Compuestos aminonitrogenados: peptonas, extractos, infusiones, etc...Los microorganismos no suelen tener enzimas extracelulares con las que hidrolizar las proteínas para obtener nitrógeno, por ello es necesario suministrar extractos ya hidrolizados.

Peptonas: hidrolizado proteico fuente de nitrógeno. Se obtiene de diferentes formas, por hidrólisis enzimatica o por hidrólisis ácida, las dos formas dan resultados distintos. Las peptonas no son útiles para pruebas de identificación o caracterización por que poseen restos de azucares que podrían dar falsos positivos.

Extractos de carne, malta, levadura..: el de levadura es el mas usado porque tiene vitaminas factores de crecimiento vitaminas y es fuente de N.

Factores de crecimiento: sangre, suero, vitaminas, NADH, metales traza, aminoácidos,.... Hay que tener cuidado por si fuesen termolábiles, ya q no se podrían esterilizar en autoclave. También se usan como agentes protectores contra ciertos microorganismos.

Fuentes de energía: generalmente glucosa.

Sales tamponadas: citratos, acetatos, fosfatos, etc...para estabilizar el pH del medio.

Sales minerales y metales: sulfatos, fosfatos, Ca, Fe, Mn, Mg, metales traza. Suelen ser contaminantes de otros compuestos. Se añaden especialmente cuando queremos detectar determinada actividad.

Componentes especiales, agentes selectivos: son reactivos químicos, antibióticos, colorantes, inhibidores... para hacer medios selectivos o para identificar algún microorganismo, etc...

Indicadores colorimétricos: indican el cambio de pH del medio durante el crecimiento y al final.

Agentes solidificantes: agar, gelatina, alginatos, solidifican el medio. El mas usado es el agar: 2% para levaduras, 1'5% para bacterias y hongos, y 1-0'75% para pruebas de movilidad de bacterias.

Clases de medios:

Medios generales o comunes: medios que permiten el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos.
Medios enriquecidos: son similares a los generales pero se les añade algún factor de crecimiento o suplemento de algún tipo.

Medios de enriquecimiento: son los que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo frente al resto en una población mixta.

Medios selectivos: permiten el crecimiento de ciertos microorganismos impidiendo que crezcan otros (TCBS para Vibrio).

Medios diferenciales: se usan para identificar microorganismos.

Medios mantenimiento y conservación: para conservar al microorganismo durante un gran periodo de tiempo.

Congelación: a -80ºC. Los medios tiene concentraciones bajas de azucares y se suplementa con glicerol para evitar la formación de cristales de hielo. Se usan tubos eppendorff o criotubos.
Las levaduras se conservan en agua a 4ºC en tubos con medio SLAM. Se añade parafina encima para producir anaerobiosis y proteger a las células.
Liofilización: consiste en congelar y desecar la muestra.

Los medios los venden casi preparados, normalmente hay que disolverlos y esterilizarlos, si el medio lleva agar hay que hervirlo para que se disuelva y posteriormente autoclavarlo, esto cuando se distribuye en tubos.

Métodos de esterilización.

Calor húmedo:

Autoclave: 12ºC durante 15 minutos. El medio queda libre de microorganismos y esporas. No se puede usar con medios con elevadas concentraciones de azucares ya que estos caramelizan.
Tindalización: tres ciclos de 100ºC que permiten el desarrollo de esporas entre dos ciclos sucesivos de modo que pueda acabar con ellas.

Filtración: se usa con compuestos termolábiles. Las membranas de 0'22 micras son amicróbiocas, las de 0'45 permiten el paso de bacterias pero no de hongos ni levaduras.

Calor seco: en cabinas y hornos a altas temperaturas. Son ciclos de 170ºC durante 90 minutos. Se usa para el vidrio.

Agentes químicos: el material plástico de polietireno viene esterilizado por agentes químicos. Como el oxido de etileno liquido que no deja residuos.

Radiaciones UVA y radiaciones gamma: las primeras esterilizan superficies las segundas se usan para medicamentos o productos que se vayan a envasar.

Tema 2.

Aislamiento y cultivo de muestras.

Tipos de cultivo:

Puro o axenico: procede de una sola célula.
Mixto: por mas de una población.
Bimembre: por un microorganismo que necesita, para vivir, el que nosotros estudiamos. Por ejemplo el cultivo de fagos necesita un césped bacteriano para desarrollarse.

Los medios mas usados son:

Para bacterias: TSA, TSB. Agar sangre y agar nutritivo.
Para levaduras: YEPD, agar saboureau y agar malta.
Para virus: céspedes celulares.

Tipos de siembra:

En placa por extensión:
En placa por estrías:
Por vertido en placa: se siembran 100microlitros de la muestra y sobre esta el medio de cultivo, después se autoclava. El crecimiento es dentro del medio.
Replicador multipunto: permite siembra diferentes cepas en una misma placa. Se usa para pruebas de identificación.
Por aislamiento en estría:
En medio liquido.

Los hongos se cultivan en cámaras húmedas.

Métodos de cuantificación.

Cuantificación por cámara: puede ser una cámara Thoma o Neubauer. Una cámara Thoma esta dividida en 16 partes cada una dividida a su vez en 16 subunidades, en ella se meten 10-4 ml para el recuento. En una cámara de Neubauer también hay una primera división en 16 partes pero cada una de ellas esta dividida en 25 subunidades, también aquí se cargan 10-4 ml. Para hacer los cálculos de nº de cs por ml ver practicas.

Test de opacidad: se usan unos tubos de referencia, tubos de McFarland, enumerados del 1 al 5 o del 1 al 8 de turbidez internacional que tienen diferente opacidad, el calculo se hace por comparación entre nuestra muestra y el tubo correspondiente.

UFC: método que se realiza mediante siembra por extensión en placa. Se hacen diluciones seriadas, de estas se hacen recuentos en cámara Thoma para escoger la dilución que ver practicas.

Membranas de filtración: se filtra el cultivo y se siembra el filtro sobre el medio. Se usan cultivos poco concentrados.

Epifluorescencia directa: se filtra el cultivo a través de una membrana y las cs que quedan atrapadas se tiñen con naranja de acridina para poder observarlas al microscopio de epifluorescencia.

Coulters: son aparatos que miden el flujo de partículas.

Técnica del numero mas probable (NMP): se usa para medir coliformes en muestras. Se siembra la muestra en una batería de tubos que se hace por triplicado. Estos se incuban a 35ºC 24 horas y después se lee cada disolución, hay que ver cuantos tubos fueron positivos en cada batería de tubos y teniendo en cuenta los positivos de cada dilución, hecha por triplicado, se va a una tabla.

Tema 3.Técnicas de microscopia y preparación de muestras.

Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:

Descripción de microorganismos en base a su morfología, estructura y distribución.

Detección de determinados microorganismos para diagnostico clínico, por ejemplo.

Clasificación de microorganismos según sus características tintoriales.

Tipos de colorantes:

Ácidos:

En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas positivamente y no las células, que tienen carga negativa.
Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida...

Básicos:

En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las células.
Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o carbol-fucsina...

Características de un cultivo para una buena tinción:

Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.

Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser necesario usar un cultivo liquido.

Preparación de un frotis:

Suspensión de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua.

Extensión de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.

Secado al aire.

Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la llama rápidamente.

Tipos de tinciones:

Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se suplementan con un mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar el grosor de algunas estructuras para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las agrupaciones que forman los microorganismos entre ellos y con otras células.

Diferenciales. Se usa mas de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de distintas especies.

Tinciones simples y diferenciales:

Tinciones simples:

tinción negativa: se usa un colorante ácido, nigrosina o tinta china, que no entra en la célula de modo que estas no se observan teñidas, lo que se ve de color es el fondo.

Frotis.
Secado al aire
Colorante.
Visionado a 100X

tinción básica: se usa azul de metileno que si tiñe a las células.

Frotis.
Fijación.
Colorante.
Lavado con agua destilada.
Secado al aire.
Visionado a 100X.

Tinciones diferenciales:

tinción Gram: se basa en las diferencias entre las paredes de las Gram + y las Gram - , el primer colorante tiñe todas las células, en las G+ entra y con la acción del lugol formara una molécula muy grande que no sale de la célula, pero el disolvente, etanol, disolverá la capa d lipopolisacaridos de las Gram negativas donde esta el 1º colorante, ya que no pudo atravesar esta barrera, de modo que al añadir el 2º será este el único que les de color.

Extensión.
Fijación.
Colorante básico, cristal violeta, entra en las células.
Lavado con agua destilada.
Mordiente, lugol: el colorante básico ya no puede salir de G+.
Lavado con etanol que disuelve la capa de lipopolisacaridos de G- donde esta el 1º colorante.
Colorante de contraste básico, safranina o rojo metilo . que tiñe a las G-.

tinción ácido-resistente: para los géneros Mycobacterium y Nocardia.

Extensión.
Fijación a la llama.
Colorante básico, fucsina fenicada o carbo fucsina, que penetra en la célula. Todo al calor.
Lavado con decolorante de ácido clorhídrico y etanol que decolora a las células ácido-alcohol no resistentes, las que mantengan el color, rojo, serán de los géneros Mycobacterium y Nocardia.
Secado.
Visionado a 100X.

tinción de estructuras:

tinción de cápsulas:

Protocolo MENEVAL:

Extensión.
Colorante ácido rojo congo que no teñirá la célula.
Colorante básico, fucsina básica preparada en medio ácido, penetrara en la célula virando a azul al reaccionar con el 1º colorante.
Lavado.
Visionado: célula roja con centro azul y fondo transparente.

tinción de esporas:

Extensión.
Fijación a la llama.
Colorante, verde malaquita, que penetra en la espora.
Lavado con agua.
Colorante de contraste, safranina, que entra en la célula pero no en la espora.
Secado.
Visionado: la endospora verde y la célula rosa.

tinción de flagelos:

Extensión.
Secado al aire.
Adición de mordiente para aumentar el tamaño de los flagelos.
Visionado.

tinción de vacuolas grasas:

Extensión.
Fijación a la llama.
tinción con negro sudan.
Lavado con agua.
Secado
Visionado.

tinción para hongos inferiores.

Tema 4. Métodos de caracterización, diferenciación e identificación de microorganismos.

Los caracteres que se suelen usar son morfológicos externos y estructurales y características fisiológicas e inmunológicas. Se hacen también pruebas bioquímicas que hacen referencia a las rutas metabólicas que usan los microorganismos.

Técnicas de identificación y caracterización para levaduras.

Microscópicamente: se estudia el crecimiento y las formaciones de las colonias.

Microscópicamente:

Gemación: monopolar. Bipolar, multipolar.
Sistemas de reproducción,...

Pruebas fisiológicas para levaduras:

Capacidad de asimilar diferentes fuentes de carbono: se hace en un medio con YNB como fuente de N y el azúcar que vamos a testar, se utiliza un replicador multipunto para sembrar diferentes cepas en la misma placa, o podemos testar diferentes azucares en una placa con una cepa usando ciscos impregnados en diferentes azucares.

Fermentación de fuentes carbonadas: se usa YNB con el azúcar correspondiente pero en medio liquido y con campana de Durham donde se acumularan burbujas de gases si existe fermentación.

Asimilación de glucosa al 50% o 60%: el medio es con YNB y glucosa al 50% o 60%.

Resistencia a 37ºC.

Capacidad de crecimiento en presencia de cicloheximida: es un compuesto termolábil de modo que se esteriliza por filtración. Las levaduras se diferencian en:

Tolerantes: crecen a [ ] de 1 mg/ml de cicloheximida.
Moderadamente tolerantes: pueden crecer a [ ] de 2 microgramos/ml .
No tolerantes: no resisten el antibiótico a [ ] de 1 microgramo/ml.

Hidrólisis de urea: para identificar los géneros Cryptococcus y a veces Rhodotorula. Esta prueba se hace en medio con urea como fuente de N, si hay crecimiento se observara un halo transparente alrededor de la colonia, la urea es termolábil de modo que se esteriliza por filtración.
Asimilación de fuentes nitrogenadas: el medio contiene YCB como fuente de carbón y la fuente de N que queremos testar.

Tolerancia al ácido acético: se hace con YNB, glucosa, agar si queremos un medio sólido y ácido acético al 1%. Identifica Zygosaccharomyces rouxi en concreto.

Asimilación de vitaminas: se añade una fuente de N muy pura solo con sales, sin contaminantes, una fuente de carbono y todas las vitaminas a excepción de la que queramos testar.

Pruebas de estructura:

Composición de la pared celular: % de mananos.

Diferencia en rutas metabólicas, en el complejo de la ubiquinona o en la coenzima Q.

Pruebas bioquímicas:

Carácter killer: producido por una toxina que las levaduras excretan al medio.

Fosfatasa alcalina termorresistente: diferencia tres especies de Pseudomonas: P.aeruginosa, P.pseudomallei, P.boreopolis. hay que confirmar primero que se trata de este genero, por que Salmonella y Proteus también pueden ser termorresistentes. La prueba consiste básicamente en incubar a 70ºC y observar un cambio a color amarillo en el medio que indica que la enzima ha resistido la alta temperatura. (falta algo mas)

Prueba de la esculina: diferencia especies del genero Streptococos, algunos Enterococos y para Listeria monocitogenes es positiva. Se basa en la hidrólisis de la esculina, un glucósido, formado por glucosa y una molécula de cumarina, que al ser hidrolizado produce esculitina y D-glucosa, al añadir sales de Fe al medio se combinan con la esculitina formando precipitados de color negro. En un medio con bilis además se detectan bacilos fermentadores.

Fermentación de HdC: definen grupos bacterianos e incluso especies. Se detecta la capacidad de fermentar determinada fuente de carbono. Se usa un medio básico con una fuente nitrogenada, la fuente de carbono que queremos probar al 1% y un indicador colorimétrico como el rojo fenol que es rojo a pH básico y amarillo a pH ácido.

Prueba del citrato: Klebsiella y Enterobacter son positivas y E.coli negativa. El ácido cítrico es una molécula que pertenece al ciclo de Krebs y con esta prueba sabremos si un organismo usa el citrato como fuente de carbono ya que si es así el pH del medio se volverá básico, el indicador que se usa es el azul de bromotimol que a pH ácido es verde y a pH básico es azul.

Se usan tiras API con varias celdillas cada una con un sustrato diferente donde se inoculan e incuban las cepas a probar.

Concentración mínima inhibitoria: se hace en un medio sólido mediante la técnica de inmunodifusión radial. Se realiza una siembra por extensión y se depositan en el medio discos con distintas concentraciones del inhibidor de crecimiento a testar. La concentración mínima inhibitoria será aquella inmediatamente anterior a la del disco que inhiba el crecimiento.

Purificación y extracción de productos extracelulares (ECP):

Los productos extracelulares son isoenzimas que los microorganismos excretan al medio con potencial toxico.

En medio sólido: para facilitar la recogida de los productos extracelulares se realiza la siembra sobro un papel de celofán previamente colocado sobre el medio.

Recogida de la membrana de celofán.
Lavado con tampón.
Homogeneización y centrifugación.
El sobrenadante se recoge ya que es donde estarán los productos extracelulares.
Esterilización por filtración con una membrana amicróbica de 0'22 m.
Conservación en congelación.

En medio liquido:

Se cultiva el microorganismo en medio liquido.
Se somete a centrifugación refrigerada.
Se recoge el sobrenadante y se cuantifican la cantidad de proteínas mediante el método de Lowry o el de Bradford, métodos espectrofotométricos en los que se hace una recta patrón con concentraciones proteicas conocidas y sus absorbancias para posteriormente extrapolar las absorbancias de nuestra muestra de concentración desconocida.

Dosis letal 50: se utiliza para cuantificar la toxicidad in vivo de productos extracelulares. Se define como la cantidad de producto necesaria para matar el 50% de la población muestra en un periodo determinado.

Métodos convencionales para virus.

Para el estudio de los virus se estudia su efecto citopatogénico, que es el daño celular producido in vitro, reflejo de la lesión que se supone producen in vivo.

Tema 5. Métodos moleculares de identificación y tipado de microorganismos.

Métodos genéticos: son métodos más reproductibles aunque es necesario complementarlas con pruebas bioquímicas.

Detección de enzimas mediante sustratos cromógenos: son enzimas que detectan metabolitos del microorganismo a estudiar y permiten identificar específicamente una especie. Esta técnica se emplea como complemento para otras de tipo presuntivas como la actividad catalasa y la actividad oxidasa.

Cromatografía gaseosa y técnicas derivadas: detecta metabolitos secundarios producidos por los microorganismos y es capaz de identificar a determinados grupos hasta el nivel de especie.

Métodos serológicos:

Tipado fágico: determina la sensibilidad de la bacteria a determinados fagos, estableciendo relaciones entre las bacterias en función de dicha sensibilidad, ya que los fagos son muy estrictos, cada fago infecta determinadas cepas de una misma especie.
Métodos enzimáticos : ELISA por ejemplo.
Técnicas inmunológicas de aglutinación antígeno-anticuerpo.

Métodos moleculares: nos aportan información sobre la relación filogenética de microorganismos y aportan diferencias dentro de la misma especie (diferencias filogenéticas).

Técnica de la guanina-citosina: se basa en la determinación del contenido en bases de guanina y de citosina, que es característica de cada genoma. Esta determinación se hace por dos métodos:

HPLC: por hidrólisis del ADN.
Temperatura de fusión del ADN: parámetro físico relacionado con el contenido en G y C, cuanto mayor sea el numero de pares de bases de G-C mayor será la temperatura de fusión.

La desnaturalización se observa mediante la absorbancia a 290 nm y el parámetro usado es la Tm.

Una diferencia en un 2% de este par de bases indica una especie distinta e incluso géneros diferentes.

El protocolo que se emplea es a partir de la misma concentración de ADN de distintos organismos. Se parte de 65ºC y se aumentan de 5 en 5ºC, después de cada aumento se mide la densidad óptica y enfrentándola con la temperatura se calcula la Tm para compararla con la de otros organismos.

Electroforesis en campo pulsante: se usa para distinguir entre cepas de la misma especie. Este método es capaz de resolver fragmentos de ADN con un numero de pares de bases muy elevado, de hasta 9000 kb, cromosomas enteros por ejemplo de levaduras. A diferencia de otras electroforesis esta consta de mas de un campo eléctrico que alternan. El bromuro de etidio es un colorante que además de permitir visualizar las distintas bandas de ADN le da rigidez para que no se reorienten.

Sistema FIGE: consta de dos campos eléctricos paralelos al gel.
Sistema CTAFE: el gel se dispone verticalmente en una cubeta y los dos campos se disponen en el formando un ángulo de 45º. En este gel las moléculas migran en zigzag a través del grosor del gel y en cada pulso el ADN invierte un tiempo en reorientarse y otro en migrar, de este modo las moléculas mayores tardan mas en moverse que las pequeñas.
Sistema CHEF: el campo eléctrico esta generado en este caso por 24 electrodos dispuestos en grupos de 4 en los lados de un hexágono. El gel se dispone horizontalmente. Con este tipo de electroforesis se puede cariotipar una especie, es decir, definir el numero de cromosomas siempre y cuando estos no pasen de 9000 kb.

Preparación del ADN para migrar cuando es de elevado peso molecular: se prepara la muestra en bloques de agarosa que protegen los fragmentos de ADN para que no se rompan y a la hora de obtener un perfil no obtengamos un numero mas alto de bandas que de cromosomas. La agarosa que se usa tiene un punto de fusión mas bajo que el de una agarosa convencional.

Los marcadores que vayamos a usar también han de ser incluidos en los bloques, los cuales se tratan con proteinasa K que digiere las proteínas de modo que el ADN migrara mejor por los poros del gel.

El estudio de los perfiles obtenidos se hace como una electroforesis normal: se hace una recta patrón con perfiles de bandas de pares de bases conocidas y sus respectivas distancias de migración y se compara con nuestra muestra.

Análisis de polisacáridos de membrana: se usa para establecer tipados de cepas de bacterias Gram negativas que tienen lipopolisacáridos por encima de la membrana, que aportan virulencia y toxicidad, en concreto se basa en la estructura de los lipopolisacáridos que tienen una parte hidrofóbica, el lípido A, que aporta esa toxicidad y que esta muy conservado al igual que otros azucares responsables del antigeno0.

Protocolo:

Cultivo del microorganismo en medio adecuado, siempre el mismo.

Se tratan las muestras con trisclorhídrico (SDS + mercaptoetanol), que lisa las células y libera los lipopolisacáridos que es lo que queremos hacer migrar, además también libera proteínas que trataremos con proteinasa K, para eliminarlas.

Una vez que tenemos las muestras las migramos en electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% y se tiño con bromuro de etidio o nitrato de plata.

Perfiles de restricción de ácidos nucleicos: los muestras de ADN se obtienen a partir de ADN plasmídico, mitocondrial o genómico. Para obtener el ADN hay que degradar la pares celular, en bacterias con lisozima, en levaduras con glucanasa (por que su pared esta compuesta por mananos y glucanos) y n hongos depende de la especie aunque normalmente se usan quitinasas y celulasas.

Las muestras de ADN se tratan con enzimas de restricción eligiendo aquellas con las que se obtienen largos fragmentos de ADN, para migrarlos en un gel de agarosa previamente teñido.

Hibridación de ADN: se emplean sondas de ADN de ácidos nucleicos de cadena simple que hibridan con la cadena complementaria por apareamiento de bases. también existen sondas de ARNr con las que se hace ribotipado. En microbiología existen sondas comerciales llamadas BACTEC, para Mycobacterium y Neisseria gonorrheae.

Tema 6. Técnicas de manipulación genética de microorganismos.

Técnica de conjugación.

Se realiza con levaduras de Saccharomyces cerevisae.

Hay dos tipos de levaduras, el tipo a y el tipo b, esto esta determinado por el locus MAT. Ambos tipos de levaduras son haploides.

Utilidades de la conjugación:

Obtención de células diploides a partir de células haploides.
Obtención del duplicado de un gen que se expresa en una célula teniendo así un diploide parcial que produce el doble de la cantidad del producto génico del gen duplicado.
Uso de levaduras con marcadores genéticos, normalmente auxotrofias para algún aminoácido.

Descripción génica:

Tipo sexual:

MAT cepa silvestre o dominante.
mat cepa mutante o recesiva.

Otros:

MAT a Leu 3, 8-1: cepa silvestre o dominante, con algún problema en la ruta metabólica de la Leu en el paso 3 y a la que le faltan los aminoácidos 8 y 1.

Técnica de fusión de protoplastos.

Se emplea para:

Obtener cepas que reúnan en una sola célula características que nos interesen de las dos células que hemos usado para hacer la fusión.
Obtención de células con dotación cualquier cromosómica: 3n, 4n, 5n, etc...
Para transferir el material genético citoplasmático sin que exista cariogamia, fusionando una célula normal con una célula mutante Kar que no produce cariogamia. Al fusionarlas la célula silvestre adquiere los caracteres citoplasmáticos del mutante Kar.

Transformación.

Permite introducir ADN exógeno, generalmente plasmídico, con un gen de interés en otra célula que nos interesa adquiera las propiedades que ese gen confiere. Se usan marcadores de resistencia a antibióticos, o auxotrofias, para seleccionar las cepas que incorporan el gen.

Micromanipulación.

Se usa en análisis genéticos de productos meióticos y para hibridar y construir cepas especificas.

Tema 7. Problemas.

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Enviado por:	Susana
Idioma:	castellano
País:	España

Palabras clave:

Microorganismos Identificación Cultivo Esterilización Preparación de las muestras Manipulación genética

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