OBJETIVO

En esta práctica vamos a determinar el contenido en quinina en una bebida refrescante carbonatada; concretamente en una tónica de la marca Nordic.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Cuando una especie química absorbe radiación electromagnética, pasa a un estado electrónico excitado. Muchas sustancias en ese estado disipan el exceso de energía emitiendo calor (como resultado de las colisiones entre moléculas vecinas) y sólo una minoría es capaz de emitir calor y radiación electromagnética, de distinta frecuencia a la absorbida, y que puede utilizarse con fines analíticos.

X + h ! X + Calor

! X + Calor + h

El proceso de emisión de radiación como consecuencia de la desactivación de una molécula se denomina genéricamente “Luminiscencia”, mientras que el término “Fotoluminiscencia” se refiere al caso particular en el que la excitación tiene lugar por absorción de fotones. Cuando la energía de excitación es de otro tipo, se originan otras modalidades de luminiscencia: Quimioluminiscencia, bioluminiscencia, etc.

La fotoluminiscencia puede clasificarse en función del mecanismo mediante el cual la sustancia vuelve al estado fundamental en:

• Fluorescencia

• Fosforescencia

Para que una sustancia origine emisión fotoluminiscente es necesario que previamente tenga lugar la absorción de radiación electromagnética.

La multiplicidad se define como M=2S+1, siendo S el número cuántico de spín de la molécula. Cuando M=1, se habla de estado singlete, es el estado energético mas bajo de la molécula (estado fundamental). Cuando un electrón pasa a un estado energético superior puede ocurrir que se conserve su spín o que se produzca un cambio en el valor de éste. En el primer caso tenemos un estado singlete excitado y en el segundo un estado triplete. Las transiciones del estado fundamental hasta el estado triplete son muy poco probables; normalmente es necesario pasar por un estado singlete excitado.

Superpuestos a cada nivel de energía electrónico existen una serie de niveles de energía vibracional estrechamente espaciados.

El proceso de emisión de un fotón desde el estado singlete excitado hasta el estado singlete fundamental recibe el nombre de Fluorescencia y ocurre inmediatamente después de la excitación, por lo que no es posible percibir visualmente la emisión de fluorescencia una vez eliminada la fuente de radiación.

Una vez adquirido el estado triplete, la molécula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos de relajación vibracional, y posteriormente emitir un fotón para retornar finalmente al estado fundamental. Esta emisión se denomina Fosforescencia.

Debido a que las transiciones entre estados de diferente multiplicidad están prohibidas, la emisión fosforescente se produce con un cierto retraso respecto a la absorción. Por ello, con frecuencia, puede ser observada a simple vista después de cesar la radiación de excitación.

Factores que afectan a la Fluorescencia

La emisión fluorescente observada en una determinada especie está condicionada por la propia estructura molecular de la sustancia y por otros factores dependientes del medio en el que se trabaje.

• Influencia de la estructura molecular.

El primer requisito para que exista fluorescencia es que la molécula posea una estructura capaz de absorber radiación ultravioleta o visible, esto es, que puedan tener lugar las transiciones !* y n!*. Se ha observado que el comportamiento fluorescente se presenta con más frecuencia en el primer tipo de transiciones, con lo que quedan virtualmente eliminados los compuestos orgánicos saturados. Las características de la emisión fluorescente de una molécula orgánica aromática están muy influidas por los sustituyentes; por ejemplo si en un anillo bencénico los sustituyentes son halógenos, se observa una disminución de la fluorescencia al aumentar el peso atómico del halógeno.

Un factor estructural importante es la rigidez, y se ha observado que la fluorescencia está favorecida en moléculas con una rigidez alta. El aumento de fluorescencia en ciertos agentes orgánicos cuando forman quelatos con iones metálicos parece también debido a un aumento en la rigidez molecular.

• Influencia del disolvente

Se observa que al aumentar la polaridad del disolvente se produce un desplazamiento en el espectro de fluorescencia hacia mayores longitudes de onda. En disolventes con átomos pesados normalmente se produce una disminución de la fluorescencia.

• Influencia del pH

El espectro de fluorescencia de muchos compuestos aromáticos conteniendo grupos funcionales ácidos o básicos es sensible al pH. Los cambios en la emisión de los compuestos de este tipo provienen del número de especies resonantes diferentes que están asociadas con las formas ácidas o básicas de la molécula. Estas formas resonantes proporcionan mayor estabilidad al primer estado excitado produciéndose la fluorescencia a una mayor longitud de onda.

• Influencia del oxígeno disuelto

Es uno de los problemas más molestos de las fluorimetrías, ya que a menudo reduce la intensidad de emisión de una disolución fluorescente debido a sus propiedades oxidantes y sus características paramagnéticas.

• Influencia de la temperatura

Se observa que existe una disminución de la fluorescencia al aumentar la temperatura debido al aumento de los choques entre moléculas que provocan la desactivación de éstas en forma de energía no radiante.

Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración.

La intensidad de fluorescencia If es proporcional a la concentración C según la ley de Beer:

T = P/P0 = 10-bc

La fracción de radiación absorbida es:

1 - P/P0 = 1 - 10-bc

La cantidad de radiación absorbida es:

P - P0 = P0( 1 - 10-bc)

La If está relacionada con la cantidad de radiación absorbida de la forma siguiente:

If = Kf(P - P0)

Siendo K una constante de proporcionalidad y f el rendimiento cuántico de la fluorescencia.

Para bajas concentraciones, cuando el término bc sea menor que 0.05, la expresión queda:

If = KfP02.3bc

Para disoluciones muy diluidas queda que:

If

C

A concentraciones relativamente altas, se pierde la linealidad.

Instrumentación

El equipo utilizado está formado por:

• Fuente de radiación: Tubo de descarga de Xenón.(lámpara continua)

• Monocromadores: Para elegir la longitud de onda tanto de emisión como de excitación.

• Celda de muestra: Suelen ser de cuarzo para permitir el paso de la radiación ultravioleta y con todas las caras transparentes, ya que las medidas se hacen a 90º.

• Detector: Los más utilizados suelen ser los tubos multiplicadores.

Espectros de excitación y de emisión.

Debido a la presencia de dos monocromadores pueden registrase dos tipos de espectros, el de excitación y el de emisión. El espectro de emisión aparece a longitudes de onda más largas que el de excitación. Debido a que los espaciados entre los niveles vibracionales son similares en el estado fundamental y en el excitado, el espectro de fluorescencia es aproximadamente una imagen especular del espectro de absorción. Para aplicaciones analíticas se usa el espectro de emisión, pero cuando se trabaja con un espectrofluorímetro se obtiene primero un espectro de excitación para confirmar la intensidad de la sustancia y seleccionar la longitud de onda para la emisión.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Material

- Matraces aforados

• Pipetas aforadas

• Vasos de precipitados

• Vidrio de reloj

• Porta sustancias

• Pipeta Pasteur

• Micropipeta

• Espectrofluorímetro Shimadzu

Reactivos

• H2SO4 18 M

• Sulfato de quinina dihidratada

Disoluciones

Partimos de H2SO4 18 M luego los ml de este ácido que necesitamos para preparar una disolución 0.05 M son:

M x V = M' x V'

18 M x V = 0.05 M x 1L

V = 2.78 ml

Nosotros realmente mediremos 3 ml con la ayuda de un dosificador, que los llevaremos hasta un volumen de 1000 ml en un matraz aforado; luego la molaridad de la disolución resultante será de 0.054 M.

Prepararemos 500 ml de una disolución de quinina de 100 ppm (mg/l)

Pesamos 60.3 mg del sulfato de quinina dihidratada y lo disolvemos con la ayuda del H2SO4 0.0054 M que hemos preparado anteriormente; posteriormente lo llevamos a un matraz de 500 ml y lo enrasamos.

3. Disolución de trabajo

A partir de la disolución madre de quinina prepararemos una disolución de trabajo de 10 ppm y a partir de ésta prepararemos disoluciones patrón de concentración conocida para realizar un calibrado y ver la linealidad de la fluorescencia con la concentración. Las concentraciones de las disoluciones patrón están comprendidas en un intervalo de entre 0.1 y 10 ppm.

-0.1 ppm : Se pipetea 1 ml de la disolución de trabajo y se lleva a un volumen de 100 ml.

-0.5 ppm : Se pipetean 2.5 ml de la disolución de trabajo y se llevan a un volumen de 50 ml.

-0.8 ppm : Se pipetean 4 ml de la disolución de trabajo y se llevan a un volumen de 50 ml.

-1 ppm : Se pipetean 2.5 ml de la disolución de trabajo y se llevan a un volumen de 25 ml.

-4 ppm : Se pipetean 10 ml de la disolución de trabajo y se llevan a un volumen de 25 ml.

-6 ppm : Se pipetean 15 ml de la disolución de trabajo y se llevan a un volumen de 25 ml.

-8 ppm : Se pipetean 20 ml de la disolución de trabajo y se llevan a un volumen de

25 ml.

Tomamos en un baso de precipitados una cantidad de muestra y la sometemos a un baño de ultrasonidos para desgasificarla, ya que las burbujas podrían provocar errores en las medidas al desviar la luz. Una vez que se ha desgasificado tomamos un mililitro y lo llevamos a un matraz de 25 ml que enrasaremos con ácido sulfúrico.

Medidas

Una vez que tenemos preparadas tanto los patrones como la muestra problema realizamos las medidas en el espectrofluorímetro. Para ello lo primero que hacemos es introducir los parámetros con los cuales va a trabajar el espectrofluorímetro:

Exc= 350 nm Emi = 450 nm

Después introducimos la disolución de ácido sulfúrico para marcar la referencia y posteriormente se mide la intensidad de emisión de las distintas disoluciones teniendo cuidado de limpiar bien la cubeta de muestra cada vez. Para todas las disoluciones se hacen tres medidas y obtenemos la media. Haremos las medidas de menor a mayor concentración para evitar efectos de tendencia; también se podría hacer aleatóriamente para evitar efectos de deriva.

La medida de la muestra problema la haremos al final para que los datos y la muestra tengan la misma variabilidad.

Resultados.

Con los datos que hemos obtenido hacemos un análisis de regresión lineal ajustando a una recta. Para que esta recta de calibrado sea buena, los residuales han de ser aleatorios e independientes.

Una vez que hemos obtenido la recta introducimos el valor de la intensidad de la muestra problema para calcular su concentración en quinina( esto lo hace la hoja de cálculo automáticamente)

El valor de la concentración de quinina que nos sale es de 2.9318 ± 0.376 ppm, por lo que, teniendo en cuenta la dilución inicial de 1/25, la concentración de quinina en la botella original de tónica es de 74 ± 7 ppm.

CONCLUSIONES

Este valor esta dentro de lo normal ya que este tipo de bebida suele tener una concentración en quinina de 80 ppm.

El valor de la concentración hubiera sido más exacto si la intensidad hubiera caído en el centro de la recta, pero de todas maneras el resultado es bueno.

BIBLIOGRAFÍA

• NOCIONES DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL.

Claudio González Pérez. Ed. Universidad de Salamanca. 1ª Edición. 1999.