TEMA 16

MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS

1.- INTRODUCCIÓN

2.- LAS BACTERIAS

3.- MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE BACTERIAS

4.- TINCIÓN DE OTROS MICROORGANISMOS

1.- INTRODUCCIÓN

CONCEPTO DE MICROORGANISMO Y DE MICROBIOLOGIA.

Los microorganismos, comúnmente llamados microbios, no forman parte de un único grupo taxonómico. Este término comprende a todos los seres microscópicos que pertenecen a los Reinos Monera, Protoctista y Hongos. Son extremadamente abundantes no sólo por el número de especies sino también y, sobre todo, por la enorme cantidad de individuos existentes en sus respectivos hábitat. Tanto es así que se considera que la mitad de la biomasa de la biosfera está constituida por los microorganismos.

El estudio de estos organismos, llevado a cabo por la Microbiología, es de gran importancia ya que muchos de ellos son patógenos y producen enfermedades en el hombre, en los animales y en las plantas.

La microbiología es la ciencia o parte de la Biología que se ocupa del estudio de organismos tan pequeños que no pueden ser observados sin la ayuda de una lupa o un microscopio. El desarrollo de la microbiología empieza después del descubrimiento del microscopio óptico por Anthony Van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Hay organismos que escapan a esta definición como es el caso de algunos tipos de algas.

DIFERENCIACIÓN ENTRE CÉLULA EUCARIOTA Y CÉLULA

PROCARIOTA

El grupo más representativo de la microbiología son las bacterias con una estructura celular mas primitiva que la de los organismos superiores (células eucariotas) . Son células procariotas , es decir sin una diferenciación entre el núcleo y el citoplasma.

Célula procariota

• El núcleo no esta separado o delimitado del citoplasma, es decir, carecen de membrana nuclear.

• El ADN se encuentra condensado en una zona centralizada que recibe el nombre de nucleoplasma.

• Es el tipo de células que tienen las bacterias y algas cianofíceas también llamadas algas azules.

Existen otras diferencias en cuanto a:

• Transmisión y expresión de la información genética.

• Metabolismo que utiliza cada tipo de células para proporcionar y obtener energía.

• Entrada y salida de materiales.

PRINCIPALES TIPOS DE MICROORGANISMOS

Aunque las bacterias son el grupo más representativo de microorganismos hay otros:

• Protistas que incluyen:

• Protozoos

• Algas

• Hongos

• Virus (que no son células), su estructura se limita a una capsula de naturaleza proteica (cápside) en cuyo interior se encuentra ácido nucleico que puede ser ADN o ARN.

BACTERIAS

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y ESTRUCTURALES DE LAS BACTERIAS

Tamaño

Las bacterias son invisibles al ojo humano, su tamaño se mide en micras y varia de unas especies a otras, y el intervalo de tamaño varia entre 1 - 250µ siendo el tamaño mas habitual entre 1 - 10µ, en cualquier casi su tamaño es más reducido que el de una célula eucariota normal.

Forma

• Forma esférica llamadas cocos (Sthaphylococcus).

• Forma de palillos llamadas bacilos (Lactobacillus).

• Forma de coma llamadas vibrios (Vibrio cholerae).

• Forma de espiral llamadas espirilos (Espiroquetas).

Disposición o agrupación que presentan

• Aisladas

• Formando agrupaciones características:

• Cadenas (Streptococcus)

• Parejas (Nisserias)

• Racimos (Sthaphylococcus)

• Tetradas

• Formas cúbicas (Sarcinas)

Esporas

Algunos géneros de bacterias tienen la capacidad de formar esporas. Esta característica ayuda a su identificación.

Las esporas son formas de resistencia a la temperatura, agentes químicos, agentes físicos como la desecación, en general, resistencia a agentes adversos. Esta característica la presentan el género Bacillus gram+ (B. anthracis), el género Clostridium (C. botulinum, C. tetani).

La producción de una endospora por una bacteria en un proceso lento que se inicia como respuesta a condiciones ambientales adversas.

Presencia de cápsula

La cápsula es una capa gelatino - mucosa de tamaño y composición variable y que juega un papel importante en las bacterias patógenas como el caso de la Klebsiella pneumoniae.

Presencia de cilios y flagelos

No existen en todas las especies, solo en algunas. Los cilios (cortos) y flagelos (largos) son filamentos de longitud variable, constituyen órganos de locomoción y según las especies pueden estar implantados en uno o en los dos polos de la bacteria o en todo su contorno, este es un rasgo identificativo de cada bacteria.

Constituyen el soporte de un tipo de antígeno que es el llamado antígeno H o flagelar.

Pared celular

Además de tener membrana citoplasmática poseen una pared celular, suele ser rígida y de naturaleza glúcido - lípido - proteica. En la pared celular existen constituyentes propios de las distintas especies.

La diferente composición bioquímica y el distinto grosor que presenta esta estructura bacteriana es responsable del distinto comportamiento frente a las tinciones (tición de Gram).

Periplasma

Es el espacio entre la pared celular y la membrana citoplasmática.

Membrana citoplasmática

Está situada debajo de la pared y tiene permeabilidad selectiva frente a las sustancias que entran y salen de la bacteria, es soporte de numerosas enzimas y tiene un papel fundamental en la división del material nuclear bacteriano.

Mesosomas

Son repliegues de la membrana que tienen gran importancia en la vida de la bacteria.

Estructuras internas

Citamos:

• Núcleo

Que lleva el material genético de la bacteria y está formado por un único filamento de ADN.

• Ribosomas

Son elementos granulosos que se hallan contenidos en el citoplasma bacteriano. Está formado por ARN y su principal papel es su intervención en la síntesis proteica.

• Citoplasma

Solución coloidal que contiene elementos nucleares, inclusiones citoplasmáticas como vacuolas, vesículas y los ribosomas.

CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS

Según su pared bacteriana se clasifican en:

• MICOPLASMA

Bacterias que no sintetizan pared celular, sirviendo la membrana como capa externa limitante.

• BACTERIAS GRAM (+)

Sintetizan una pared celular de una sola capa.

• BACTERIAS GRAM(-)

Sintetizan una pared celular compuesta de al menos dos capas estructurales distintas. (Fuera de la pared celular encontramos una membrana a su alrededor).

3.- MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS

Preparaciones en fresco

En Microbiología se pueden aplicar técnicas de detección de microorganismos en materiales frescos sin aplicar ningún tipo de colorante. Estos métodos son muy útiles para ver bacterias vivas y la mayoría están basados en el estudio de la movilidad.

Estos métodos comprenderán la extensión de la muestra a estudiar pero no seguida de fijación. Se suele hacer la preparación en húmedo añadiendo una pequeña gota de solución salina isotónica en la zona de la siembra. No se utiliza colorante.

Se tiene que observar con un cubreobjetos encima y directamente se mira al microscopio. En el microscopio se intentara fijar la atención en las partículas en movimientos para diferenciar si existen bacterias flageladas.

Los flagelos son los que permiten el movimiento que es característico de ellos, ya que el movimiento de otras partículas es al azar, el de las gotas de agua es browniano, mientras que el de las bacterias es unidireccional.

Con estas preparaciones no puede distinguirse el tipo de bacteria, ya que la preparación en fresco se utiliza solo para detectar microorganismos móviles. Para estas técnicas se utilizan portaobjetos especiales llamados escavados.

Preparaciones teñidas.

En Anatomía patológica lo que se realizan son técnicas microbiológicas de preparaciones teñidas , con la observación de preparaciones teñidas obtenemos información sobre la morfología bacteriana (cocos, bacilos...), además obtenemos información sobre la disposición celular que adoptan las bacterias (cadenas cortas, largas, racimos, tétradas..), si son Gram + o -, ácido alcohol resistentes.

Las técnicas histológicas no permiten identificar específicamente las bacterias, pero si poner de manifiesto su presencia en el tejido y demostrar algunas de sus características morfológicas básicas.

Mediante estas técnicas es posible precisar si son cocos, bacilos, espirilos e incluso una vez teñidos si son Gram+, Gram-, o ácido alcohol resistentes.

Las espiroquetas se demuestran generalmente mediante impregnaciones argénticas y algunas se colorean con la tinción de Giemsa.

Con las tinciones bacterianas se hacen más visibles los microorganismos y sus estructuras ya que el colorante que se deposita en las células bacterianas aumentan el contraste con respecto al medio.

Según el microorganismo que se vaya a teñir se distinguirá entre:

• Tinciones bacterianas.

• Tinciones para hongos.

• Tinciones para virus.

• Tinciones para parásitos.

TINCIONES BACTERIANAS

Los mecanismos de las tinciones bacterianas pueden ser:

• Fisicos

Obedecen a un mecanismo de absorción del colorante a través de los poros de la célula bacteriana quedando éste retenido en su interior.

Puede existir un mecanismo físico de adsorción del colorante, es decir, el colorante se queda adherido a la superficie de la célula bacteriana sin pasar a su interior. Esto es lo que ocurre en las técnicas de impregnación argéntica para la detección de espiroquetas.

• Químicos

En este se forma un verdadero enlace químico entre el colorante y algún componente de la estructura bacteriana.

Tipos de tinciones bacterianas

Tinción simple

Son aquellas que utilizan un solo colorante, permite la visualización de la morfología bacteriana, su agrupación y la cantidad de microorganismos.

Tinción compuesta o diferencial

Utiliza mas de un colorante, esta nos permite la diferenciación de bacterias como:

- Tinción de Gram.

- Ácido alcohol resistente.

Tinciones especiales

• Tinción de espiroquetas

- Tinción de esporas.

• Tinción de cápsula (verde de malaquita).

• Tinción de flajelos.

• Procedimiento técnico de las tinciones :

Para la realización de cualquier tinción se siguen los siguientes pasos:

- Extensión de la muestra. Esta extensión será diferente según el producto que llegue sea líquido, sólido o exudado.

- Desecación.

- Fijación. Se suele realizar por calor utilizando un mechero Bunsen, también se puede fijar exponiendo el porta a los vapores de un compuesto fijador.

- Tinción.

- Lavado.

- Secado.

- Observación al microscopio.

En el caso de que la muestra a estudiar sea una muestra de tejido, ya sea necrópsica o biópsica que va incluida en parafina, el primer pasó será desparafinar e hidratar y seguidamente se realizará la tinción.

TINCIÓN SIMPLE

Se aplica un único colorante.

Los colorantes más empleados serán el violeta de genciana (1% durante un minuto), Fucsina básica diluida, azul de metileno (1% de 3 - 5 minutos).

TINCIÓN DE GRAM

• Fundamento :

Las bacterias Gram+ poseen grupos sulfhidrilos susceptibles de formar enlaces estables con el violeta de genciana y el violeta de metilo previo tratamiento con lugol . El compuesto resultante se resiste a salir a través de la pared celular de las bacterias gram + , no pasa lo mismo con las bacterias gram - , de pared celular mas fina y diferente estructura.

La tinción de Gram utiliza como colorantes el violeta de genciana al 1% o cristal violeta, tintura de yodo o lugol, una solución decolorante formada por alcohol - acetona 7:3 y un segundo colorante que es la fucsina básica diluida o safranina.

Técnica

Comprende los siguientes pasos en el caso de muestras histológicas:

- Desparafinar e hidratar.

- Violeta de genciana un minuto.

- Lugol, arrastrar el colorante y dejarlo un minuto.

- Lavar con agua.

- Echar decolorante (alcohol - acetona) hasta que salga limpio.

- Lavar con agua.

- Safranina de 30 - 60 segundos.

- Lavar, secar y observar al microscopio.

Resultados

• Gram+: violetas - azul oscuro.

• Gram- : rojo - fucsia.

Objetivo

Sirve para la diferenciación de dos tipos de bacterias, esta diferenciación se produce por el diferente comportamiento que presentan la paredes celulares frente a los colorantes empleados.

TINCIÓN ÁCIDO - ALCOHOL RESISTENTE O DE

ZHIEL - NEELSEN

• Fundamento :

Todo el género de las micobacterias presentan gran dificultad mediante la técnica de Gram porque poseen una gruesa cápsula protectora , de composición lipídica fundamentalmente , que impide la penetración del colorante. Sin embargo, cuando se fuerza la entrada en su interior (aplicación de calor), las micobacterias demuestran una apetencia mayor de lo común por el colorante resistiendo posteriormente la diferenciación con ácido mientras que el resto de microorganismos se decoloran por completo. Debido a este comportamiento a las micobacterias se las llama ácido - alcohol resistentes.

La tinción de Zhiel Neelsen en ocasiones es negativa por la escasez de bacilos presentes en la mayor parte de las muestras, en estos casos puede optarse entre demostrar su presencia mediante fluorescencia específica con aureamina - rodamina o con reacciones inmunohistoquímicas más específicas.

Los más importantes en clínica son el Mycobacterium tuberculosis y el Mycobacterium leprae.

Utiliza como colorante:

- Fucsina fenicada de Zhiel Neelsen.

- Alcohol 70%.

- Ácido clorhídrico puro (1ml).

- Azul de metileno al 1%.

Técnica

- Desparafinar

- Hidratar.

- Teñir con fucsina fenicada de Zhiel Neelsen a 60º durante 5 minutos o una hora a temperatura ambiente.

- Lavar con agua destilada.

- Diferenciar con alcohol - ácido hasta la decoloración casi completa del citoplasma (rosa pálido) durante 5 minutos.

- Lavar con agua corriente durante 5 minutos.

- Teñir con azul de metileno al 1% durante 20 segundos.

- Aclarar en agua destilada.

- Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados

• Microorganismos ácido - alcohol resistentes color rojo y los otros azul.

Siempre deben emplearse preparaciones control+.

TINCIÓN DE ESPIROQUETAS

Dentro de las espiroquetas los microorganismos más importante son:

• Treponema pallidum (sífilis)

• Leptospira icterohemorrágica causante de la leptospirosis o enfermedad de Weir.

Hay una gran dificultad para demostrar estos microorganismos en los cortes histológicos (debido a su pequeño tamaño ). Se emplean los métodos de impregnación argéntica:

• Tinción de Warthin - Starry que utiliza como solución reductora el pirogalol.

• Tinción de Levaditi

Ambos métodos utilizan como colorante el nitrato de plata al 11'5% en muestras de autopsias y al 3% en muestras de biopsias.

Resultados

• Espiroquetas negras y fondo amarillo parduzco.

TINCIÓN DE OTROS MICROORGANISMOS

TINCIÓN DE HONGOS

Los hongos se clasifican según su morfología en:

• Hongos filamentosos que producen hifas.

• Hongos productores de esporas.

• Hongos filamentosos productores de esporas.

Cuando en la técnica histológica es necesario demostrar la presencia de hongos no suele ser posible su identificación específica, en general los hongos son Gram+ en el caso de los formadores de hifas y pueden ser Gram+ o Gram- en el caso de los formadores de esporas.

Otra tinción que da información sobre la presencia de hongos es la de PAS. Serán PAS+ debido a la presencia de hidratos de carbono en su pared celular.

Una técnica muy empleada, es la técnica de la plata metenamina junto con el PAS. En la tinción de la plata metenamina los hongos se ven de color negro.

TINCIÓN DE VIRUS

Los virus son parásitos intracelulares. Las técnicas de detección de virus han sido desplazadas por las técnicas de microscopía electrónica y por técnicas inmunológicas, es decir de la determinación de antígenos específicos por serología.

TINCIÓN DE SHIKATA

Sirve para teñir el virus de la Hepatitis B. Este método tiñe las células infectadas con el virus de la Hepatitis B.

Otro método que se utilizó fue el método de la floxina - tartracina.

TINCIÓN DE PARÁSITOS

Los parásitos más frecuentes en secciones tisulares son:

• Paludismo.

• Huevos de helmintos.

• Amebas.

• Triquina espiralis.

El parásito del paludismo, los huevos de helminto y las amebas se colorean con al tinción de Giemsa. Los huevos de helmintos y amebas se demuestran con la técnica del PAS, con la hematoxilina férrica y la hematoxilina fosfotúngstica.

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