1. INTRODUCCIÓ

L'aparició de la resistència bacteriana als antibiòtics comuns planteja una amenaça seriosa per a la salut humana i ha orientat l´interés dels investigadors cap als pèptids antimicriobians com a posibles substituts. Aquests són presents a les plantes i als animals, que presentan un arsenal de pèptids curts amb estructures diverses que són part del sistema immune natural. La característica comú entre aquests pèptids és la seva capacitat de formar conformacions anfipàtiques, compostes per una part catiònica (polar) i una part hidrofòbica (figura 1). Fins ara s´han identificat uns 500 d´aquests pèptids i les estructures de pràcticament tots corresponen a -hèlix (majoritàriament) o làmina-(estructures secundàries),pel que s´ha deduit que com més definida té el pèptid aquesta estructura, més actius són.

Molts organismes presentan dins els seus teixits una combinació de diversos pèptids de diferents classes que representan la primera i més ràpida defensa en front a microorganismes externs. Estudis estructurals han donat a conéixer com actuen aquests pèptids; primer la part catiònica s´encarrega de cercar les membranas bacterianes carregades negativament (degut als enllaços fosfodiéster entre els àcids dels lípids), després la part hidrofòbica interacciona amb la bicapa lipídica provocant la seva ruptura.

Degut a l´ampli espectre de possibilitats que donen aquesta gran quantitat de pèptits s´han invertit molts esforços en trobar estratègies per controlar la seva capacitat antimicrobiana. Així es va observar que aquesta capacitat depenia principalment de la sustitució d´un o múltiples aminoàcids de la cadena de la proteïna per un dels altres 19 aminoàcids naturals. A partir d´aqui es va a començar a treballar amb pèptids creats artificialment i es van obtenir uns resultants molt interessants. Es va observar que un d´aquest grups de pèptids “artificials” on s´havian incorporat residus fluorats es donava una estabilitat química i tèrmica major que en els altres pèptids no fluorats. Amb aquesta incorporació aumentaba també la capacitat hidrofòbica dels aminoàcids, cosa que provocaba un aument d´estabilitat de les estructures secundàries i quaternàries en dissolució aquosa si la superficie fluorada no polar es disposava lluny de l´aigua. A més es va observar que els pèptids fluorats presentaven una major afinidat per membranas i inclús diferenciaben entre oligòmers de membranas biològiques. Amb aquestes propiedats observades s´han intentat produir variants de pèptids amb una major potència i estabilitat front a proteases.

figura 1 : Planta d´un pèptid amb estructura secundària d´-hèlix on es distingeixen les parts hidrofílica i hidrofòbica del mateix

1.1 CLASSES DE PÈPTIDS ANTIMICROBIANS

Els pèptids antimicrobians es poden clasificar en dos grups segons la seva composició d´aminoàcids i a la seva estructura:

Un primer grup serien els pèptids antimicrobians aniònics, petits, rics en àcid glutàmic i àcid aspàrtic Són produïts en concentracions mil.limolars, requereixen Zn++ com a cofactor per a la seva activitat antimicrobiana i són actius contra bacteris gram negatiu i gram positiu (bacteris que difereixen entre ells en la pared cel.lular).

L´ altre grup, al qual pertanyen els pèptids amb els que es treballa en l´article, és el de pèptids catiònics. Són pèptids molts rics en lisina i arginina i tenen major efectivitat antimicrobiana quan adoptan estructures secundàries, en concret quan adoptan estructura d´-hèlix. Existeix també un altre subgrup de pèptids catiònics enriquits amb alguns aminoàcids, són molt rics en histidina i presenten una manca important de residus cisteina.

1.2 MECANISMES D´ACCIÓ ANTIMICROBIANA

L´acció antimicrobiana del pèptid sobre el bacteri es du a terme en tres passes concretes:

• Atracció per la cel.lula bacteriana

El mecanisme més directe és l´ unió electrostàtica de pèptids catiònics a components de la superfície bacteriana que presenten una càrrega neta negativa, degut als fosfolípids

aniònics i grups fosfats en bacteris gram negatiu, i àcids teïcoics a bacteris gram positiu.

• Unió a la pared bacteriana

Posteriorment, els pèptids que es troben en contacte amb la cèl·lula bacteriana, han de travessar el polisacàrid capsular (càpsula) per unir-se a la pared bacteriana des d´on actuaràn sobre la membrana plasmàtica formada per una bicapa lipídica (figura 2)

figura 2: estructura bacteri

• Inserció del pèptid i lisis de la membrana plasmàtica bacteriana.

S'han descrit tres models principals de possibles mecanismes per aconseguir la lisis de membranes per aquests pèptids:

En aquest model els pèptids units s'agreguen i s´insereixen a la bicapa i s´alineen de mode que les regions hidrofíliques quedan cap al lumen central (zones hidrofíliques en vermell i hidrofòbiques en blau al dibuix). Es forma així un porus transmembrana molt similar a un barril sense fons les parets del qual són els pèptids helicoïdals.

figura 3: model del barril sense fons

Al model de "porus toroïdal",els pèptids units s'agreguen i s´insereixen en la membrana i indueixen la monocapa de lípids a corbar-se a través del porus, de mode que les regions polars d'ambdues capes de la membrana arriben a unir-se. Així, les parets del porus queden formades pels caps polars dels lípids de membrana i per els pèptids inserits en ella.

figura 4: model del porus toroidal

En aquest darrer model, els pèptids s'acumulen a la superfície de la bicapa cobrint la

superfície de la membrana cel·lular com una carpeta. En altes concentracions aquests pèptids interrompen la continuitat de la membrana inserint-se en la membrana en paral·lel a la bicapa lipídica, mitjançant les seves regions hidrofòbiques. Les regions polars dels pèptids queden exposades a l'exterior, de manera que actuen de manera similar als detergents per a desintegrar finalment la membrana formant micel·les.

figura 5: model de la “carpeta”

S´ha observat una altre mode d´actuació dels pèptids antimicrobians que consisteix en interferir a la síntesi d´enzims metabòlics o àcids nucleics però el procés d´actuació no està massa estudiat encara.

2 PROCÉS EXPERIMENTAL

2.1 INTRODUCCIÓ

En aquest experiment es demostra que els derivats fluorats de dos pèptids antimicrobians, “BUFORIN” i “MAGAININ”, presentan una moderada variació de les seves propietats , aumentant significativament la seva activitat bacteriostàtica. Quatre pèptids fluorats anàlegs al buforin i dos al magainin es preparan (figura 6 ) i s´ analitza:

(1) la seva capacitat de resistència hidrolítica a la divisió per la tripsina, que és una proteasa comercial.

(2) la seva activitat antimicrobiana contra dos bacteris Gram-positiu i Gram-negatiu.

(3) La seva activitat hemolítica o el que és el mateix, capacitat per rompre la pared bacteriana..

figura 6 : Pèptids originals i els seus anàlegs fluorats. La fluoració es duu a teme per sustitució d´aminoàcids. Per exemple leucina per hexafluoroleucina(L) . Entre parèntesi s´indica la càrrega neta del pèptid que ens influeix en la capacitat d´atracció del pèptid per la membrana de la bacteria (carregada negativament). Els pèptids presentan diferents grups funcionals a un dels seus extrems (un àcid carboxílic i l´altre amida) degut a la resina utilitzada en cada casa per la seva síntesi.

2.2 EXPERIMENT

Material:

En primer lloc es compran diferents reactius a diferents llocs:

- Laboratori “Novabiochem” : dues resines, una Merrifield per sintetitzar el Buforin (figura 7) i una MBHA (p-metilbenzhidrilamina) (figura 8)per la síntesi del Magainin , una serie d´aminoàcids ja units al grup protector BOC i un compost d´hexafluorofosfat per fluorar la leucina.

- Laboratori Laboratori “Matheson”: àcid fluorhídric

- Laboratori “Sigma”: Melittin (pèptid present a la mel de les abelles que catalitza l´hemòlisis dels globuls vermells humans), tripsina (procedent del pàncrees d´una vaca) i composts d´arginina.

- “Research blood components L.L.C.”: Glòbuls vermells humans tipus B (tipus d´antígen tipus B)

- També s´utilitzan altres reactius dels que ja es disposaven als laboratoris, com per exemple el DCC o el TFA.

figura 7 : Explicació de com es forma un pèptid mitjançant la resina de Merrifield. Un aminoàcid protegit amb t- butiloxicarbonil (t-BOC) s´uneix a la resina per l´extrem lliure. Seguidament es desprotegeix amb àcid trifluoroacètic (TFA) per facilitar l´unió d´un segon aminoàcid també protegit, en una reacció d´acoblament catalitzada per dicicloexilcarbodiimida (DCC). Aquestes estapes es repeteixen fins a conseguir el pèptid que volguem . La darrera etapa seria l´alliberament de la resina, que es donaria en condicions àcides per donar un pèptid amb un extrem carboxilat que es protonaria ràpidament a carboxílic.

figura 8 : Resina de MBHA. Actua de forma anàlega a la resina de Merrifield En aquest cas es forma l´amida degut a que en la darrera etapa es desprèn l´amina de la reina que reacciona amb l´àcid carboxílic de l´extrem del pèptid per donar l´amida tal i com es veu al mecanisme 1

mecanisme 1: Formació de una amida a partir d´un àcid carboxílic i una amina

Una vegada adquirit tot el material necessari, sintetitzam els pèptids mitjançant les resines. Per separar-los de la resina s´utilitzan a l´experiment HF/anisol (metoxibenzè) (90/10) a 0 ºC durant 2 hores, i s´obté el pèptid per precipitació amb Et2O fred . Ara s´obrin tres camins de treball:

Activitat antimicrobiana: S´utilitzan per aquest experiment bacteris Gram-negatius d´Escherichia coli i Gram- positius de Bacillus subtilis obtinguts prèviament als laboratoris mitjançant cultius. En aquest apartat de la pràctica l´objectiu es determinar la concentació mínima inhibitòria (MIC), que es defineix com a la concentració mínima de pèptid antimicrobià necessari per frenar el creixement bacterià, mitjançant assaigs turbimètrics.

Assaig d´hemòlisis: . La capacitat dels pèptids de interrompre l´integritat de les membranas s´investigan amb un experiment d´hemòlisi front glòbuls vermells humans. S´utilitza en l´experiment un pèptid, melittin, que prové de la mel de les abelles i que catalitza la reacció d´hemòlisi.

Estabilitat dels pèptids front la proteasa: Una de les majors limitacions de la funció antimicrobiana és l´inactivació dels pèptids per proteases. En aquest experiment s´analitza l´estabilitat proteolítica dels pèptids front a la tripsina mitjançant un assaig analític en RP-HPLC (cromatografía líquida d´alt rendiment). Per facilitar la reacció s´incuban els pèptids amb tripsina a 37 ºC durant 3 hores. La tripsina catalitza l´hidròlisi dels C terminals de l´amida de lisina i arginina (figura 9) que són els dos aminoàcids més abundants als pèptids antimicrobians catiònics com s´ha dit anteriorment a l´apartat 1.1. aquesta és la principal raó per la qual aquesta enzima és ideal per l´estudi d´aquest paràmetre.

figura 9: Lisina i arginina en aquest ordre.

2.3 RESULTATS

Lloc de fluoració i mode d´actuació dels pèptids: Tot i que els dos pèptids antimicrobians triats per l´experiment, Buforin II (BII) i magainin II (M2) presenten baixes MIC (concentació mínima inhibitòria), els seus modes d´actuació són diferents. Ambdues atreuen electrostàticament les membranas dels bacteris però el M2 provaca la lisis cel.lular formant porus toroidals (figura 4) a la bicapes lipídiques mentre que el BII penetra dins la cel.lula i mata la bacteria atacant l´RNA i el DNA en dos processos controlats per les intraccions hidrofòbiques. Es comparen les propiedats d´aquests peptids amb els seus anàlegs fluorats. La fluoració es va dur a terme de forma selectiva sobre les cares no polars de les hèlix ,que es la conformació que adoptan majoritariament aquest tipus de pèptids com he dit anteriorment. Aquesta part no polar depen de la situació dels residus a l`hèlix i per tant varia entre els diferents pèptids. Per distingir les parts no polars de l´hèlix hem d´observar els diagrames helicoidals de roda (helical wheel diagram)(figura 10):

figura 10: Diagrames de roda dels pèptids: Al buforin (A) les Leu 18 i 19 són substituides per hexafluoroleucina per obtenir tots els anàlegs fluorats de la buforin . Al magainin (B) els residus de Leu 6 i Ile 20 són substituits per donar M2F2 i els residus de Leu 6, Ala 9, Gly 13, Val 17 i Ile 20 per donar M2F5

Activitat antimicrobiana: Aquesta activitat s´ evalua com a concentració inhibitòria mínima (MIC) contra bacteris Gram-positiu i negatiu con he dit anteriorment. Tots els pèptids fluorats donan una activitat antimicrobiana major o similar als seus parents sense fluorar excepte un, el M2F5.

Tres dels quatre anàlegs fluorats del buforin aumentan la seva potència antimicrobiana i disminueixen els seus valors de MIC considerablement front als dos bacteris, excepte el BII5F2 que presenta la mateixa activitat que el seu parent no fluorat (taula 1) .

En quant a la magainin, el M2F2 dóna iguals valors de MIC que el M2 mentre que el M2F5 dóna menys activitat antimicrobiana tant en l´E. coli com a la B. subtilis.

Taula 1: comparació de MICs entre els diferents pèptids i valors de concentració de pèptid per intuir la lisis del 50% dels globuls vermells de la mostra (HC50)

L´estudi sugereix que els pèptids més actius presenten MICs efectius en un interval d´1-3 µM. Degut a això no sorprèn que anàlegs fluorats com BIIF5 o M2F5 presentin igual eficàcia que el pèptids sense fluorar ja que s´entén que aquests estan operant en uns valors de concentració límits. Aleshores, una controlada i selectiva fluoració de pèptids antimicrobians coneguts pot ser una potent eina per lluitar contra infeccions bacterianes substituint inclús antibiòtics als quals les bacteries oposen resistència.

Per finalitzar, just s´ha trobat una raó per la qual l´M2F5 és l´únic pèptid que perd propietats antimicrobianes, és que forma bucles helicoidals en dissolució.

Activitat hemolítica i hidrofobicitat: S´observa a l´estudi que tots els buforin presentan igual concentració d´ HC50 front a glòbuls vermells humans que ens indica la nul.la activitat hemolítica d´aquests pèptids, mentre que en els magainin la seva capacitat hemolítica va aumentant (menor concentració) a mesura que la fluoració del pèptid és major (taula 1). Aquest darrer paràmetre està totalment relacionat amb el mecanisme d´actuació dels pèptids sobre els bacteris i amb l´hidrofobicitat:

• Mecanisme d´actuació: Els BII no provoca lisis cel.lular sino que s´intrudueix en ella per processos de permeabilització i , per tant, aquest paràmetre ,HC50, no es veu compromès. En canvi els M2 provoca lisis cel.lular via porus toroidals i el paràmetre varia amb la fluoració del pèptid.

• Hidrofobicitat: S´observà a experiments previs al que ens ocupa que l´increment d´hidrofobicitat del pèptid està relacionat amb la capacitat hemolítica del mateix. La relació que s´establia era que en introduir l´hexafluoroleucina al pèptid es veia incrementada l´hidrofobicitat del pèptid i també la seva capacitat hemolítica. Per tant, la M2F5 presenta una hibrofobicitat major que M2 i M2F2 i també una major capacitat de lisis.

Estabilitat front proteases: De forma general, els pèptids fluorats presentan major estabilitat front la tripsina. El mecanisme pel qual l´introducció de l´hexafluoroleucina varia l´estabilitat front proteases requereix unes investigacions més detallades. Es pensa que pot estar relacionat amb l´ impediment estèric degut a l´increment de volum que presenta l´aminoàcid fluorat o la perturbació electrònica dels enllaços de l´ amida. La combinació d´aquests dos factors podria donar lloc a una oclusió de la zona activa del pèptid, on ataca la proteasa, donant com a resultat una resistència major cap a la mateixa. És el que pareix que passa en el cas de la M2F5 ja que presenta una conformació que fa molt complicada l´aproximació de la proteasa a la zona activa del pèptid.

Dicroisme circular: En el transcurs de l´estudi s´ha intentat determinar també l´influència de la fluoració sobre la formació de l´estructura secundària del pèptid en una dissolució d´aigua/TFE (dissolvent que imita el comportament no polar de les membranas). Tots els pèptids excepte el M2F5 no presentan estructura fins que s´incrementan les concentración de TFE. Aleshores els pèptids, tant buforin con magainin, adoptan l´estructura d´-hèlix. S´extreu d´aqui informació per ambdós pèptids:

• Buforin: En aquest cas es dedueix que els alts continguts d´estructura d´-hèlix estan estretament relacionats amb la potència antimicrobiana del pèptid.

• Magainin: Observant la gràfica es veu que al 50 % de TFE el contingut helicoidal (“helical content”) es pràcticament igual (aprox. 60%) però quan al 0 % de TFE, el M2F5 es desmarca dels altres i presenta més del 40 % de contingut helicoidal. Es necessitan molts més estudis per explicar detalladament aquest comportament però sembla que està relacionat amb els bucles helicoidals que forma aquest pèptid en dissolució aquosa i que també es relacionaria amb el descens d´activitat antimicrobiana i aument d´activitat hemolítica i d´estabilitat front a la proteasa del M2F5