Tema 7: Métodos y técnicas de inclusión

1. Introducción:

La inclusión permite obtener cortes finos y homogéneos para el cual las piezas acortan deberán tener una determinada consistencia y uniformidad.

El medio de inclusión debe ser un medio líquido que posteriormente se solidifique de forma homogénea. Este medio de inclusión deber penetrar en todos los espacios libres de los tejidos. Hay medios de inclusión que son solubles en agua y otros que no. En éste último caso ha de ser reemplazado por el solvente apropiado al medio de inclusión que se utilice con excepción de tejidos destinados a congelación, la mayor parte de loas muestras para estudio histopatológico, requiere la inclusión en un medio sólido y ésta puede hacerse de forma manual o automática.

2. Deshidratación por agentes químicos.

La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la eliminación completa del agua de la muestra tisular para que se pueda embeber (empapar) adecuadamente el tejido en aquellos medios de inclusión que no sean hidrosolubles.

El método clásico de deshidratación es la sustitución del agua por el alcohol pero puede realizarse utilizando cualquier reactivo capaz de absorber el agua de los tejidos. Las condiciones esenciales de un buen deshidratantes (agente) son dos:

1. No debe alterar la estructura tisular.

2. Es que debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante.

Ventajas:

1. Rapidez en concluir la deshidratación.

2. Reducir a un mínimo aceptable el endurecimiento que provoca en los tejidos

3. Su toxicidad y peligrosidad sea mínimo con escaso desprendimiento de vapores tóxicos.

4. Tuviera menos riesgos de incendio-explosión.

5. Baja toxicidad por inhalación, ingestión y contacto.

El proceso de deshidratación suele realizarse mediante el empleo de alcohol etílico y en el suelen intervenir los siguientes parámetros:

A. Graduación de los alcoholes: en la práctica la operación de deshidratación se realiza empleando una serie de alcoholes de gradación ascendente (50, 70, 80, 95, absoluto).

Esto se hace así porque la acción brusca de un alcohol de mayor gradación sobre el tejido provocaría una marcada retracción de éste, el empleo de series mas o menos largas de alcoholes de distinta gradación así como la decisión de iniciar el proceso en un alcohol de gradación media o menor van a estar en función primero de la experiencia del personal, de la fragilidad de los tejidos y del tipo de fijador utilizado, ya que los fijadores con base alcohólica realizan cierta deshidratación durante el proceso de fijación.

B. Volumen y el número de los baños de deshidratación: No es necesario o preciso que el volumen de alcohol sea demasiado alto por lo general suele recomendarse un volumen del baño 10 veces mayor al volumen de la muestra que se va a deshidratar.

Lo que se recomienda es multiplicar el número de baños. Se hacen baños sucesivos y múltiples que nos aportan las siguientes ventajas:

Ventajas:

1. Al permanecer menos tiempo en cada baño menor el resigo de endurecimiento excesivo del tejido.

2. El menor índice de saturación de agua en alcohol lo que posibilita la reutilización del baño de alcohol

3. Se controla mejor el grado de deshidratación de la pieza.

4. Hay menos riesgo de alteración tisular producida por un cambio brusco en la fuerza de estación del agua.

- DURACIÓN DE LA DESHIDRATACIÓN:

Esta va a estar en función en volumen de los fragmentos titulares y de su contenido en agua y hay que tener en cuenta dos cosas:

1) Deshidratación ha de ser completa

2) La exposición prolongada al agente deshidratante provoca un endurecimiento de los tejidos.

A veces en investigación se usan agentes accesorios que eliminan el exceso de agua en los deshidratantes y supone un cierto ahorro porque permite reutilizar el baño deshidratantes. Se utiliza el sulfato de cobre anhidro que sirve al mismo tiempo como indicador del grado de deshidratación del baño de alcohol porque los cristales de sulfato de cobre adoptan una tonalidad azul brillante cuando el líquido deshidratantes se satura de agua.

2.1. Principales agentes deshidratantes:

Alcohol etílico: es el agente más comúnmente usado es un excelente deshidratante tiene el inconveniente de que es muy inflamable y que tiene un precio superior al del alcohol metílico. Para abaratar costes se puede utilizar alcohol etílico desnaturalizado con metanol que también se denomina etanol para uso industrial.

Alcohol metílico: A veces se usa como sustituto del anterior pero normalmente no. Y es muy inflamable y tóxico.

Acetona: Es un agente deshidratante muy volátil y con una acción rápida. Si el tratamiento de los tejidos es rápido aumenta extraordinariamente su fragilidad.

Alcohol butílico o Butanato: Es un deshidratante lento miscible con la parafina por tanto permite prescindir de los agentes aclarantes.

Dioxan: Miscible con parafina, muy tóxico en espacios pequeños

Alcohol isopropílico: No puede utilizarse en la inclusión en celoidina

Tetrahidrofurano: No se usa. Agente de acción rápido que no causa excesiva retracción.

3. Aclaración o desalcoholización

Su finalidad no es hacer transparente el tejido aunque en algunas ocasiones puede ocurrir. Se trata de un proceso por el cual se consigue la sustitución del agente deshidratante por una sustancia miscible con el medio de inclusión que va a utilizarse.

Con ello se pretende que toda la pieza histopatológica se halle en bebida empapada en un agente químico líquido en el que pueda disolverse el medio de inclusión y de este modo penetrar en el tejido.

3.1. Agentes aclarantes Existen varias y su elección dependerá de su rapidez para eliminar el deshidratante. Dependerá también de la escasez de acciones nocivas sobre los tejidos y las células, de la adecuación del agente deshidratante y al medio de infiltración.

De la facilidad de su eliminación de su toxicidad, peligrosidad y de su coste. También se denominan líquidos intermediarios y se manejan mediante la realización de baños sucesivos de duración variable en función de las características del agente y del volumen de la pieza.

En ocasiones se recomienda utilizar antes de los baños del aclarante diversas mezclas de agente deshidratante con aclarante en diferentes proporciones.

El volumen del agente aclarante ha de ser el mismo que del agente deshidratante y el proceso si puede acelerar con una suave agitación ya manualmente o eléctrica.

3.2. Principales agentes aclarantes

Xileno o Xilol:

Ventajas:

1. Agente aclarante más rápido

2. No disuelve la celoidina

3. Endurece poco los tejidos.

4. Se elimina fácilmente del medio de inclusión

5. Es fácil de apreciar el punto óptimo de dosificación.

Inconvenientes:

1. Tóxico

2. Solo aclara desde alcohol absoluto.

3. Tiende a volver blanquecino el tejido.

4. Endurece si actúa mucho tiempo.

*Interés práctico: Aclara especimenes con un grosor aproximado de unos 5 mm entre 1h o media hora. Es el que se utiliza rutinariamente.

Toluol o Tolueno:

Ventajas:

1. Rápido pero menos que el Xilol

2. Endurece menos que el Xilol y no blanquea los tejidos.

3. Puede conservar una muestra más de 12 horas sin una alteración evidente

Inconvenientes:

1. Es tóxico

2. Solo se aclara desde alcohol absoluto.

*Interés práctico: Cuando no hay Xilol se usa Toluol. El tiempo de aclaración varia entre una y dos horas.

Benceno:

Ventajas:

1. Es relativamente rápido.

2. Endurece muy rápido y no blanquea.

3. Causa retracción mínima.

4. Se elimina fácilmente.

Inconvenientes:

1. Muy Tóxico

2. Altamente inflamable.

*Interés práctico: Puede utilizarse como producto de sustitución. El tiempo de aclaración es de entre 1 y 3 horas.

Cloroformo:

Ventajas:

1. Es muy tolerante

2. No afecta al tejido

3. Va bien para piezas delicadas

4. Es de acción lenta, por ejemplo piel, muestras descalcificadas.

Inconvenientes

1. El tejido tiende a flotar en el cloroformo y hay que poner peso en la pieza.

2. Difícil eliminación de parafina provoca a la larga, deterioro del bloque.

3. Olor poco agradable.

*Interés en la práctica: tiempo aclaración para muestra de 5 milímetros espesor 12 a 24 horas. Producto de sustitución en circunstancias especiales.

Tetracloruro de Carbono (CCl4):

Ventajas:

1. Acción similar al cloroformo pero más barato. No es inflamable

Inconvenientes:

1. Igual que el cloroformo.

2. Es muy toxico.

*Interés práctico: Tiene tiempo de aclaración de 15 horas puede utilizarse en piezas duras.

Dioxano:

Ventajas:

1. Miscible con parafina. Puede emplearse simultáneamente como deshidratante y aclarante.

Inconvenientes:

1. Inoloro y muy tóxico, siempre que se utilice es obligatorio extremar medidas de protección y usar campana de extracción de gases.

*Interés que tiene: Empleo restringido a inclusiones donde esta proscrita (prohibida). La deshidratación por alcoholes, como estudios histológicos de grasas porque el alcohol disuelve las grasas.

4. Infiltración o impregnación:

Es el proceso que tiene por objeto rellenar o infiltrar completamente la muestra histopatológica con el medio de inclusión que se va a utilizar.

El fundamento de este proceso radica en la ocupación completa con este medio de los espacio intratisulares y extratisulares inicialmente rellenos por agua.

Para conseguir este efecto, casi siempre es imprescindible eliminar previamente todos los restos de aclarantes residuales en el tejido.

La finalidad última de éste proceso es proporcionar a la pieza anatómica la homogeneidad y dureza suficiente para que se pueden obtener secciones finas de calidad. Se puede realizar la inclusión distintos medios. Pero hoy en día el método de elección sigue siendo la inclusión en parafina.

Las parafinas son sustancias de tipo céreo, compuestas por mezclas de hidrocarburos de cadena blanca y pueden obtenerse con una amplia variación en su punto de fusión que va a condicionar en gran medida en histotecnología. Son sólidos a temperatura ambiente las parafinas que se usan habitualmente, tiene una temperatura de fusión de entre 54 a 58 grados centígrados.

La dureza de la parafina está en función de su plasticidad. El punto de plasticidad está unos pocos grados por debajo del punto de fusión y se define como la temperatura mas baja a la que puede ocurrir una deformación permanente sin fractura:

En la práctica diaria no se unan las parafinas cloritas sin purificar porque se oxidan con el paso del tiempo y adoptar una tonalidad amarillenta y una consistencia blanda.

Se suelen utilizar mezclas con polímeros plásticos con un peso molecular controlado y con aditivos que mejoran sus características de inclusión.

4.1. Infiltración en parafina: Se realiza mediante baños sucesivos en parafina fundido. Estos baños deben ser renovados frecuentemente porque se cargan del medio de aclaración y producen disminución del punto de fusión de la parafina y la vuelven mas blanda y menos apropiada para el corte.

-4.1.a) Procedimientos de infiltración: este procedimiento puede hacerse o bien de forma manual o de forma automática en procesadores de inclusión:

-Procesamiento manual: No suele hacerse habitualmente y se hará en muestras que tiene gran volumen como por ejemplo cuando se quiera incluir piezas quirúrgicas completas o bien aquellas muestras que sean muy delicadas y no puedan meterse en un procesador automático.

También es bueno para el aprendizaje porque se puede seguir los cambios en la estructura tisular durante el proceso.

En la técnica manual es posible emplear agentes deshidrátenles y sobre todo liquido intermediarios que por u elevado costo (sobre todo el cloroformo) no puedan usarse en procesadores automáticos. Además si queremos acelerar el proceso podemos utilizar color también en los pasos de fijación y deshidratación.

-Procesamiento automático: Se hace en procesadores automáticos que contienen múltiples vasos para realizar los baños y el sistema mecánico de trasporte, regulado por un programador horario.

Ventajas:

1. Permiten procesar simultáneamente gran cantidad de muestras diferentes.

2. Economizan notablemente la cantidad de líquidos empleados en el proceso.

3. Realizan rápido procesamiento a lo largo de la tarde-noche del día de recepción y así las piezas estarán dispuestas para ser encastradas diseccionadas en la siguiente jornada de trabajo. Para obtener buenos resultados con éstos sistemas es fundamental renovar a menudo los líquidos contenidos en los baños. Su enturbiamiento a la percepción de olor aclarante en el último baño de parafina indica la necesidad de cambiarlo.

-Encastramiento del tejido y confección de los bloques: Este procedimiento consiste en la obtención de un bloque sólido de tejidos más medio de inclusión mediante el enfriamiento lento a 10-15ºC. Temperaturas más bajas producirían un efecto brusco de enfriamiento con contracción e los bloques que puede llegar a fracturarle. La finalidad del proceso es obtener un bloque fácil de manejar de dureza homogénea y de plasticidad y elasticidad adecuada que permita realizar cortes de calidad sin distorsión ni fragmentación de las estructuras que formaron el tejido.

Para la realización de los bloques se utilizan las estaciones de inclusión que constan de un dispensador de parafina líquido una placa caliente para la orientación de las piezas y una placa fría para la solidificación del bloque y habitualmente estará a temperaturas inferiores a la ideal de 10ºC.

-Orientación de la pieza: El espécimen infiltrado se coloca en la posición adecuada al tipo de corte que se desea realizar, teniendo en cuenta que la cara inferior del bloque será la superficie de corte. Además debemos orientar la pieza de manera que la parte más blanda se corte primero y la parte más dura o firme al final de l proceso.

Los moldes que se emplean en la confección de los bloques de parafina suelen ser de parafina así facilitan el enfriamiento homogéneo en dirección ascendente y la transmisión del frío al medio de encastramiento. El fondo de los moldes suele ser de tamaño variable que se ajusta a los de las piezas.

En ellos se encajan perfectamente las cassettes que llevan la muestra histológica y su identificación facilitando la confección de un bloque único que no precisa ningún tipo especial de montaje sobre el portabloques del micrótomo.

4.2. Otros métodos de inclusión: Existen otros medios de inclusión que aunque se aplican raramente en la práctica diaria si son de interés para procedimientos específicos de investigación o determinación tecnológica especiales sobre todo para microscopia electrónica. En general se plantea el empleo de medios alternativos de inclusión en los siguientes casos:

1. cuando el tejido es demasiado duro: hueso sin descalcificar. O tejido con estructura que se desnaturaliza con el calor.

2. Tejido que contiene abundantes interfases de consistencia heterogenia como el globo ocular.

3. Para estudio de sección de tejidos de espesor superior a 20 micras.

-Gelatina: La Gelatina se utiliza como material de inclusión cuando se quieren realizar cortes macro-micrométricos de órganos completos en unos micrótomos de gran tamaño denominados de tipo TËTRANDER y también como una alternativa cuando se quieren hacer cortes en congelación. La gelatina es soluble en agua por lo que no es necesario deshidratar y aclarar el tejido pero el fijador desnaturaliza las proteínas que componen la gelatina por eso, esta sustancia ha de ser completamente eliminada del tejido mediante lavado en agua corriente en circulación continua durante 12-24 horas.

La inclusión en gelatina se realiza mediante infiltraciones sucesivas a 37ºC en concentraciones crecientes.

-Celoidina: Es una sustancia amorga, blanca amarillenta y insoluble en agua y soluble en alcohol éter al 50%. También se denomina con el nombre de Colodión elástico y químicamente es una forma purificadora de nitrocelulosa.

Esta inclusión se hace pocas veces, ciertos trabajos neurohistológicos muestras duras, frágiles o de gran heterogeneidad, con esta procedencia se obtiene bloques de gran dureza que no precisan temperaturas elevadas. La mayor limitación para su empleo deriva del mucho tiempo necesario para completar el procesamiento. Este tiempo se mide en días incluso en semanas, además los cortes obtenidos a partir de celoidina, no pueden ser inferiores a 10 micrómetros de grosor, la media son 15 micras.

-Medios hidrosolubles diferentes a la gelatina. Se emplea para demostrar enzimas, lípidos, y aquellos elementos intratisulares que pueden ser desnaturalizados por el color o por el tratamiento con agentes deshidratantes y aclarantes.

4.3. Inclusión en plásticos (Resinas): La utilización de resinas acrílicas como el metil metracrilato o de tipo epoxi como medio de incluir tejidos ha experimentado un notable desarrollo en los últimos tiempos, este método es el procedimiento básico, de infiltración en microscopia óptica de transmisión y también puede utilizarse para el estudio del tejido óseo sin descalificar y para materiales de mayor dureza como los dientes.

La deshidratación del material ha de ser exhaustiva y suele llevarse a cabo en acetona. A continuación se procede a infiltrar con el monómero plástico y el tiempo de infiltración varia según el plástico que se utilice. Muchos de las resinas empleadas tienen el inconveniente de que su polimerización se realiza en forma de reacción exotérmica, que puede inducir daño en los componentes celulares debido a la elevada temperatura que se alcanza.

4.4. Inclusión en microscopio electrónico. Los procesos de inclusión en microscopia electrónica son a grandes rasgos como los de la inclusión general por las características del proceso, el corte debe poseer dos cualidades fundamentales una de ellas es que deben poseer una extraordinaria finura para permitir el paso de los electrones. La otra cualidad debe tener una presentación idónea de la estructura celular. Para cumplir estas condiciones, la microscopía electrónica impone el empleo de un medio de inclusión de elevada dureza que permita obtener secciones ultra finas. Los medios de inclusión que se utilizan son de tipo plástico. En un principio se usaba la inclusión en metil metraquilato pero actualmente se incluyen en epoxi resinas. Estas sustancias son polímeros plásticos entre los cuales se encuentren la araldita, la resina epón y la resina Spurr. Todas ellas suelen proporcionar una buena conservación de la estructura celular y conserva mejor el corte que el metraquilato. El fundamento general de la inclusión del epoxi resinas radica en la utilización de una resina monomérica líquida que se trasforma e un polímero sólido de gran dureza en presencia de calor, de un endurecedor, de un acelerador de la reacción y opcionalmente de un agente plastificante que disminuye su fragilidad.

Ejercicios:

1.-Preparar 100 cc de ác. Clorhídrico de 0.5 N a partir de una al 37 % de riqueza y densidad 1.19 gr/cc.

Datos: [N = 0.5] [p.a. HCl = 36.5] [r = 37%] [N = (gr. · valencia)/ (p.m. · L (dón))]

0.5 = gr · 1 / (36.5 · 0.1) gr. = 1.825 son puros que se necesitan

37% riqueza 1.825 · 100/ 37 = 4.93 hay que pesar para que puros hayan 1.825

1 gr. --------------- 1.19 cc

4.93 gr. ----------- x cc x = 5.87 mL de HCl

Hay que medir 5.87 mL de HCl y echar sobre una pequeña cantidad de agua previamente y después de añadir el ácido enrasar hasta 100 mL

*L (dón) = Litros de Disolución