Extracción de ADN.
A partir de sangre: deben aislarse las células nucleadas, por ejemplo linfocitos, preferentemente a partir de sangre periférica.
Añadir solución hipotónica para la lisis de eritrocitos.
Separación de leucocitos por centrifugación.
Tampón de lisis de leucocitos, dodecil sulfato sódico (SDS).
Extracción de proteinaza K para liberar el ADN de las proteínas a las que esta asociado.
Extracción de ADN en fenol, cloroformo,...
Precipitar el ADN con alcohol etílico frío.
Recuperar el ADN y diluirlo en una solución de TE (Tris+EDTA).

Otro método es el de eliminar las proteínas celulares mediante deshidratación y precipitación de las mismas con una solución saturada de NaCl. Tras centrifugar las proteínas precipitadas quedan en el fondo del tubo y el ADN en el sobrenadante que se trasfiere a otro tubo y posteriormente se precipita igual que antes.

A partir de tejido o células en cultivo:
Romper el tejido por homogenización.
Incubar en SDS y proteinasa K para digerir las proteínas y extraer el ADN con fenol.
A partir de células bucales: se realiza un enjuague con una solución de NaCl, se centrífuga, se descarta el sobrenadante y el precipitado se resuspende en SDS, se incuba y se extrae el ADN en fenol-cloroformo.
Extracción de ARN.

Al trabajar con ARN surge el problema de las ARNasas, capaces de degradar el ARN antes de que sea aislado.

Mediante tiocianato de guanidina: el tiocianato es un agente disociante que lisa y solubiliza las células inactivando la ARNasa. El proceso continua con una extracción fenólica o centrifugando en Cl2Cs de modo que separa el ADN del ARN que va al fondo del tubo de donde se recupera. Posteriormente se lava en AcNa y se precipita con etanol.
Mediante urea-cloruro de litio: se usa una solución de urea y o Cl que inactiva las ARNasas y permite la desnaturalización con proteinaza K. Las proteínas se eliminan en una sola extracción y los ácidos nucleicos se precipitan con etanol.
Mediante purificación de poli(A)-ARN: hay ARNm con una cola de poliadeninas, mas de 100, llamada poli(A), estos ARN se pueden aislar por cromatografía en columna de celulosa de oligo dT o poli(U) Sepharosa. La cola poli(A) hibridará con la cadena poli(U) o con el oligo dT, fijándose en la columna. Después de lavar los ARN no fijados el ARNpoli(A) se eluye y se precipita con alcohol etílico frío.
Determinación de ácidos nucleicos.

Normalmente es suficiente con una estimación de la concentración. La [ADN] se determina por espectrofotometría a una =260 nm en la banda del uv:

1 unidad de Abs a 260nm de ADN:
de cadena doble = 50g/ml.
de cadena sencilla = 37g/ml.
1 unidad de Abs a 260nm de ARN cadena sencilla = 40g/ml.

Estas medidas se aplican a soluciones puras de ácidos nucleicos. Para evitar una posible contaminación proteica debe realizarse una medición de la absorbancia 280 nm ya que las proteínas absorben tanto a 260 como a 280 y los ácidos nucleicos solo a 260. Un ADN puro tendrá una relación D260/280 entre 1'8 y 2.

Separación analítica y preparativa del ADN.

La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es el método mas usado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Además tiñendo el gel con una baja concentración de bromuro de etidio, agente intercalante fluorescente se puede determinar la localización del ADN dentro del gel.

Las bandas con cantidades de 1-10 ng de ADN se pueden identificar por examen directo del gel con rayos uv y si fuese necesario dicho ADN podría recuperarse y utilizarse posteriormente.

Electroforesis analítica:
En geles de agarosa: las moléculas de ADN de 200 pb y 50 kb se pueden separar en geles de agarosa de diversa concentración sometidos a electroforesis horizontal en un campo eléctrico de dirección constante. El protocolo para realizar este tipo de geles se divide en tres etapas:
el gel se prepara en una [ ] de agarosa apropiada según el tamaño del ADN que se desee separar (% agarosa ADN Kb).
el ADN se siembra en los pocillos del gel que se somete a voltaje.
tinción del gel y si el bromuro de etidio se ha incorporado antes de la migración las bandas se verán directamente bajo la luz uv.

Factores que afectan a la movilidad del ADN en el gel:

[ ] de agarosa: las moléculas de ADN de doble cadena migran a través del gel a una velocidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular. La masa molecular del fragmento se interés se puede determinar comparando su movilidad con la de un marcador de peso molecular conocido. Las mayores concentraciones de agarosa permiten separar fragmentos de ASN de menor tamaño:

% agarosa	Kb de ADN
0'3	5-60
0'6	1-20
1'2	0'4-6
2'0	0'1-2

Voltaje: en general el ADN migra a una velocidad proporcional al voltaje aplicado pero si este aumenta demasiado la capacidad de separación disminuye.
Composición de bases y temperatura: el comportamiento del ADN en agarosa no se altera ni por se composición de bases ni por se temperatura, al contrario que en geles de poliacrilamida.
Composición de la solución amortiguadora de electroforesis: la movilidad del ADN varia según el tampón utilizado, si este tiene pocos iones la conductividad será mínima y el ADN migrara lentamente y si la concentración iónica es elevada la temperatura podría llegar a derretir el gel.
En geles de acrilamida: se usan para separar fragmentos pequeños de ADN (5-500pb), estos geles permiten separa fragmentos que difieran solo en un par de bases. Se usan en vertical con voltaje constante. La porosidad de un gel de acrilamida se determina según la longitud de las cadenas u el grado de unión entre las mismas. Las tres aplicaciones de estos geles de acrilamida son:
purificación de oligonucleótidos de síntesis y eliminación de nucleótidos libres tras marcaje radiactivo.
determinación de secuencias de ADN.
separación de fragmentos pequeños de ADN de una longitud menor a 500pb.
Otras electroforesis:
PFGE (Pulsed Field Gel Electroforesis): separa moléculas de ADN cambiando la orientación y/o polaridad del campo eléctrico a lo largo del recorrido. A cada modificación del campo eléctrico el ADN deberá reorientarse en paralelo al nuevo campo y cuanto mayor sea la molécula mayor será el tiempo de reorientación. Esta electroforesis se realiza en geles de agarosa al 1% y separa moléculas de 50 kb y 12 megabases.
OFAGE (Orthogonal Field Alaternative Gel

Electroforesis): se aplican 2 campos y el ángulo de reorientación es de 90º. Separa fragmentos de 9 Mb.

FIGE (Field Inversión Gel Electroforesis):el sentido del campo se invierte periódicamente, de modo que el ángulo de orientación es de 180º. Sin embargo la migración no es proporcional al tamaño de los fragmentos sobre la totalidad del recorrido y la determinación precisa de la talla de las bandas es difícil. Se pueden separar fragmentos de un tamaño comprendido entre 1-2 Mb.
CHEF (Contour clamped Homogeneus Electric Field): el campo eléctrico tiene 6 electrodos dispuestos hexagonalmente y se consiguen reorientaciones de 120º. Las migraciones son lineales y separa fragmentos de hasta 12 Mb.
Revelado de geles y medida del tamaño de los fragmentos de ADN: el bromuro de etidio se intercala entre las bases del ADN y se vuelve fluorescente de color naranja. Esta molécula se introduce en la agarosa antes de que el gel se solidifique. Tras la migración se ilumina con uv para visualizar el ADN y se puede fotografiar con una película muy sensible.
Electroforesis preparativa: después de la migración se visualizan las bandas correspondientes a los ácidos nucleicos que se van a purificar para esto hay varios procedimientos:
Por delante de la banda se hace un corte en el gel y se introduce una membrana, se continua con la electroforesis hasta que el ADN de la banda haya pasado a la membrana de la cual el ADN se eluye con un tampón adecuado. Con esta técnica se pueden recuperar fragmentos de 500 pb y 5 kb.
Después de la migración la banda se corta y el fragmento se disuelve en TE, y con 2 o 3 extracciones fenólicas seguidas de precipitación en alcohol frío.
Enzimas de restricción.

Son endonucleasas que cortan secuencias concretas dentro de la cadenas de ácidos nucleicos.

Hoy día se conocen mas de 500 enzimas de restricción que se nombran del siguiente modo: (Eco RV)

La 1ª letra es una mayúscula igual a la inicial de la especie bacteriana de donde se extrae (E).
Las dos siguientes letras son minúsculas y se corresponden con el genero de la bacteria (co).
Las otras tres letras provienen de una cifra romana que representa el numero de orden de descubrimiento de la enzima dentro de la misma bacteria (V). Se puede añadir una mayúscula que represente la cepa (Ry)
Clasificación:
Tipo 1: después de reconocer la secuencia, la enzima se desplaza sobre el ADN y se fija aleatoriamente a 1000 o 5000 pb de esa secuencia y corta
Tipo 2: la enzima corta en la secuencia reconocida, estas secuencias son palindrómicas, se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda. Dos enzimas de restricción que reconocen un misma secuencia se denominan isoesquizómeros.
Tipos de cortes:
Extremos cohesivos compatibles: las enzimas pueden cortar en el extremo 3' o en el 5' del palíndromo.
Extremos 3' cohesivos:

5'-cg!atcg-3' 5'-cg.......atcg-3'

3'-gcta!gc-5' 3'-gcta.......gc-5'

Extremos 5' cohesivos:

5'-cgat!cg-3' 5'-cgat.......cg-3'

3'-gc!tagc-5' 3'-gc.......tagc-5'

Extremos romos:

5'-CCC!GGG-3' 5'-CCC......GGG-3'

3'-GGG!CCC-5' 3'-GGG......CCC-5'

Extremos cohesivos incompatibles.
Tipo 3:reconocen la secuencia y cortan 20 nucleótidos mas allá.

Las enzimas de restricción no reconocen secuencias metiladas porque son modificaciones , es mediante la metilación que las bacterias se protegen de sus enzimas de restricción. Existen enzimas que reconocen la secuencia metilada y sin metilar, por ejemplo los isoesquizómeros Hsp I y Hpa II la 1ª reconoce la secuencia esté o no metilada y la 2ª solo si no lo está.

Otras enzimas usadas en biología molecular.
Polimerasas: añaden desoxirribonucleótidos solo en los extremos 3' hidroxi terminal de un cebador situado sobre una molécula de ADN de doble cadena. La síntesis solo sucede en dirección 5' 3'. Muchas polimerasas poseen además una actividad exonucleasa que retira nucleótidos mal incorporados tanto en dirección 3'5' como en dirección 5'3'. Si es exonucleasa 3'5' deja extremos 3' libres, si es una exonucleasas 5'3' dejara extremos 5' libres.

Enzima	Actividad catalítica
Enzima		3'5' exonucleasa	5'3' exonucleasa	Polimerasa
E. coli ADN polimerasa	Baja	Presente	Intermedia
Fragmento de Klenow, fragmento de la ADN polimerasa de E. coli	Baja	No existe	Intermedia
T4 ADN polimerasa, producida por E. coli cuando esta infectada por el fago T4	Alta	No existe	Intermedia
T7 ADN polimerasa	Alta	No existe	Rápida
Taq ADN polimerasa	No existe	presente	Rápida

Las actividades principales de las polimerasas son:

Secuenciación de ADN por el método Sanger.
Creación de hebras complementarias a una hebra molde.
Rellenado de extremos cohesivos para hacerlos romos.
Marcaje radiactivo con P32.
Amplificación de secuencias mediante PCR.
Ligasas: unen fragmentos de ADN.
ADN ligasa de E. coli: enlaces fosfodiéster en ADN de doble cadena, la reacción esta catalizada por NAD+.
T4 ADN ligasa: usa ATP hidrolizado en AMP y pirofosfato en lugar de NAD+. Une ADN de extremos romos y/o cohesivos.
T7 ADN ligasa usa ATP como fuente de energía.
Nucleasas: rompen enlaces liberando nucleótidos.
ADNasa I:
se extrae del páncreas bovino.
degrada ADNdc y produce oligonucleótidos con el extremo 3' hidroxilado (con un OH).
en presencia de:
Mg+2 corta al azar.
Mn+2 corta las dos cadenas.
Endonucleasa S1:
extraída de Aspergillus oryzae.
solo degrada ADNcs.
ARN polimerasas: transcriben el ADN a ARN a partir de un promotor especifico.
ARN ligasas: catalizan la unión del extremo 5' de un ADN de cadena simple o de un ARN al extremo 3' de un ADNcs o de un ARN. Es necesaria la presencia de ATP.
Fosfatasas: quitan fosfatos al extremo 5' del ADN y ARN.
Quinasas: unen fosfatos al extremo 5' del ADN y ARN
ARNasas:
Ribonucleasa A:
se obtiene del páncreas bovino.
hidroliza enlaces fosfodiéster que unen los ribonucleótidos, siempre después de las bases pirimidínicas.
Ribonucleasa T1:
se obtiene de Aspergillus oryzae.
hidroliza el ARN después de un residuo de guanina
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Es un método para generar in vitro grandes cantidades de un determinado fragmento de ADN a partir de cantidades mínimas del mismo.

Una de las propiedades de las ADN polimerasa es que necesitan una secuencia cebadora para iniciar la síntesis de una hebra complementaria.

Las 2 hebras de una molécula de ADN pueden disociarse y reasociarse in vitro por calentamiento y enfriamiento, este es un proceso altamente especifico que sucede solo entre hebras complementarias.

Esta técnica requiere el uso de cebadores oligonucleotídicos (primers) complementarios a las secuencias situadas en los extremos del fragmento de ADN que se desea amplificar, se basa en el desarrollo de ciclos repetidos de desnaturalización de la doble hebra de ADN por calor, hibridación de los cebadores con las secuencias complementarias y la síntesis de ADN mediante un dan polimerasa.

En teoría el nº de copias obtenidas debería ser 2n siendo n el numero de ciclos, aunque en la practica el numero de copias es menor. El numero de copias, si el rendimiento, R, es constante a lo largo del proceso, será (1+R)n. Para un rendimiento del 85% el numero de copias será (1'85)n que par una PCR de 30 ciclos representa un valor aproximado de 106.

El ADN. Es mejor obtenerlo totalmente purificado sin ARN ni proteínas. Actualmente se usan 100ng de ADN para una PCR. El ADN que se puede usar para una PCR puede obtenerse por ejemplo a partir de 200l de sangre capilar que se calienta 100ºC, se centrífuga y el sobrenadante es ya una fuente directa de ADN. Si la secuencia que se quiere amplificar esta presente una sola vez (1 copia) la cantidad de ADN debe estar entre 100-500 ng, si esta muy repetida llegan 10-100 ng.
Los enzimas. La 1ª enzima que se uso fue el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, pero se inactivaba con la temperatura de desnaturalización del ADN, por lo que tenia que ser añadida fresca al final de cada ciclo. El que la temperatura de hibridación no superase los 37ºC favorecía la aparición de secuencias inespecíficas. Además aparecían estructuras secundarias que impedían el avance de las ADN polimerasas. Todos estos inconvenientes se superaros con el uso de la polimerasa Taq, aislada de Thermus aquaticus, bacteria termófila que permitió no tener que añadir enzima cada vez que comenzaba un nuevo ciclo y automatizar el proceso. La actividad se esta enzima aumenta considerablemente a partir de 65ºC y hasta los 72ºC.
Los nucleótidos. Cuanto mayor sea la [ ] de nucleótidos aparecerán mas amplificaciones inespecíficas y la polimerasa cometerá mas errores. Las [ ] de los diferentes nucleótidos deben estar equilibrados aunque el ADN sea mas rico en una base que en otra, una de 20mol/l de cada nucleótido permite sintetizar 2'6g de ADN.
Los cebadores. El diseño de las secuencias cebadoras es muy importante. Existen unas reglas a seguir en el diseño de cebadores:
Las secuencias de los cebadores no deben permitir que suceda hibridación entre los mismos.
Los cebadores deben tener una distribución de bases equilibrada y con un contenido e CG similar al del ADN diana.
Las secuencias no deben corresponder a secuencias geonómicas repetidas.
La mayoría de cebadores deben contener entre 18 y 30 bases y sus concentraciones optimas varían entre 0'1-0'5 mmol/l

El ión magnesio interviene en la hibridación delos cebadores con el ADN diana, en la actividad y fidelidad de la Taq polimerasa y en la especificidad del producto de amplificación.

El aparato que realiza la PCR de modo automático se llama termociclador.

Limitaciones de la PCR y problemas:
Es imposible amplificar secuencias de mas de 3 kb y para menos de 1 kb es necesario ajustar las condiciones de reacción.
Es necesario efectuar alguna PCR previa cuando el numero de copias de ADN es bajo.
La contaminación se elimina con el uso de controles y prevención.
La síntesis por ADN polimerasa tiene la ventaja de que estas poseen también actividad exonucleasa y correctora, función de la que carece la Taq polimerasa, para minimizar el error que esta produce se usan niveles bajos de dNTP y MgCl2, y de reduce el nº de ciclos de PCR al mínimo.
Los cebadores son secuencias cortas que en el99% de los caos hibridan de forma no especifica a lo largo del ADN. Existe una técnica, PCR anillada, que es muy útil en la lucha contra las amplificaciones inespecíficas.

Tema 2. Vectores.

Los vectores son moléculas de ADN que pueden manipularse e introducirse fácilmente en una bacteria o célula eucariota donde pueden replicarse en gran nº de copias. Por ello la inclusión de un gen o de una secuencia de ADN en un vector permitirá su introducción y multiplicación en una célula para la obtención de un gran nº de copias idénticas a la secuencia original de ADN y a su posterior amplificación mediante selección clonal molecular.

Principales utilidades de los vectores:

El clonaje y amplificación de una secuencia de ADN.
El estudio de los mecanismos de la expresión de una secuencia de ADN.
Introducción de genes en células (transfección) o en organismos (animales o transgénicos).
Producción de ARN y proteínas codificadas por genes introducidos.

Propiedades de un vector:

Debe replicarse activamente en la célula hospedadora de modo episomal (independientemente del ADN de dicha célula).
El tamaño debe ser el menor para poder inserta la mayor cantidad de ADN posible y para poder manejarlo con mas facilidad.
Tienen que codificar para proteínas que confieran resistencia a algún antibiótico para seleccionar las células que lo hayan incorporado.
Su presencia debe afectar lo mínimo a la célula hospedadora y debe mantenerse en ella sin ser modificado.
El vector debe tener el mayor numero de dianas posible para enzimas de restricción dentro de los genes de selección a fin de que la integración del ADN foráneo facilite el aislamiento del recombinante.
Su aislamiento en forma pura debe ser fácil.

Uso de un vector.

Primero es necesario cortar el vector con enzimas de restricción en el lugar preciso donde se desee insertar la secuencia a clonar. Los extremos del vector deben tratarse con fosfatasa alcalina para que el vector no vuelva a cerrarse sobre si mismo. El ADN a insertar deberá tener un tamaño y extremos compatibles con el vector que lo porte. Ambas preparaciones (vector y ADN a insertar) se mezclan en unas proporciones determinadas en presencia de ligasas.

Una vez realizada la recombinación (unión inserto-vector) es preciso replicar el vector mediante su introducción en la célula hospedadora, este paso es especifico para cada vector.

La elección de la célula hospedadora se realiza según el vector y el objetivo.

Tipos de vectores:
Plásmidos: son pequeños fragmentos de ADN circular extracromosómico de origen bacteriano, se replican independientemente del cromosoma bacteriano. El tamaño del plásmido suele ser de 2-5 kb y puede recibir hasta 8-9 kb de ADN exógeno.
Pasos para obtener un plásmido:
Obtención de una gran cantidad de plásmido: esta técnica se usa tanto para obtener plásmido como para obtener clones recombinantes. Las bacterias deben cultivarse en un gran volumen hasta alcanzar una densidad de 2'5.108 bact./ml que equivale a Abs600nm de 0'6. se bloquea la replicación del cromosoma pero no la del plásmido por ejemplo con cloranfenicol. El cultivo se centrífuga, el precipitado bacteriano se resuspende y se lisa en medio alcalino, se vuelve a centrifugar para separar ARN y plásmido de restos celulares y cromosoma bacteriano. Se digiere el ARN con ribonucleasa y se procede a la extracción fenólica y precipitación con etanol frío del plásmido.
Recombinación y clonación de plásmidos y ADN: se corta con enzimas de restricción de único sitio al plásmido que se tratara con fosfatasa alcalina para que no se cierre ni se una a otro ADN, de este modo el plásmido solo se cerrara sobre la secuencia de ADN exógeno que esté fosforilada. El plásmido linearizado y defosforilado se incuba con el ADN exógeno y la ligasa a baja temperatura para que los extremos hibriden. La concentración del ADN a insertar debe ser menor que la del plásmido para que haya mayor unión ADN-plásmido que ADN-ADN. Después habrá que introducir el plásmido recombinante en la bacteria portadora (transformación bacteriana). Las bacterias deben ser competentes para poder introducirles el plásmido y esto se logra con cloruro clásico en cultivo con el plásmido en frío.
Selección de bacterias con plásmido recombinante: después de la transformación hay 3 posibilidades: bacterias sin plásmido, bacterias con plásmido no recombinante y bacterias con plásmido recombinante; son estas ultimas las bacterias que nos interesan para seleccionarlas se hace un cultivo en medio selectivo con antibiótico al que demuestran resistencia las bacterias que han incorporado el plásmido, aunque no se pueda diferenciar entre las que son recombinantes y las que no lo son, es por esto último por lo que se usan otras técnicas como:
Sistema del 2º gen de resistencia a un antibiótico: el ADN exógeno se inserta dentro de un 2º gen inactivándolo de modo que se seleccionan las bacterias resistentes a un 1º antibiótico pero que no lo son al 2º antibiótico debido a que el gen que confiere resistencia esta inactivado.
Sistema del operón lactosa: se transforman las bacterias lac- con un plásmido con el gen lac Z (-galactosidasa) que confiere fenotipo lac+ a la bacteria. Si el ADN exógeno se introduce dentro del gen lac Z lo inactivara y la coloración de las colonias en presencia de un galactósido será blanca, nula, por lo que no habrá complementación (plásmido lac- y bacteria lac-) mientras que si el ADN exógeno no se inserto en el gen lac Z del plásmido las colonias se colorearan de azul. (técnica usada en practicas)
Plásmidos mas usados: en un principio se usaron los que se encontraron espontáneamente, y después comenzaron a construirse plásmidos artificiales.

Uno de los primeros plásmidos artificiales fue el pBR322, con genes de resistencia a la tetraciclina y ampicilina, y con 20 dianas únicas para enzimas de restricción, la mitad de las cuales están en los dos genes de existencia a antibióticos.

Otros plásmidos fueron los de la familia pUC se pequeño tamaño y replicación rápida. Contienen el gen de resistencia a la ampicilina y parte del gen lac Z con un sitio de múltiple clonaje, polilynker, que es una secuencia polinucleotídica sintética con un gran numero de sitios de corte sucesivos para enzimas de restricción que permite una fácil inserción de casi cualquier secuencia.

Fagos: son virus bacterianos de multiplicación rápida y el numero de copias que se obtienen es grande ya que además se multiplican independientemente de la bacteria. El ADN exógeno que puede recibir un fago es mayor que la de un plásmido, pero la manipulación es mas compleja.
Como usar un fago:
Obtención de fagos: se hace que una bacteria exprese el receptor para un fago concreto, se cultivan dichas bacterias con el fago (5.107 fagos/ml bacterias) después de la lisis bacteriana se extrae el ADN de los fagos por tratamientos químicos y se titulan para saber su concentración.
Construcción de híbridos con ADN exógeno: se puede hacer de dos modos:

Corte del fago: en un único sitio de donde se insertara el ADN exógeno de hasta 12 kb.
Deleción - reemplazo: se basa en la deleción de la parte central del fago y su reemplazo con el ADN exógeno (8-22 kb).

Para la reconstrucción del fago con el ADN exógeno es necesario proporcionar una cabeza proteica que le confiera capacidad infecciosa. Las proteínas necesarias se extraen de 2 cepas de E. coli que contienen el fago integrado en su cromosoma, mutado y defectivo. La lisis no se producirá en las bacterias, ya que en cada cepa existe una mutación diferente, pero si se complementan in vitro apareciendo así un fago completo. El fago infeccioso se cultiva con células bacterianas que posteriormente se siembran en placa Petri para saber se hay recombinantes ya que si es así aparecerán calvas de lisis.

Fagos más usados: el 1º fue el fago de 48'5 kb que infecta a E. coli, su ADN es bicatenario, lineal y sus extremos tienen una secuencia llamada cos (12 pb, monocatenario y extremos cohesivos entre si) que permiten al fago formar concatenámeros.
YACs (Yeast Artificial Chromosome): son vectores que permiten clonar fragmentos grandes de ADN de 150-1000 kb. Tienen tres secuencias necesarias para la correcta duplicación y segregación de cromosomas en mitosis y meiosis: TEL (teloméricas), CEN (centroméricas), y ARS o secuencias necesarias para la replicación.
Cósmidos: vectores artificiales construidos por un plásmido al que se le han unido las secuencias cos del fago . Solo se usan para la construcción de genotecas y especialmente para andar por el cromosoma en pequeñas distancias. Se detecta la infección de bacterias en la aparición de colonias y no en las placas de lisis. Debido al gran tamaño del inserto el tiempo necesario para la replicación aumenta, y disminuye el nº de copias por bacteria.
Vectores virales eucariotas: son genomas de ADN o formados por ADN en alguna parte del ciclo. Los mas usados son los SV40, adenovirus, retrovirus, virus tipo Herpes, baculovirus, etc....

Tema 3. Sondas Genéticas.

Bioquímicamente una sonda es una molécula de ADN o ARN homologa a una secuencia de ARN o ADN diana, con la que híbrida de forma estable y especifica (por asociación de bases complementarias). Las cadenas ricas en G y C están unidas con mayor fuerza porque entre ellas hay 3 puentes de H en vez de 2 como sucede entre la A y T.

La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unirá exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama especificidad de la sonda.

Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La detección solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable. Dependiendo del numero de estos grupos incorporados y de la señal que emitan la sonda puede tener diferente sensibilidad, dando una señal ± intensa. A mayor sensibilidad menor será la cantidad de ADN o ARN que la sonda puede detectar.

Tipos de sondas.

Se escogen en función de la secuencia diana (ADN o ARN) y se tienen en cuenta la longitud y el tipo de secuencia diana así como el medio de marcaje y detección.

Según el tamaño se distinguen:

Sondas grandes: secuencias de ADN bicatenario de una longitud de 1-4 kb. Pueden ser genómicas, secuencias con intrones y exones, o de ADNc, sin intrones, obtenidas a partir de la transcripción inversa del ARNm.
Sondas pequeñas: son secuencias monocatenarias de 15-50 nucleótidos. Reciben el nombre de oligonucleótidos sintéticos. Son de ADN.
Sondas intermedias: son de ARN.
Obtención de sondas.

Las sondas bicatenarias de ADN genómico y de ADNc, se obtienen por dos métodos distintos. El primer método fue el clonaje de un fragmento de ADN en un vector plasmídico o vírico. El 2º método es la amplificación de la sonda por PCR, mas rápido, fácil y económico que el 1º método.

Las sondas de ARN solo se obtienen por clonaje. Primero se obtiene un ADNc que mediante transcripción inversa pasara a ARN que se clonara.

Las oligonucleótidos se obtienen por síntesis química a partir de nucleótidos libres. Son sondas menos especificas por su tamaño y por que la señal de hibridación es mas débil. Sus ventajas son:

Tiempo de hibridación menor para cubrir un numero equivalente de dianas.
Detectan diferencias de una sola base en la secuencia diana detectando por lo tanto mutaciones puntuales.
Se obtienen en gran cantidad de modo económico.

Hay ciertas normas para seleccionar un oligonucleótido usado cono sonda. El tamaño ideal esta entre 18 y 30 nucleótidos. Las sondas cortas son poco especificas y las largas alargan el tiempo de hibridación. La composición de bases debe tener un 40-60% de CG para una mayor estabilidad sonda-diana. Es importante que no existan secuencias complementarias dentro de la sonda para que esta n hibride consigo misma. Es importante que se estudien otras secuencias genómicas para que la sonda no tenga mas de 8 nucleótidos en común, y en secuencia, con regiones que no sean dianas.

Marcaje de sondas.
Sitios de marcaje o modificación:

Para detectar hibridación hay que usar sondas marcadas o modificadas y para ello se marcan los nucleótidos sin que se vea disminuida la capacidad de apareamiento entre bases complementarias. Algunas bases modificadas pueden ! o ! la estabilidad del híbrido. La 2-amino-adenina se incorpora en sondas pequeñas y forma 3 puentes de H con su complementaria, la timina. La cosina sustituye a la guanina en el ARN rico en GC y solo forma 2 puentes de H con la citosina. Sise añaden isótopos radiactivos las propiedades del marcaje no se ven modificadas.

Posibles sitios de marcaje de las bases:

Adenina:Citosina:Uracilo:Guanina:Timina:

Tipos de marcaje:
Marcaje radiactivo: el marcaje de sondas mediante isótopos radiactivos es el mas usado. Pueden marcarse todos los tipos de sondas y puede ser uniforme o en los extremos de la cadena.

El isótopo mas utilizado es el P32, con alta actividad especifica (9200 Ci/mmol puro) y emite partículas de alta energía (1'7 MeV) por lo que sondas marcadas con este elemento tienen un elevado rendimiento y sensibilidad.

El marcaje puede ser en diferentes posiciones, o . El P32 tiene un periodo de semidesintegración relativamente corto, 14'3 días, lo que obliga a usar las sondas marcadas dentro del periodo de una semana después dl marcaje, y además la emisión de partículas durante largo tiempo puede alterar la estructura de la sonda.

Otro isótopo muy utilizado es el S35, su emisión de partículas tiene menos energía (0'167 MeV) y su actividad especifica también es menor (1500 Ci/mmol). Su largo periodo de semidesintegración (87 días) hace que sea muy usado. Las sondas marcadas con este isótopo tuenen una alta resolución, pueden diferenciar señales de hibridación muy próximas, incluso dentro de una misma célula por ello es utilizado en hibridaciones in situ y sobre preparaciones histológicas o citogenéticas.

Los nucleótidos marcados con S35 tienen un grupo fosfotioato (P=S) en vez de un grupo fosfato (P=O) en posición o , este cambio puede inhibir la actividad de ciertas enzimas, esta demostrado que la ADNpolimerasa I incorpora estos nucleótidos con menor frecuencia.

El 3º radioisótopo es el tritio H3, con baja actividad especifica (29 Ci/mmol puro), baja energía de las partículas beta (0'019 MeV) y un largo periodo de semidesintegración (12 años). Su baja actividad especifica hace su necesario un largo periodo de tiempo para su detección. Se usa para hibridaciones in situ puesto que su baja energía ofrece una alta resolución con poco ruido de fondo.

Otros isótopos fueron el I125 y el I131, este último se desestimó debido al riesgo que producía su uso. El I125 tiene menor energía y un mayor periodo de semidesintegración las emisiones beta y gamma dan una alta sensibilidad y resolución se emplea en hibridaciones in situ.

Nick-translation: produce ADN uniformemente marcado con una alta sensibilidad. Se usa para marcar sondas de ADN bicatenario obtenidas por clonaje con un tamaño de 600 nucleótidos, de los cuales el 30-60 % están marcados con P32 (actividad 109 cpm) o con H3 (actividad 108 cpm).
Proceso:
ADNasa I: corta aleatoriamente el ADN formando extremos 3'-OH y 5'-P.
ADN pol I (5'-3' exonucleasa): elimina 1 o mas bases del extremo 5' de los cortes.
ADN pol I (3'-5'): incorpora nucleótidos en dirección 3' 5', estos nucleótidos están marcados, normalmente solo se marca uno de los cuatro tipos de nucleótidos.
Random-primer: se aplica para marcar sondas lineales de ADN clonado en un vector u obtenidas por PCR.
Proceso:
Se desnaturaliza por calor el ADN y se añade una mezcla de hexanucleótidos sintéticos de todas las secuencias posibles (random primers o cebadores aleatorios).
Algunos hexanucleótidos hibridan y ofrecen un extremo 3'-H que será cebador para la actividad polimerasa del fragmento Kleenow de la ADN polimerasa.
Se añaden nucleótidos siendo solo uno de ellos el marcado que se incorporara en un 60%. Se puede usar cualquier marcaje pero con S35 existe un menor % de incorporación.
Ventajas frente a Nick-translation:
La sonda tiene una actividad especifica mayor y se obtiene en poco tiempo (30').
El ADN no se rompe durante la reacción con lo que se necesita menor cantidad de sonda.
El marcaje se incorpora de modo uniforme por toda la cadena.
Se puede aplicar a fragmentos pequeños de 100-500 pb en los que Nick-translation es menos eficiente.
Marcaje de sondas ARN: se obtienen sondas de ARN marcadas a partir de ADN clonado en vectores de transcripción. Los vectores de transcripción contienen promotores para la ARN pol adyacentes al lugar del clonaje. Después de clonar la secuencia de ADN deseada se añade ARN pol que realiza una transcripción in vitro con dUTP marcado. Se pueden obtener sondas de las dos cadenas del fragmento clonado, sentido y antisentido. Una vez obtenida la preparación de la sonda, se digiere con ADNasa I libre de ARNasas para eliminar el ADN. Es necesario trabajar con inhibidores de ARNasas.
Método Tailing: se usa para marcar sondas oligonucleotídicas. El marcaje se realiza añadiendo una pequeña cola de nucleótidos marcados al extremo 3' de la cadena mediante una deoxinucleotidil-transferasa-terminal. El extremo 5' también puede marcarse mediante una T4 polinucleótido quinasa que transfiere el P del ATP32 al extremo 5' del oligonucleótido, esto puede hacerse directamente porque el extremo 5' no esta fosforilado, si lo estuviese seria necesario desfosforilarlo previamente.
Marcaje no radiactivo: el uso de sondas frías, marcadas con grupos no radiactivos eliminan el problema de la contaminación. Todos estos métodos se basan en la adición a la sonda de un grupo químico reactivo que se detecta después de la hibridación de la sonda con la secuencia diana. Esta detección se basa en la formación de un producto coloreado visible en soporte donde se produce la hibridación o en el soporte donde se produce la formación de modificaciones en la sonda. El problema de estos métodos es el bajo índice de incorporación de grupos detectables y su menor sensibilidad.
Marcaje enzimático: usa la biotina, un complejo de la vitamina B también llamado vitamina H con actividad antigénica que se une a nucleótidos de uridina. Este compuesto puede detectarse mediante anticuerpos conjugados con otros grupos detectables como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa, la fluoresceína o la rodamina, pero es le método indirecto el utilizado con avidina o estreptoavidina que forma un compuesto coloreado al reaccionar con la biotina.

Otro compuesto muy usado es la digoxigenina, esteroide extraído de la planta Digitalis, se une a nucleótidos de uridina en la posición 5' de la base pirimidínica, es un compuesto antigénico que se detecta con anticuerpos de conejo contradigoxigenina modificados con un grupo detectable, aunque normalmente se una a un ac 2º contra-igG portador del grupo detectable.

La fluoresceína se une a nucleótidos de uridina que se incorporan a la sonda a marcar. Se puede detectar directamente o usando ac contra la fluoresceína conjugados con otro grupo detectable o ac 2º también modificados.

Actualmente se usan sondas con fosfatasa alcalina enzima que puede reaccionar con un sustrato quimioluminiscente, dicha reacción emite luz durante 24 horas y puede detectarse con placas fotográficas.

No todos los nucleótidos modificados son buenos sustratos para este tipo de reacciones de síntesis de sondas:

dUTP y dGTP: son buenos sustratos para las ADNpol cuando están modificadas en posición 5.
dATP y dGTP: modificadas en posición 8 no son sustratos adecuados para la polimerasa pero si para la transferasa terminal.
dATP: modificada en posición N6 es incorporada al ADN por varias enzimas.
dUTP, dCTP y dATP: modificados con biotina son incorporados por la transferasa terminal pero si están modificados con digoxigenina solo podrá incorporar dUTP.
dUTP: modificado por biotina es muy usado para sondas frías de ARN puesto que es muy buen sustrato para las ARN pol.
Modificación química: se basa en la adición de grupos detectables directamente sobre las secuencias deseadas. La sonda se marca sin necesidad de reacciones enzimáticas se usan ac 1º y/o 2º para detectar un compuesto que se une a residuos de alguna base.
Marcaje químico con biotina: se usa la fosfobiotina sensible a la luz, que reacciona con los residuos de adenina en la posición N7. con este método se marca una base de cada 50 por ello se usa para sondas de mas de 200 nucleótidos. Posteriormente el ADN marcado se separa con extracción en butanol y precipitación con etanol frío.
Modificación de sondas con grupos químicamente reactivos: consiste en la adición de grupos químicos que se usan posteriormente para añadir grupos detectables.
Marcaje de oligonucleótidos sintéticos: se trata de modificar la sonda mediante la adición de un grupo amino libre en el extremo 5' durante la síntesis de los oligonucleótidos. Este grupo amino se usa después para incorporar grupos detectables como biotina, peroxidasa o fosfatasa alcalina.
Purificación de sondas marcadas.

Después del marcaje de una sonda es necesario eliminar los fragmentos de ADN inespecíficos los nucleótidos marcados no incorporados, las enzimas usadas y el exceso de sales que podrían interferir en la hibridación.

Los métodos son :
Precipitación con etanol: la sonda marcada puede precipitar con etanol y acetato de amonio. La fracción precipitada se recoge y se resuspende.
Electroforesis en geles de acrilamida: los oligonucleótidos marcados pueden ser purificados según su tamaño. Se usa este método para oligonucleótidos marcados por el método Tailing, para ello s somete la sonda a una electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante, detectándose en el gel la sonda de longitud adecuada que se extraerá cortando esa zona del gel.
Cromatografía de exclusión: la filtración en gel de la sonda marcada elimina los nucleótidos libres, marcados y sin marcar. Este método se realiza en columnas de Sephadex, gel constituido por pequeñas esferas que permite una permeabilidad selectiva. Los nucleótidos y moléculas pequeñas quedan retenidas en el gel y las grandes (sonda marcada) pasan a través de las esferas.

Tema 4. Hibridación.

La hibridaciones basa en el apareamiento por complementariedad de bases (C-G y A-T/A-U) de dos secuencias nucleotídicas. Un ADN monocatenario o un ARN de determinada secuencia (sonda) se apareará con otro ADN monocatenario o ARN de secuencia complementaria (diana).

Cuando un ADN bicatenario se calienta a una temperatura superior a la temperatura de fusión se separa en 2 hebras porque se rompen los puentes de hidrógeno, si posteriormente se procede a un lento enfriamiento las hebras se reasocian progresivamente, esto es lo que se llama hibridación y se produce cuando existe complementariedad entre el ADN - ADN o ADN - ARN.

Factores que influyen en la hibridación.
Composición de bases: las moléculas de ADN ricas en GC poseen una Tm (temperatura de fusión) superior a una pobre en dichas bases.
Concentración de ADN/ARN y tiempos Cot y Rot: cuanto mayor es la [ADN] mayor es el numero de copias de las secuencias complementarias y mayor es la velocidad de hibridación. El tiempo Cot: Co es la concentración inicial de ADN en mol/l y t es el tiempo de incubación en segundos, el Cot1/2 es el tiempo que tarda en reasociarse la mitad de las moléculas de ADN durante la hibridación. Cuando se trata de un híbrido ADN / ARN se considera la [ ] y el tiempo necesario para la reasociación del ARN y entonces se usa la variable Rot.
Concentración y tamaño de la sonda: cuando existe un exceso de sonda la velocidad de hibridación depende principalmente de la longitud (complejidad) de la sonda y de su concentración. Tiempos de hibridación superiores a 18 horas dejan de ser efectivos. Las características de una sonda sintética son:

Longitud: 18-50 nucleótidos.
Composición de bases CG entre un 40-60 %.
No deben existir regiones complementarias dentro de la sonda para que no Irbid con ella misma.
Evitar secuencias con mas de 4 bases iguales seguidas.
No debe haber mas de un 70% de homología entre la sonda y cualquier zona del genoma que no sea nuestra diana.
Concentración de ADN diana: la [sonda] debe ser superior a la del ADN diana para que no haya competencia de este ADN diana con otro que no sea diana, pero parecido, produciéndose hibridaciones inespecíficas.
Medio de reacción:
Sales: si disminuye la fuerza iónica disminuye la Tm. Esto se debe a la astringencia, una solución es mas astringente cuanto mas diluida esta y desestabiliza la doble cadena de ADN. Esta propiedad se usa para:

Disminuir el ruido de fondo.
Probar la especificidad de una hibridación.
Obtener deshibridación.
Formamida: disminuye mucho la Tm y se usa cuando la sonda es ARN o cuando es diana.
Dimetil sulfóxido (DMSO): se usa cuando la Tm es baja para reducirla aun mas.
Polímeros inertes: se usan para acelerar las tasas de hibridación de sondas con tamaños superiores a 250 nucleótidos. Estos polímeros son por ejemplo dextran sulfato, polietilenglicol (PEG), ácido poliacrílico, fenol, sales criotrópicas, etc...
Tiempos de prehibridación e hibridación: los protocolos recomiendan prehibridaciones de 3 horas para filtros de nitrocelulosa y 15' para membranas de nylon. Una hibridación puede llevar toda la noche.
Lavados: pueden provocar deshibridaciones si no se realizan a temperaturas adecuadas.
Tipos de hibridación y mecanismos de detección.

Los métodos de hibridación mas comunes son los que implican la inmovilización de uno de los ácidos que intervienen de modo que las moléculas no hibridadas se eliminan mas fácilmente. El soporte sólido de inmovilización suelen ser membranas de nitrocelulosa o nylon, esferas magnéticas o de látex, o placas `microtites'.

Hibridación sobre soporte sólido.
Las membranas de nitrocelulosa: se usan a menudo para inmovilizar ácidos nucleicos en el proceso de hibridación. La unión no es covalente. Después de la fijación a 80ºC durante 2 horas, el ácido nucleico esta fuertemente unido y no se deshibrida ni con lavados fuertemente astringentes.

Los inconvenientes de estas membranas de nitrocelulosa son:

La unión del ácido nucleico requiere altas [ ] de sales.
Los ácidos nucleicos pequeños (< 200 pb) se unen con dificultad.
La fragilidad de la membrana hace difícil su manipulación y no resisten muchas rehibridaciones.
Las membranas de nylon: son mas resistentes y duraderas y permiten la unión covalente de los ácidos nucleicos aunque sean de 10 pb. Requieren calentamiento para fijar los ácidos nucleicos pero los mantienen así dentro de un amplio rango de condiciones. Permiten eliminar la sonda sin despegar la diana de la membrana.
Proceso de hibridación: las secuencias de ADN inmovilizadas por calor sobre la superficie de la membrana (spot blot) se somete a prehibridación con una solución amortiguadora de hibridación sin sonda, luego se sustituye esta solución por la de hibridación con la sonda marcada, la sonda que no haya hibridado se elimina por lavados dependientes del tipo de sonda utilizada.
Radiografía: las sondas marcadas radiactivamente se detectan por radiografía. El tiempo necesario de exposición en placas de rayos X para la visualización de la radiación depende del tipo y cantidad de isótopo usado.
Rehibridación: después de la hibridación y radiografía el filtro se puede deshibridar de la sonda original con un lavado de alta astringencia (! Tª y ![ ]) o con agua destilada a 100ºC y el filtro puede rehibridarse con una sonda distinta para detectar tras secuencias. Una membrana de nylon puede rehibridarse hasta 12 veces, las de nitrocelulosa son muy frágiles pero también pueden rehibridarse.
Hibridación en fase liquida: las secuencias a hibridar están en solución en un tampón y se asocian debido a la agitación térmica. Se trabaja a una Tª 15ºC menor que Tm. Las tres técnicas mas usadas son métodos espectrofotométricos, técnica de la nucleasa S1 y cromatografía del hidroxil-apatito. Y sus aplicaciones son la comparación de los tamaños del genoma de secuencias únicas (STS), análisis global de los % de homología de secuencias entre dos especies próximas y el análisis de secuencias repetitivas.
Hibridación in situ: es la hibridación directa de una sonda con el ADN o ARN de cortes citologicos o de cromosomas metafasicos.
Hibridación in situ sobre cromosomas: los cromosomas se preparan en metafase a partir de linfocitos circulantes, linfoblastos y friboblastos. La hibridación se realiza directamente sobre preparaciones citogenéticas fijadas en un porta y se someten a un tratamiento con ARNasa para destruir el ARNm y una desproteinización mediante proteinasa K.

Las técnicas de bandeo pueden aplicarse antes o después de la hibridación que suele hacerse con un isótopo radiactivo (H3). El resultado se observa al microscopio, las señales positivas se ven como granos sobre los cromosomas.

Hibridación in situ de bacterias para clonaje: el clonaje de un gen consiste en la búsqueda de una cepa de bacterias que hayan integrado unvector recombinante con el gen que nos interesa. Para ello disponemos de un banco celular en placas Petri, se toma una huella de cada placa mediante un filtro de nitrocelulosa o nylon. Las células de estas membranas se lisan y sus cadenas de ADN se separan para hibridarlas con nuestra sonda. Después de lavar se procede a la radiografía para identificar así la placa y la colonia con el ADN diana integrado.

Tema 5. Análisis del genoma.

Técnicas para localizar secuencias y para el análisis de las mismas.

Método Southern.

Se usa para localizar secuencias de ADN genómico.

El ADN se digiere con 1 o mas enzimas de restricción, los fragmentos resultantes se separan según su tamaño en un gel de agarosa por electroforesis. El ADN se desnaturaliza in situ y se transfiere a un soporte sólido (membranas de nitrocelulosa o nylon) y se híbrida con sondas marcadas radiactivamente posteriormente se hace una autorradiografía y se identifican las andas.

Hay tres métodos para transferir fragmentos de ADN de geles de agarosa a soportes sólidos.

Métodos de transferencia:
Transferencia por capilaridad: los fragmentos de ADN se llevan desde el gel al soporte sólido que se cubre con un paquete de papel que asegure el paso, por capilaridad, del liquido en el que está embebido el gel a través del soporte sólido hasta el papel, de modo que arrastre el ADN hibridado y quede preso en el filtro de nylon o nitrocelulosa en el cual se fijara mediante diferentes métodos.
Transferencia por vacío: se hace pasar la solución al filtro de nitrocelulosa o nylon por extracción mediante una bomba de vacío.
Transferencia electroforética: el gel se coloca entre dos esponjas y se introduce en una cubeta que se mantine fria puesto que el voltaje elevado que se necesita puede interferir en el proceso.
Aplicaciones del método Southern.
Mapas de restricción: el ADN a analizar se reparte en fracciones que se tratan con diferentes enzimas de restricción, los fragmentos obtenidos se separan por Southern usando una sonda del gen. Las medidas de los fragmentos están en función de su distancia de migración y se comparan con un marcador de peso molecular cuyo tamaño sirve de patrón. Se pueden hacer reglas de tres entre distancia migrada de un fragmento con la distancia recorrida y las Kb de un fragmento marcador, para averiguar las Kb de nuestro fragmento problema.

La comparación de los mapas de restricción del ADN genómico con su correspondiente ADNc permite tener una idea de los intrones que posee el gen.

Detección de polimorfismos: la mayoría del ADN genómico de un organismo superior no es codificante. Si se analiza una secuencia no codificante de una región autosómica en 10 cromosomas de diferentes individuos puede existir una variación de 200 pb, estas variaciones constituyen polimorfismos.

Los polimorfismos son estables, se transmiten de manera mendeliana y constituyen la base molecular de la diversidad genética entre individuos de la misma especie.

Tipos de polimorfismos:
RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism): son fragmentos de restricción de longitud variable, polimorfismos del ADN que se detectan por enzimas de restricción. Hay 4 puntos importantes a tener en cuenta en el análisis de RFLP:

El patrón observado depende de la sonda utilizada en el análisis.
El cambio de una base detectada por una enzima de restricción que origina un RFLP no es responsable de una enfermedad genética, carece de consecuencias funcionales. Es útil para marcar un cromosoma y seguir su segregación.
Se transmiten de modo mendeliano.
Si se usan RFLP para seguir la herencia de un cromosoma en una familia, los mas útiles serán aquellos donde la mayoría de los individuos sean heterocigotos. Si el 99% de la población lleva uno de los alelos y el otro alelo lo porta solo el 1%, dicho alelo será un marcador poco significativo puesto que la mayoría de los individuos serán homocigotos (99%). Es importante conocer el contenido de información del polimorfismo (PIC) que se calcula en base a la probabilidad de que un individuo sea heterocigoto para un locus dependiendo de la frecuencia de los alelos en la población.

Los RFLP pueden detectarse por PCR sin transferencia ni hibridación, si se conocen las secuencias flanqueantes de dicho RFLP se amplifica digiere y analiza por electroforesis.

VNTR (Variable Number of Tandem Repeats): son un numero variable de repeticiones en tándem, también llamados minisatélites. Se descubrieron mediante Southern , se caracterizan por la presencia de secuencias cortas y repetidas ordenadas en tándem. Dichas secuencias tienen 9-60 pb y su función no se conoce. El numero de repeticiones difiere entre cromosomas homólogos y varia desde 4/5 a varias docenas. Se detectan mediante Southern y/o enzimas de restricción. Este tipo de secuencias permite el estudio simultaneo de 60 locis autosómicos en un individuo. Como cada loci es multialélico la probabilidad de encontrar 2 individuos no emparentados con un perfil de restricción idéntico es mínimo ("10-20). Los minisatélites permiten establecer fácilmente la especificidad genética de un individuo o de una línea celular y la filiación de las mismas. Son muy utilizados en pruebas de paternidad y en medicina forense.
STR (Short Tandem Repeats) son repeticiones cortas en tándem.
Detección de deleciones: detecta mutaciones de no menos de 40 pb. Deleciones menores pueden detectarse por PCR y las mayores por electroforesis en campo pulsante.
Análisis de mutaciones puntuales.

Las alteraciones de una base en la secuencia nucleotídica constituyen las mutaciones más comunes en la mayoría de los loci génicos. No todas causan enfermedades. Para detectar estas mutaciones se elige un método en función de la naturaleza de la mutación, del tamaño y estructura del locus, de la disponibilidad de ARN, de las fuentes disponibles, etc...

Mutaciones puntuales desconocidas.

Los heterodúplex de ADN o ARN (tipo salvaje / mutante) se caracterizan por el apareamiento incorrecto de nucleótidos en el sitio de la alteración. Estas mutaciones puntuales desconocidas se analizan por diferentes métodos.

Corte enzimático: el heterodúplex ARN/ARN constituido por un ribosonda salvaje marcada y un ARN mutante obtenido por PCR se trata con ARNasa A, que corta el ARN monocatenario. El producto se analiza por electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante y si se produce apareamiento se observaran dos fragmentos. Hay que marcar las dos cadenas de ARN para que la eficacia de la ARNasa Asea de un 60% y no de un 30% (con una cadena marcada).

Gel Desnaturalizante

Homocigoto	Heterocigoto

Arn mutado corte con

Arn normal hetrodúplex arnasa a

Modificación química: corte químico con apareamiento incorrecto (CCM Chemical Cleavage of Mistmatch), se basa en los principios de secuenciación de Maxam y Gilbert. Un heterodúplex ADN salvaje marcado / ADN o ARN potencialmente mutado, se corta por los pb mal apareados que han sido modificadas previamente de modo químico. Los desapareamientos que implican una citosina se marcan con tetraóxido de osmio (OsO4) y los que implican un timina con hidroxilamina (HA). La sonda se marca con P32 y se híbrida con la secuencia potencialmente mutada, se incuba una muestra con OsO4 y otra con HA, cada una se trata con piperidina que corta el ADN a la derecha de la base químicamente modificada. Se analizan los fragmentos en geles desnaturalizantes de acrilamida. Este método es fiable al 100% pero es lento y los productos químicos muy tóxicos.

NORMAL MUTADO

MARCAJE

HETEROUPLEX

MODIFICACIÓN QUIMICA

CON OsO4 : CON HA:

TRATAMIENTO CON PIPERIDINA

GEL DESNATURALIZANTE

HOM

HET

HOM

HET

——

Comportamiento electroforético:
Polimorfismos de conformación se cadenas sencillas o SSCP (Single Strands Conformation Polimorphism): se basa en la variación de movilidad electroforética en geles de acrilamida desnaturalizantes de moléculas de ADN o ARN que difieren en su secuencia. La estructura 2ª del ácido nucleico varia según su secuencia y también disminuye a medida que aumenta el tamaño. Esta técnica es útil para fragmentos cortos de ADN, la eficacia es del 90% para mas de 200 pb y del 70-80% para mas de 400 pb.

La secuencia de ADN se marca durante la PCR es producto se desnaturaliza calentando y enfriando bruscamente para evitar la reasociación de cadenas que formaran estructuras monocatenarias. El resultado se analiza por electroforesis. Se usa siempre un ADN control que no este mutado con seguridad. Esta técnica establece la presencia o ausencia de la mutación.

ADN NORMAL PCR ADN MUTADO

DESNATURALIZACION

ELECTROFORESIS

ADN NORMAL ADN MUTADO

Análisis del heterodúplex: es iugual que la SSCP pero en este caso la variación de movilidad electroforética viene dada por el mal apareamiento de bases.
Electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes o DGGE (Denaturing Gradient Gel Electroforesis): la TM de un fragmento de ADN esta en función de su secuencia, una mutación puntual implica una variación de Tm esto puede evidenciarse por medio de una electrofoersis en gel de acrilamida donde se ha establecido un gradiente lineal desnaturalizante (urea o formamida). Los fragmentos de ADN migran según su tamaño en kb hasta que entran en la zona del gradiente donde se desnaturalizan y se separan. La migración de las bandas debe compararse con un ADN de referencia.
Mutaciones puntuales conocidas:
Mutaciones que crean o destruyen un sitio de restricción: una mutación que sucede en una secuencia para una enzima de restricción destruye dicho sitio y al revés. Para evidenciar estas mutaciones se puede aplicar Southern, PCR y digestión enzimática.
Hibridación: la hibridación con oligonucleótidos de alelos específicos (ASO Allele Specific Oligonucleotide), consiste en la hibridación diferencial mediante oligonucleótidos de secuencias especificas de 15-20 pb. Los oligonucleótidos se sintetizan con la mutación en el centro y se hibridan con el ADN diana, de modo que solo se produzcan apareamientos correctos.
Amplificación: de alelos específicos (ASA) depende de la amplificación selectiva por PCR. La técnica ARMS (Amplification Refractory Mutation System) se basa en la selección de cebadores para la amplificación solo de la zona mutada. La reacción de ligamiento en cadena de oligonucleótidos (Ligation Chain Rection, LCR)utiliza la Taq ligasa termoestable para la amplificación. Se requieren 2 oligonucleótidos de 20 pb una que termine antes de la base mutada y otro cuya 1ª base sea donde se produce la mutación, estos se hibridan con el ADN y si este esta mutado la 1ª base del 2º nucleótido (sin mutación) no hibridara.

Tema 6. Secuenciación.

Secuenciación química, método de Maxam y Gilbert.

Se basa en la capacidad de determinadas sustancias de codificar específicamente bases del ADN. Estas sustancias son hidracina, dimetil sulfato (DMS) y ácido fórmico.

Primero se modifican específicamente las bases (G DMS, G+A ácido formica, T+C hidracina, Chidrazina+NaCl), posteriormente la piperidina corta las bases modificadas. Se procede a una separación electroforética en gel de acrilamida y posterior revelado. La lectura se realiza de 5' a 3', desde la parte inferior del gel hasta la superior, por ello es necesario marcar el extremo 5' con P32.

Este método es optimo para secuencias de ADN con menos de 250 nucleótidos a partir del extremo marcado.

Cultivo de adn con modifocadores químicos.

(Mucho adn con 1 MODIFICADOR / TUBO)

Incubación con piperidina que corta a diferentes alturas diferentes fragmentos de cada tubo.

Separación electroforetica en gel de acrilamida y revelado.

Adn+DMS+ piperidina	Adn+ ac.formico+ piperidina	Adn+ hidrazina+ piperidina	Adn+NaCl+ Hidrazina+ piperidina	cadena original
Reacción G	Reacción G+A	Reacción T+C	Reacción C	cadena original
——	——	——	——	Gatcggacct
		——		Gatcggacct
		——	——	Gatcggacc
		——	——	Gatcggac
	——			Gatcgga
——	——			Gatcgg
——	——			Gatcg
		——	——	Gatc
		——		Gat
	——			Ga
——	——			G

Secuenciación enzimática, método de Sanger o de los dideoxinucleótidos.

Implica la síntesis de ADN por una ADN polimerasa in vitro, a partir de un molde de ADN monocatenario o bicatenario pero desnaturalizado.

Primero se incuba el ADN molde con un cebador especifico para que se unan, posteriormente se realiza otra incubación con deoxinucleótidos (dNTP) y se realiza otra incubación; es en este paso donde la síntesis de ADN se interrumpe, al incorporar el dNTP puesto que carecen de grupos 3'-OH donde seguir incorporando nucleótidos. Esta reacción se realiza en tubos separados cada uno con un solo tipo de dNTP diferente. Se obtienen de este modo un gran numero de fragmentos de diferentes tamaños. Se procede con una electroforesis en gel de poliacrilamida en el que se leen las secuencias de 5' a 3'.

Incubación de adn+cebador.

Incubación adn+ddNTP en tubos diferentes

en cada tubo un ddNTP.

Interrupcion de la síntesis.

Electroforesis.

	Reacción A	Reacción T	Reacción G	Reacción C	Cadena complementaria.
3'			——		attagacgtccg
				——	attagacgtcc
				——	attagacgtc
		——			attagacgt
			——		attagacg
				——	attagac
	——				attaga
			——		attag
	——				atta
		——			att
		——			at
5'	——				a

Tipos de secuenciaciones enzimáticas:
Secuenciación cíclica: muy usada un en la detección de mutaciones puntuales.
Secuenciación múltiple: los productos de la secuenciación se someten a electroforesis en gel y se híbrida con una onda especifica, se deshibrida con otra sonda especifica diferente de la 1ª en el mismo carril del gel, de este modo se secuencia sibre una membrana varias veces.
Secuenciación automática: los cebadores se separan en 4 fracciones y se marcan en su extremo 5' con colores diferentes, una fracción con fluoresceína, otra con NBD, otra con rojo tejas, y una4ª con tetrametrilrodamina. A cada fracción se le añade un ddNTP y se incuba. Todos los fragmentos que hayan incorporado el mismo ddNTP se marcan con el mismo color; se mezclan todas las fracciones y se colocan en un gel de secuenciación. Cada banda observada corresponde a un conjunto de fragmentos de igual tamaño y estará marcada con el fluorocromo correspondiente al cebador usado en la síntesis de los fragmentos. Se procede a una electroforesis continua en un carril y el color de la banda se determina al excitar l fluorocromo por rayo láser situado en la base del gel . la señas la analiza un ordenador que establece l secuencia del fragmento.
Secuenciación quimioluminiscente: después de la electooresis de los productos de secuenciación biotinilados, estos se transfieren y fijan a una membrana de nylon y se detectan mediante una reacción quimioluminiscente, la estreptoavidina fija los productos de secuenciación a la fosfatasa alcalina biotinilada inmovilizando a la fostasa; con la desfosforilacion por la fosfatasa alcalina el sustrato dioxetano emite luz que se detecta por autorradiografias.

Tema 7. Clonación.

El clonaje es la recombinación in vitro de un gen o de un fragmento de ADN con un vector que se replica de forma independiente dentro de la célula hospedadora.

Un clon es una colonia de bacterias idénticas entre si, procedentes de una única bacteria. Un clon recombinante será aquel que contenga el vector en el que se ha insertado el ADN genómico o de ADNc.

Genotecas de ADN genómico.

La construcción de una genoteca de ADN genómico consiste en fragmentar el ADN e introducir cada fragmento (inserto) en el vector apropiado y posteriormente en el hospedados.

El ADN procede de cualquier célula excepto sise trabaja con genes que sufren reordenamientos somáticos específicos de tejido (genes de la inmunidad). Como células hospedadoras suelen usarse cepas de E.coli res (-) (restricción negativa), en las que las enzimas de restricción no destruyen el ADN insertado, y las cepas E.coli rec A-, en las que no se produce recombinación del inserto con el ADN bacteriano o consigo mismo. Cuando una genoteca esta perfectamente establecida contiene de forma entrecortada, el conjunto de la información de un individuo tal y como esta en su genoma.

Este tipo de genotecas se usan para:

Clonar genes de los que se quiere descifrar información.
Clonar fragmentos de ADN no transcritos a ARN y adyacentes a genes , se sabe que estos fragmentos son muy importantes en la regulación génica.

Genotecas de ADNc.

Un ADNc o ADN complementario es la copia de un ARNm en forma de ADN. Para que una genoteca de ADNc sea representativa deberá contener al menos una copia de cada ARNm presente en la célula de la que provienen dichos ARNm. Estas genotecas son especificas de cada tipo celular, puesto que cada tipo de células poseen unos ARNm concretos que le permiten su diferenciación celular. Una proteína presente en bajas cantidades en una célula y con vida muy corta puede tener mas mensajeros que la codifiquen que una proteína que este en grandes cantidades y que tenga una vida larga, en la misma célula también pueden existir mensajeros que no se traduzcan a proteínas.

Los ARNm se incuban en presencia de una ADN polimerasa dirigida por ARN y de una mezcla de 4 desoxirribonucleósidos trifosfato (dXTP) y de un polidT corto, este ultimo híbrida con el ARNm y sirve de cebador a la polimerasa. Cuando ha copiado como ADN el ARNm este se destruye t se sintetiza la hebra complementaria del ADN mediante el fragmento de Kleenow de la ADN pol I de E.coli. La transcripción de ARNm a ADN la realiza una transcriptasa inversa.

Bibliografía:

- Técnicas de biología molecular.

M. Baiget, P. Gallano y E. Tizzano ; coordinación E. Frey

En la facultad de Ciencias de Vigo: 577.TEC

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Biología molecular Material genético ADN (Ácido Desoxirribonucleico)ARN (Ácido ribonucleico)Vectores plásmidos Hibridación Clonación

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