PRÀCTICA 1

OBSERVACIÓ EN FRESC

1.- Objectiu

L'objectiu d'aquesta pràctica és observar la forma dels germens, la seva associació i la seva mobilitat, ja que aquests germens estan vius.

2.- Protocol

• utilitzarem el método de la cambra humida, que consisteix en lo seguent:

• agafem un portaobjectes i posem al seu damunt una gota d'aigua destil·ladao o solució salina estèril.

• Flamejem la nansa de sembra, agafem mostra i fem una mena d'emulsió (remenem) amb la gota d'aigua.

• Un cop feta aquesta emulsió, tornem a flamejar la nansa de sembra i posem un cobreobjectes damunt de la goteta. HEM DE VIGILAR QUE NO SE'NS FORMIN BOMBOLLES D'AIRE.

• Aquesta preparació durará poc perqué la lampara del microscopi va donant escalfor i per tant evapora la mostra que hem posat.

3.- Resultats i conclusions

El que més podriem veure serien cocs, peró també podriem veure coc-bacils peró molt pocs, i bacils.

En els cocs la forma més abundant de agrupació seria amb forma de estreptococs, per tant, formant una mena de cadeneta.

PRÀCTICA 2

TINCIÓ SIMPLE

1.- Objectiu

Es tracta de realitzar una tinció que el que conseguirá será fer augmentar el contrast de la preparació. Els colorants que podrem utilitzar son:

• Violeta de Genciana

• Blau de metilé

• Fucsina básica diluïda

• Safranina

3.- Protocol

• Realitzem una extensió: posem una goteta d'aigua al portaobjectes i una goteta de mostra i amb la mateixa nansa i ho extenem cap als costats.

• Sequem amb un secador o amb calor suau a la flama

• Fixem la preparació tallant la flama tres vegades

• Tenyim:

• violeta de genciana---- 1 minut

• fucsina básica diluïda-- 2-3 minuts

• blau de metilé--------- 3-5 minuts

• Rentem amb aigua destil·lada

• Sequem i observem a 1000X per immersió

4.- Resultats

En aquesta pràctica també podrem veure la morfologia peró en aquest cas no es podriem moure ja que estarien morts. En aquesta preparació guanyariem que el contrast augmentaria i també podriem veure alguna estructura interna o externa dels germens (si s'han pogut tenyir).

PRÀCTICA 3

PREPARACIÓ DE UN MEDI DE CULTIU PER A TUBS INCLINATS

1.- Objectiu

El medi de cultiu, és un conjunt de substàncies que facilitarán el creixement de germens.

2.- Protocol

• Distibuir el material per preparar el medi per tubs inclinats i mesurem la quantitat de medi solid que haurem de rehidratar.

• Mesurem el volum d'aigua destil·lada

• Ho mesclem en un recipient per poder-lo escalfar (erlenmeyers o vasos de precipitats- per tubs) fins que començi a bullir (per tubs).

• Repartim 5ml per tub, amb tap de rosca.

• Ho esterilitzem.

• Tal i com surt de l'autoclau, els deixarem refredar, pero baix de aquests tubs hi posarem una vareta de vidre de forma que quedaran una mica inclinats, per tant el medi es solidificara amb una mica de inclinació.

3.- Resultats i conclusions

Aquest medi que hem preparat serien L'agar nutritiu i l'agar levine perqué aquests són els que es deixen reposar i solidificar en superficie inclinada.

PRÀCTICA 4

TINCIÓ DE GRAM

1.- Objectiu

En aquesta tinció intentarem diferenciar dos tipus de bacteris que tindrán unes característiques de color diferent, podrem diferenciar els gram + i els gram -.

3.- Protocol:

• Fem una extensió de aigua i mostra

• Sequem amb calor suau, ha de quedar ben sec

• Fixem, tallem la flama 3-4 vegades

• Cubrim la preparació amb violeta de Genciana i ho deixem actuar durant 1 minut, després rentem amb aigua per treure l'excés de colorant

• Afegim lugol, ho deixem durant 1 minut i tornem a rentar amb aigua destil·lada

• Decolorem:

• amb alcohol de 76º

• alcohol + acetona ( 7 alcohol/ 3 acetona)

l'efecte és el mateix, i deixem 30 segons. Decolorem tres vegades consecutives, durant 10 segons cadascuna.

• Tornem a rentar amb aigua destil·lada

• Cubrim amb safranina (rosa), deixem actuar 1 minut, rentem amb aigua destil·lada. També rentarem la preparació per la part de baix

• Sequem amb calor suau i observem a 1000X, amb oli d'immersió.

4.- Resultats

Els bacteris gram positius tenen una paret gruixuda de glucopéptids (peptidoglicá)

Els bacteris gram negatius tenen varies capes de glucopéptids (més prima) per fora i solen haber-hi una capa de lipopolisacárids i proteïnes

El lugol no és un colorant, sinó un mordent, que és una substància que reforça l'efecte del colorant anterior. De vegades el conjunt de violeta + lugol, s'anomena COLORANT DE GRAM. deixem 1 minut i tornem a rentar amb aigua destil·lada.

Quan decolorem, hi ha germens als quals el colorant no se'ls treu, aquests són els gram positius, ja que resisteixen l'acció de decoloració de l'alcohol, gracies a la capa gruixuda. En cambi, n'hi ha uns altres, que l'alcohol sembla que perfore la paret, aquests són els gram negatius, ja que al perforar aquesta paret, s'extreu el colorant.

El violeta és més concentrat que la safranina, per tant tot el que estigui tenyit d violeta, no es tenyirá de safranina.

PRÀCTICA 5

TINCIÓ NEGATIVA

1.- Objectiu

Intentarem observar la morfologia del germen, transparent respecte al fons, que quedará colorejat. La ventatja que té, és la rapidesa sense fixació. Els inconvenients que té és que la preparació conté germens vius i per tant és infectiva.

3.- Protocol

• Agafem un portaobjectes, i en un extrem agafem una o dos vegades la nansa, posem també una goteta d'aigua i fem una pepita emulsió.

• Afegim negrosina (una gota) damunt de les dues mostres de nigrosina, amb la mateixa nansa, fem una mica d'emulsió.

• Agafem un altre portaobjectes i fem una mena de frotis sanguini. Ho deixem secar i ho observem per immersió.

4.- Resultats

Podrem veure la forma dels germens i també el seu agrupament.

En cambi, no podrem observar la seva mobilitat, perqué és una preparació completament seca.

PRÀCTICA 6

TINCIÓ DE GRAM

1.- Objectiu

En aquesta tinció intentarem diferenciar dos tipus de bacteris que tindrán unes característiques de color diferent, podrem diferenciar els gram + i els gram -.

3.- Protocol:

• Fem una extensió de aigua i mostra

• Sequem amb calor suau, ha de quedar ben sec

• Fixem, tallem la flama 3-4 vegades

• Cubrim la preparació amb violeta de Genciana i ho deixem actuar durant 1 minut, després rentem amb aigua per treure l'excés de colorant

• Afegim lugol, ho deixem durant 1 minut i tornem a rentar amb aigua destil·lada

• Decolorem:

• amb alcohol de 76º

• alcohol + acetona ( 7 alcohol/ 3 acetona)

l'efecte és el mateix, i deixem 30 segons. Decolorem tres vegades consecutives, durant 10 segons cadascuna.

• Tornem a rentar amb aigua destil·lada

• Cubrim amb safranina (rosa), deixem actuar 1 minut, rentem amb aigua destil·lada. També rentarem la preparació per la part de baix

• Sequem amb calor suau i observem a 1000X, amb oli d'immersió.

4.- Resultats

Els bacteris gram positius tenen una paret gruixuda de glucopéptids (peptidoglicá)

Els bacteris gram negatius tenen varies capes de glucopéptids (més prima) per fora i solen haber-hi una capa de lipopolisacárids i proteïnes

El lugol no és un colorant, sinó un mordent, que és una substància que reforça l'efecte del colorant anterior. De vegades el conjunt de violeta + lugol, s'anomena COLORANT DE GRAM. deixem 1 minut i tornem a rentar amb aigua destil·lada.

Quan decolorem, hi ha germens als quals el colorant no se'ls treu, aquests són els gram positius, ja que resisteixen l'acció de decoloració de l'alcohol, gracies a la capa gruixuda. En cambi, n'hi ha uns altres, que l'alcohol sembla que perfore la paret, aquests són els gram negatius, ja que al perforar aquesta paret, s'extreu el colorant.

El violeta és més concentrat que la safranina, per tant tot el que estigui tenyit d violeta, no es tenyirá de safranina.

PRÀCTICA 7

TINCIÓ DE CÀPSULES

1.- Objectiu

És tracta de tenyir el germen, el fons de la preparació i entre el germen i el fons, veurem la cápsula de manera transparent ( si hi ha càpsula).

3.- Protocol:

• Fem una extensió del germen patógen + aigua.

• Sequem

• No fixem la preparació

• Tenyim amb safranina o fucsina diluïda (2-3 minuts)

• Rentem amb aigua destil·lada

• Posem una gota de negrosina en un extrem del portaobjectes i amb un altre portaobjectes, realitzem un frotis.

• Sequem amb calor suau

• Observem amb l'objectiu d'immersió, és a dir, a 1000 X.

4.- Resultats

Les cápsules són una mena de capa externa al germen, d'aspecte gelatinas, que té un gruix variable, i es troba al voltant de la paret cel·lular.

Está formada basicament de mucopolisacárids i la seva tinció, sol ser dificultosa.

PRÀCTICA 8

TINCIÓ D'AAR: ACID-ALCOHOL RESISTÉNCIA

1.- Objectiu

Es tracta d'una tinció que ens serveix per diferenciar que resistiesen la decoloració amb una mescla d'àcid-alcohol. Aquesta decoloració és realitza amb alcohol clorhídric.

3.- Protocol:

• Fem una extensió del germen patógen + aigua.

• Sequem amb calor suau.

• Fixem, tallem la flama 6 vegades.

• Tenyim:

- 1r colorant: fucsina fenicada a emisió de vapors 8-10 minuts. Posem al damunt del portaobjectes un trosset de paper i tirem el colorant damunt. Aixó evita que hi hagi molt de precipitat del colorant i també evita que la preparació es quedi seca completament.

• Rentem la preparació amb aigua i tirem el paper de filtre.

• Decolorem amb alcohol-clorhídric 20-30 segons.

• Tornem a rentar amb aigua destil·lada.

• Contratenyim, per tenyir aquells que no hagin resistit la decoloració amb alcohol clorhídric. Aquesta contratinció es realitza amb blau de metilé i es deixa actuar durant 5 minuts.

• Tornem a rentar amb aigua les dues parts de la preparació.

• Sequem amb calor suau.

• Observem per immersió a 1000 X

4.- Resultats

Els germens que resisteixen la decoloració, son de la familia del mycobacteris:

• mycobacterium sp.

• mycobacterium tuberculosi bacil de Koch

• mycobacterium leprae bacil de Hansen

Tots aquests mycobacteriums, són resistents a tenyir-se i també a l'hora de decolorar-los, aixó se puposa que és per la composició que té la paret bacteriana, ja que tenen una alta quantitat de lípids i per tant són més impermeables.

Per tenyir-los cal forçar la tinció amb calor, o afegint alguna substància que disminueixi la resistencia de la paret o bé augmente el temps de tinció.

Per realitzar l'emisió de vapors, hem de fer-ho de la seguent forma:

• agafem una vareta de vidre i cotó i fem una boleta a la punta.

• Mullem amb alcohol la punta de la vareta

• La flama de la vareta ha de passar per sota les preparacions per cremar-les. En el moment que comença a surtir vapor, apartem la flama evitant que bulligue.

• Quan deixi de surtir vapor, ho repetim tres cops. Si la preparació s'asseca, afegim fucsina. Així forcem la tinció.

PRÀCTICA 9

TINCIÓ D'ESPORES

1.- Objectiu

Aquestes espores tenen unes cobertes o caps que són molt impermeables,per tant si les volem tenyir hem de recòrrer a métodes dràstics (forcem la tinció) així que utilitzarem colorants molt concentrats o tenyirem a emisio de vapors.

3.- Protocol:

• Fem una extensió

• Sequem amb calor suau

• Fixació. Tallem 8-10 vegades la flama

• Tenyim amb verd de malaquita, també posem un paper de filtre per minimitzar la precipitació de colorant i evitar que no s'evapore ràpid el colorant. Escalfem fins a emisió de vapors (3-4 vegades).

• Rentem amb aigua i extreiem el paper

• Afegim un colorant de contrast, que és la fucsina diluïda o safranina, i la deixem actuar durant 3 minuts.

• Rentem amb aigua destil·lada

• Sequem

• Observem per immersió a 1000X.

4.- Resultats

L'espora és una forma de resistencia, tenen una morfologia rodona i allargada, per tant es poden confondre (quan están lliures) amb els cocs-bacils. Poden tenir una situació Terminal, subterminal o central (normalment esporulen els bacils, els cocs no poden esporular), aquestes espores també poden ser deformants o no deformants.

Quan aquestes espores están dins del bacil, s'anomenen ENDOSPORES i quan les espores están lliures, s'anomenen EXOSPORES.

Si el cultiu és Jove, veurem poques espores lliures, peró si el cultiu és envellit veurem moltes exospores.

Hauriem de veure espores tenyides amb el verd de malaquita i els bacteris i bacils quedarán tenyits amb el rosat o roig de la fucsina o safranina. Les espores no es poden tenyir ni amb la fucsina ni amb la safranina.

No hem vist cap espora, per tant haurem de tornar a sembrar els cultius i repetir la práctica per poder-ne veure. Podriem dir que el que veurem serien bacils, pero tampoc no ho podriem afirmar.

PRÀCTICA 10

VIABLES EN PLACA

1.- Objectiu

Tenim una mostra, i aquesta es suposa que té germens el que ens interessa saber és quants germens hi ha en aquesta placa, per fer-ho trobem dos métodes:

3.- Protocol:

A) recompte amb un medi de cultiu sólid.

• Tenim una mostra i tubs. Posem 4 ml de solució salina en cada tub.

• Per un altre costat, tenim plaques de petri amb un medi sólid preparat, per cada dilusió tindrem tres plaques.

• Agafem 100 microlitres de la dilución tirar-ho a la placa. Després ho escampem amb una nansa de digralski

• Ho posem a incubar durant 18-24 hores.

• Llegim els resultats. Agafem una serie de plaques que tinguin entre 30i 300 colónies i comptem els germens a la lupa. Comptarem la dilució 1/5

recompte amb un medi de cultiu líquid al principi.

• preparem una série de tubs amb solució salina estéril (3-4) peró la mateixa quantitat a tots (9ml).

• Agafem mostra i posem 1ml de la mostra al primer tub, després l'homogenitzem.

• Passem 1ml del primer tub al segon tub i també homogenitzem.

• Passem 1ml del sego tub al tercer tub i també homogenitzem, aixó ho fem amb tots els tubs.

• Al mateix temps tenim tubs preparats amb medi de cultiu estéril i tal i com surten de l'autoclau els mantenim líquids al bany maria (55-60ºC).

• De cada dilució preparada, necesitarme tres tubs amb el medi de cultiu estéril, encara líquid (hem de tenir en compte que cada cultiu ha de tenir 9 o 10 ml)

• Agafem 1ml de la dilució per cada medi, el remenem i ho aboquem en una placa

• També comptarem la série de plaques que es situe entre 30 i 300 colónies en cada una d'elles.

4.- Resultats

Els germens que resisteixen la decoloració, son de la familia del mycobacteris:

• mycobacterium sp.

• mycobacterium tuberculosi bacil de Koch

• mycobacterium leprae bacil de Hansen

Tots aquests mycobacteriums, són resistents a tenyir-se i també a l'hora de decolorar-los, aixó se puposa que és per la composició que té la paret bacteriana, ja que tenen una alta quantitat de lípids i per tant són més impermeables.

Per tenyir-los cal forçar la tinció amb calor, o afegint alguna substància que disminueixi la resistencia de la paret o bé augmente el temps de tinció.

Per realitzar l'emisió de vapors, hem de fer-ho de la seguent forma:

• agafem una vareta de vidre i cotó i fem una boleta a la punta.

• Mullem amb alcohol la punta de la vareta

• La flama de la vareta ha de passar per sota les preparacions per cremar-les. En el moment que comença a surtir vapor, apartem la flama evitant que bulligue.

• Quan deixi de surtir vapor, ho repetim tres cops. Si la preparació s'asseca, afegim fucsina. Així forcem la tinció.