de estándares para los análisis clínicos

• Técnica de los pocillos.

En un placa con capa base de medio se colocan torrecillas de acero inoxidable estériles y se vierten 6 ml de sobrecapa atemperada a continuación se inoculo el microorganismo a ensayar. Una vez sólido, se retiran las Torrecillas dejando unos huecos donde se deposita el antibiótico, después se incuba y se mide el halo de inhibición. Después se convierte en unidades arbitrarias mediante el ensayo diluciones seriadas de este antibiótico.

La unidad arbitraria es la última dilución capaz de producir un alud de inhibición visible alrededor del pocillo.

• La gota.

Se basa en el mismo procedimiento. En una capa de medio siglo externo sobre capa con los microorganismos y un vez sólido se vierten unas gotas de antibióticos diferentes direcciones, por último se mide el halo y se establecen las unidades arbitrarias.

Métodos de dilución.

Existen 2 técnicas:

• Dilución en placa de agar.

En este caso, el antibiótico se diluye previamente en medio sólido o líquido. El antibiótico se diluye en medio sólido antes de verter en placa, para ello, se preparan frascos con medio de cultivo sólido y estéril y atemperado 50 °C, a los cuales se adiciona la concentración de antibiótico necesario. A continuación, se vierten en placas y un de solidificadas, sobre cada capa se ponen las gotas de un cultivo microbiano (un-5 µl) tiene un densidad de un08células por mililitro. Las placas se incuban y se observa si existe crecimiento o no en la gota. Mediante este método, se puede determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI o MIC) que es la concentración más baja de un antimicrobiano capaz de de inhibir el crecimiento de un bacteria.

• Método de dilución en caldo.

El antibiótico se diluye en medio líquido, en tubos (macrodilución). Las placas de microtitulación tienen 96 pocillos y en cada pocillo se echa 0,1 ml

Todo se basa en la detección visual del crecimiento, si es transparente, no hay crecimiento, pero en cambio sí existe turbidez, es señal de que hay crecimiento. Para ellos se usa un batería de tubos con medio de cultivo estéril, a los cuales se adiciona concentraciones crecientes de un antibiótico determinado. Estos tubos se inoculan con el microorganismo y se incuba en condiciones óptimas. Tras incubar, se determinaron la MIC como en el caso anterior. La MIC se mide en microgramos/mililitro.

Este método permite determinar también la concentración mínima bactericida (CMB o MBC). Para ello se toman 0,5 mm de los tubos que no muestran crecimiento y se pasan a un2 ml de la Ricoh en su difusión.

La MBC, es la concentración mínima bactericida disminuye la viabilidad del 99,9% del inoculo.

Todos los métodos se basan en la detección del crecimiento mediante turbidez, hoy día, existen métodos automatizados para determinar la sensibilidad de antibióticos, y se basan en la medida del crecimiento de la actividad metabólica del microorganismo. Detectan cambios en el pH, potencial redox, cambios de conductividad en el medio (impedancia), por la concentración de ATP.

Entre estos métodos están el E-test. Es un método reciente y representa una sofisticada combinación de los métodos de difusión y dilución.

Se trata de un tira de plástico con concentraciones crecientes de antibiótico determinado, esta tierra se pone sobre un placa de agar inoculada con el microorganismo de estudio y se incuba en condiciones óptimas, tras la incubación se forma un a de inhibición eléctrica, en la cual se puede medir directamente la MIC. Esto se usa para microorganismos problemáticos o delicados como Estreptococos Pneumoniae.

El único método que no permite calcular la MIC es el de difusión en agar (discos).

Factores que influyen en los ensayos de sensibilidad.

Los resultados obtenidos en los ensayos de susceptibilidad a los antibióticos, pueden variar de un ensayo a otro y de un laboratorio a otro, dependiendo de un serie de factores que estandarizados para garantizar los resultados sean comparables con otros ensayos. Para ello el comité de estándares para laboratorios clínicos, ha puesto las normas necesarias para evitar estos problemas. Estos son:

- Composición de medio de cultivo.

- Estabilidad disolubilidad del antibiótico.

- Tamaño y bondad del inoculo.

- Velocidad del crecimiento del microorganismo.

- Tiempo de incubación.

- Condiciones de incubación.

• Composición del medio de cultivo.

Tienen gran influencia sobre los resultados, ya que alguno de los componentes del medio de cultivo, puede interaccionar con el antibiótico atenuando así la cantidad disponible de este. Por ejemplo: las proteínas del suelo y el interactuar con el pH del medio puede condicionar la velocidad del crecimiento así como la solubilidad del antibiótico y a veces su actividad.

• El Ph del medio:

Puede interaccionar con el antibiótico precipitando moléculas como los fosfatos o también como el tris, y aumenta la susceptibilidad en bacterias Gram - a los agentes antimicrobianos, y aumentar la sensibilidad de los microorganismos.

• La concentración del agar y la profundidad en la placa:

También influye sobre la difusión del antibiótico, ya que a más concentración existe una menor difusión del antibiótico y a más profundidad de placa, aumenta la dilución.

• Estabilidad disolubilidad.

Muchos compuestos son inestables insolubles en agua, y por lo tanto se preparan en soluciones hidroalcohólicas, pero al adicionar los pueden perder potencial y precipitar. Si el antibiótico es poco soluble, difunde poco que tiende a formar complejos con sustancias hidrófobas. El tipo de antibiótico, también influye, ya que algunos difunden más que otros, dependiendo de las características físicas del antibiótico, tamaño, carga...

• Tamaño y bondad del inoculo.

Existe una relación entre el número de moléculas de antibiótico y el número de células, que determina la efectividad del mismo, se inoculó es denso, la efectividad es menor, ya que hay un menor reparto de moléculas por células, también, porque algunas células sólo se dañarían parcialmente y escaparían a su acción. Se inoculó es muy pequeño, la efectividad será aparentemente mayor.

• Velocidad de crecimiento del microorganismo.

Determina el tiempo que una célula está en contacto con el antibiótico antes de dividirse, porque al dividirse se cambia la proporción antibiótico-número de células, esto determina los resultados y cuando más rápido crezca un microorganismo, más rápido se recuperará frente a un antibiótico.

• Tiempo de incubación.

Viene determinado por la velocidad de crecimiento del microorganismo. Depende del estado del medio, en medio sólido, tanto más tarde la en crecer, mayores son los a los de inhibición por qué le da más tiempo para difundirse. En medio líquido, la determinación de la MIC depende del tiempo de incubación, porque la relación célula/molécula de antibiótico es diferente.

• Condiciones de incubación.

Las condiciones de incubación para el microorganismo, deben ser las óptimas, ya que determinan el crecimiento del microorganismo.

Preparación de soluciones de antibiótico.

La solución mar del antibiótico se prepara a partir de concentrado deshidratado y estéril, que se puede adquirir en el comercio y con una potencia conocida. Hay que tener en cuenta la potencia de cada antibiótico.

0,9 mg/mg, quiere decir que en un mg de producto ha adquirido, sólo existen 0,9 mg de compuesto activo. La solución está preparada se conservan varias semanas a -20 °C ya que permanecerán estables así, sin embargo en otros casos se conservan a -70 °C para los más lábiles como penicilina.

Problema:

Datos:

- Pureza: 85%.

- Preparamos un solución madre de un concentración de compuesto activo de un mg/ ml, calcular la cantidad de preparado comercial para preparar un0 ml de solución madre.

85% 85 mg en un00 mg de compuesto activo

85 mg 100 miligramos

1mg X. X = 100/85 = 1,17 mg/ml.

10 ml x 1,17 mg/ml = 11,7 mg

Tema 5: Genética molecular microbiana

La genética molecular microbiana ha hecho posible el desarrollo de sofisticados procedimientos para el aislamiento, manipulación y expresión del material genético, llamado también ingeniería genética. Para ello se necesita localizar el gen en cuestión para su estudio.

Extracción del material genético.

La 1ª etapa seria la extracción del material genético.

Lisis celular.

Las células bacterianas se lisan mediante dos procedimientos:

• Enzimático.

• Químico.

• Enzimática:

La lisis enzimática se realiza mediante la adición de una enzima llamada lisozima que degrada la mureina que compone la pared celular rompiendo los enlaces  un-4 de peptidoglicano entre el N- acetil glucosamina y N- acetil murámico.

• Química:

La lisis química se realiza mediante EDTA que es un quelante de cationes divalentes que extrae de las membranas Ca2+ y Mg2+ desestabilizando la membrana externa. También inhiben las ADNasas. Se completa la lisis mediante la adición de un detergente (SDS) que permite la solubilización de la membrana citoplasmática. El lisado contiene pared, proteínas, polisacáridos, ADN, ARN,…

Extracción y precipitación de los ácidos nucleicos.

La extracción del ADN se puede realizar mediante diferentes procedimientos como la digestión con enzimas (pronasas, proteinasa potasita,…). Estas degradan las proteínas en péptidos pequeños.

También la extracción con disolventes orgánicos que remueven los contaminantes como el fenol-cloroformo, también la precipitación con agentes caotropicos NCl, CTIBB,… Por ultimo el ADN se precipita con etanol o isopropanol. A continuación se recupera el ADN mediante cromatografía.