TEMA 1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y SUS APLICACIONES.

* INTRODUCCIÓN.

(Griffiths. "Genética", pag 447 ).

* "La reacción en cadena de la polimerasa o PCR ( del ingles "polimerasa chain reaction") es un método que amplifica enormemente un única copia de un gen o de parte de un gen, mediante reacciones sucesivas de la polimerasa de ADN. Se utiliza un polimerasa resistente a la temperatura, la polimerasa taq, de Thermus aquaticus.

Por este sistema se alargan los cebadores sobre cadenas opuestas en sentido contrario cada uno hacia el otro. Tras terminar la replicación del tramo entre los cebadores (un ciclo), los dos fragmentos de doble cadena nuevos se desnaturalizan por calor para producir moldes de cadena sencilla, que son sometidos a un segundo ciclo de replicación mediante bajada de la temperatura, en presencia de todos los componentes necesarios para la polimerización. Ciclos repetidos de síntesis y desnaturalización originan un incremento geométrico en el número de tramos replicados.

Mediante PCR pueden detectarse una única copia de un gen humano, después de la amplificación, siempre que puedan sintetizarse cebadores correspondientes a secuencias conocidas del gen".

* Esta técnica fue ideada por A.K.Mullis en los años 80 y es un sistema de amplificar ADN basado en un proceso natural llamado replicación de ADN. La replicación del ADN es un proceso limitado de amplificación por las condiciones ambientales.

* Los requerimientos de esta técnica son los mismos que para la replicación del ADN. Se necesita de:

*ADN molde.

*Oligonucleótidos específicos o "cebador".

*Polimerasa del ADN termoestable.

* REPLICACIÓN DEL ADN.

La replicación es un proceso de duplicación de un molécula preexistente de ADN y está limitada.

Se necesita de:

*polimerasa de ADN III.(lleva la mayor parte de la síntesis de ADN)

*nucleótidos.

*cebador (molécula de ARN).

*polimerasa de ARN I (rellena los huecos) .

*Ligasa de ADN (une los fragmentos de Okazaki).

Los nucleótidos trifosfato son componentes básicos del ADN tienen polaridad 5´- 3´. Por tanto originan extremos distintos en la cadena de ADN dependiendo de la posición del carbono en la desoxirribosa:

*5´ hay un grupo fosfato (PO4)

*3´ hay un grupo hidroxilo (OH).

La polimerasa añade nucleótidos al extremo 3´ de la cadena en formación por tanto la cadena de ADN crece de 5´ a 3´. La polimerasa crea enlaces fosfodiester entre el fosfato 5´de un nucleótido y el OH 3´ del nucleótido de la cadena.

P(5´)

OH 3´ 5´

Molde. 5´ 3´

La polimerasa es una enzima con limitaciones pues es incapaz de fabricar ADN de novo. Es necesario un "cebo" con un extremo OH libre. En la célula existe una enzima que de forma natural coloca un cebo de ARN complementario a la cadena molde y sobre el extremo OH 3´ libre de este cebo trabaja la polimerasa de ADN que va rellenando los huecos libres que quedan entre cebadores.

Cebador ARN ADN Cebador ARN

3´ 5´

Molde. 5´ 3´

Cadena líder y cadena retrasada.

Las polimerasas de ADN sintetizan nuevas cadenas sólo en dirección 5´*3´. La consecuencia de esta polaridad es que mientras una de las cadenas, la cadena líder, se sintetiza de forma continua, la otra, cadena retrasada, debe ser sintetizada en pequeños segmentos discontinuos.

Molde 3´

Cebo 5´

Cadena líder 3´ movimiento de la horquilla 5´

5´

3´

cadena retrasada

fragmentos de Okazaki

3´

5´

La cadena retrasada debe crecer en dirección opuesta al movimiento de la horquilla de replicación. Conforme el movimiento de la horquilla expone una nueva zona de la cadena molde de la cadena retrasada, se inicia la síntesis de un nuevo fragmento de la cadena retrasada, el cual se aleja de la horquilla de replicación hasta que es detenido por el fragmento sintetizado anteriormente.

Los fragmentos de la cadena retrasada son unidos por la enzima ligasa de ADN. Las ligasas de ADN unen fragmentos rotos de ADN al catalizar un enlace fosfodiester entre el fosfato del extremo 5´ de un nucleótido y un OH 3´de un nucleótido adyacente. Es la única enzima capaz de unir ADN.

Los fragmentos de ADN sintetizados a partir de los cebadores en la cadena retrasada se denominan fragmentos de Okazaki.

Los cebadores se eliminan y se rellena los huecos con ADN que son sellados por las ligasas.

* SíNTESIS DE ADN IN VITRO.

Podemos reproducir la replicación in vitro ,para ello necesitamos:

* ADN molde.

* polimerasa I de ADN.

* nucleótidos trifosfatos.

* Cebadores también se les llama "oligonucleótidos" , son pequeñas cadenas de ADN:

*En vez de usar cebadores de ARN usamos cebadores de ADN para que la polimerasa pueda sintetizar ADN directamente, así es más cómodo por que el ADN se maneja mejor que el ARN (ARN es más inestable).

*podemos usar "cebadores específicos", es decir, conocida la secuencia molde podemos fabricar cebadores de secuencia complementaria, son específicos de la región que queremos clonar o podemos usar también "cebadores aleatorios" que son determinadas secuencias de ADN que por azar hibridan con la secuencia de ADN que queremos amplificar, por ejemplo en el caso de que no conozcamos la secuencia que queremos amplificar.

* Tenemos ADN de doble cadena que contiene la secuencia que queremos amplificar (secuencia diana).

* Se eligen o crean dos cebadores cuyas secuencias complementan con los extremos 3´ de una u otra de las cadenas del gen diana. La PCR acota la zona que se va a amplificar con los cebadores. De manera que diseñamos oligonucleótidos específicos y adyacentes a la zona que queremos amplificar.

* Las dos cadenas se separan por calor, permitiendo que los dos cebadores se unan a sus secuencias complementarias. De esta manera los cebadores flanquean la secuencia diana.

5´ 3´ 5´ acotación 3´

desnaturalización 5´primer 1

3´ 5´ unión a primers 3´ 5´ secuencia diana primer 2

Los cebadores son de unas 20 bases. Tenemos dos cebadores; primers 1 y primers 2. Cada uno es específico y complementario a una secuencia de una de las cadenas

Primers 1 es específico para la secuencia adyacente al extremo 3´ de la zona a replicar en una de las cadenas. Acota al gen diana por su secuencia complementaria en el extremo 3´ .

Primers 2 es específico para la secuencia adyacente al extremo 3´de la zona a replicar en la otra cadena. Acota al gen diana en el extremo 3´.

* La polimerasa taq sintetiza las primeras cadenas complementarias de la reacción. Estas dos cadenas nuevas tienen longitudes variables por que no tienen una señal común de parada. Se extienden más allá de los extremos de la secuencia diana delimitada por los sitios de unión de los cebadores. Ya que cuando los cebadores hibridan, la polimerasa empieza a replicar el ADN desde el cebador hasta lo que pueda sintetizar, es decir, hasta que se acaba el molde.

5´ 3´

3´ 5´

3´ 5´

5´ 3´

* Las dos moléculas de cadena doble se calientan de nuevo para que expongan sus cuatro sitios de unión a los cebadores. Los cebadores se unen nuevamente a sus cadenas respectivas en los extremos 3´de la región diana.

3´ 5´

5´ 3´

* La polimerasa sintetiza de nuevo dos cadenas complementarias. A pesar de que las cadenas molde tienen longitudes variables en esta etapa, las dos cadenas sintetizadas a partir de ellas tienen la longitud precisa de la secuencia diana.

Se acotan por el extremo 5´, se sintetiza la secuencia entre los cebadores. La secuencia se acota por los dos lados al cabo de varios ciclos de replicación.

Esto se debe a que cada cadena nueva empieza en el sitio de unión del cebador, en un extremo de la secuencia diana, y continua hasta que se acaba el molde, en el otro extremo de la secuencia diana.

Ahora cada cadena nueva comienza en una secuencia del cebador y termina en la secuencia de unión al otro cebador.

3´ 5´

5´ 3´

5´ 3´

3´ 5´

Estos ciclos se repiten sucesivas veces y podemos obtener millones de moléculas.

* Al principio del uso de esta técnica era muy complicarlo realizarla, se tenía que hacer a mano y el inconveniente que tenía era que el ADN se desnaturaliza a 95ºC, los cebadores a esta temperatura no hibridan, y por tanto hay bajar la temperatura a 50 ºC y al añadir la polimerasa hay que bajarla más aún por que sólo es funcional a 36ºC. En el segundo ciclo hay que volver a subirla a 95ºC para volver a desnaturalizar el ADN, volver a bajarla para la hibridación de cebadores, etc. En cada ciclo debemos volver a poner polimerasa, pues en la denaturalización se pierde.

* Esta técnica ha empezado a funcionar bien cuando se ha encontrado una polimerasa que es funcional a los 95ºC. Estas polimerasas se han encontrado en organismos que viven en lugares con temperaturas altas (bacterias de aguas termales..). se ha aislado de Thermus aquaticus y se llama polimerasa taq. Existen otras polimerasas mejores que esta y son las que se usan ahora.

* Hoy en día existen termocicladores que realizan los ciclos de la amplificación. Son máquinas donde introducimos tubos con el ADN molde, oligos, nucleótidos trifosfatos y polimerasa resistente a altas temperaturas, y se dan los ciclos de subida y bajada de temperatura. Este aparato se programa para un número de ciclos determinado que consisten en :

Minutos a 96ºC*desnaturalización

Minutos a 50ºC*reasociación molde-cebador

Minutos a 72ºC* activación de la polimerasa y síntesis de ADN.

La amplificación del ADN es una alternativa al uso de plásmidos para la clonación.

* Uso de plásmidos como vectores de clonación.

Consiste en la introducción de la secuencia de ADN que queremos clonar en un plásmido. Este plásmido lo introducimos en una bacteria. Al aumentar el número de bacterias con el plásmido en cultivos, aumentamos el número de plásmidos y por tanto del gen (amplificación). Para obtener el gen tenemos que extraer el plásmido de la bacteria.

En los cultivos obtenemos bacterias todas iguales con el mismo material genético.

Con el sistema de la PCR es mucho más fácil y rápido pues no tenemos que cultivar bacterias no esperar a que crezcan.

* APLICACIONES DE LA PCR.

*Clonación.

*Detección de mutaciones y enfermedades genéticas.

*Inducción de mutaciones in vitro.

*Identificación de polimorfismos moleculares (Huella genética).

*Obtención de ADN para secuenciación.

*Amplificación indiscriminada de ADN.

Detección de mutaciones.

La PCR no sólo se aplica a la investigación básica- también se aplica como un sistema de diagnóstico de mutaciones asociadas a enfermedades hereditarias.

Detecta mutaciones conocidas.

Lo importante es tener caracterizada la mutación, es decir, conocer la base molecular de la mutación, Hoy en día se sabe cada vez más a que mutación son debidas determinadas enfermedades genéticas.

Por ejemplo, tenemos dos moléculas de ADN bicatenario, en una de ella hay una mutación debida a un cambio de un par de bases.

silvestre A/T alelo 1

mutante C/G alelo 2

Alelo = copia de una cadena de una misma molécula de ADN que varia por una mutación.

Esa mutación determina un cambio de aminoácido que provoca un cambio en la proteína.

* Para la detección de la mutación diseñamos unos oligonucleótidos específicos (cebador) de la zona que contiene la mutación en cada alelo.

El "oligo" específico para el alelo 1 contiene las bases A/T.

El "oligo" específico para el alelo 2 contiene las bases C/G.

Cebador 1. T oligo común

Cebador 2 C oligo común

Para la PCR necesitamos otro oligo específico para otra región del ADN que delimite la región a amplificar. Este oligo es común a los dos alelos pues es complementario a la zona del ADN no mutada.

* Detectar la presencia de alelo 1 en nuestro ADN molde.

* Para ello amplificamos la región del ADN que contiene el alelo 1, flanqueando esa zona con los "oligos" ( cebador 1 y cebador común).

5´ 3´

A/T cebador común

cebador 1 3´ 5´

De manera que amplificamos una banda entre los dos oligos.

* Hacemos lo mismo pero usando los oligos específicos para el alelo 2. El cebador 2 hibrida con alelo 1 menos por la base que los diferencia. Esto impide que la polimerasa pueda formar ADN complementario a partir de este cebador. C

no amplificación

A alelos

1 2

Con el cebador 1 obtenemos amplificación. AEP 1 + -

Con el cebador 2 no obtenemos amplificación. AEP 2 - +

Con la PCR podemos averiguar frente a que alelo estamos siempre que conozcamos la base molecular de la enfermedad, o de la diferencia de los alelos. En pocas horas obtenemos los resultados del test.

También se puede usar para detectar delecciones (pérdida de un fragmento de ADN)

Inducción de mutaciones in vitro

Con la técnica de la PCR podemos modificar una secuencia de ADN, por ejemplo para estudios sobre lo que ocurre cuando se produce un cambio en parte de una secuencia importante para la funcionalidad de una proteína.

Se suele provocar la inducción in vitro cuando estudiamos un gen y conocemos su estructura, función...y queremos conocer los aminoácidos importantes del motivo de una proteína. Antes se buscaban mutantes, ahora se producen las mutaciones in vitro (mutagénesis in vitro).

Para realizar mutagénesis in vitro con la PCR, partimos de una molécula de ADN bicatenario. Lo que queremos hacer es cambiar un par de bases por otro. * Diseñamos dos juegos de oligos (dos pares): par 1-1M y par 2- 2M.

G

1M 2

5´

A

C 1 2M

3´

T

Los cebos "M" contienen el cambio de bases que queremos formar en la secuencia de ADN.

Los oligos son complementarios a la secuencia de ADN en todas sus bases excepto en los cebos "M" en la que contienen el cambio queremos realizar.

El par 1-1M flanquean la región 1 de la secuencia y amplifican esa zona.

El par 2-2M flanquean la región 2 y la amplifican.

* Por tanto hacemos dos PCR distintas:

1º usamos combinación 1-1M.

G

1M G

5´

1 A

3´

C

De manera que amplificamos el ADN entre estos dos cebadores. Al cabo de muchos ciclos de PCR, hemos amplificado el cambio de bases.

2º usamos combinación 2-2M.

2

5´ G

2M A

3´

T C

Ocurre lo mismo, se amplifica la región entre cebador 2 y cebador 2M.

Se amplifica la secuencia que contiene la mutación del cebador 2M.

* Los productos de las dos PCR se combinan en un tubo, se separan las cadenas y volvemos a hacer PCR, esta vez no ponemos cebadores "M" pues las cadenas separadas hibridan por las secuencias comunes, es decir por las secuencias complementarias a los cebadores M.

usamos los cebadores 1 y 2 para amplificar el trozo de cadena que le falta.

5´ 3´

3´ 5´

obtenemos ADN con el cambio de bases:

Este sistema provoca mutaciones dirigidas, pero tenemos que conocer la secuencia que queremos mutar.

Identificación de polimorfismo moleculares.

Se usa la PCR en pruebas de paternidad, pruebas forenses, pruebas de identificación por ADN..

Se puede hacer de dos maneras: por hibridación y con PCR.

La PCR se usa sobre todo en la especie humana. En el ADN humano tenemos secuencias repetidas de pequeño tamaño que se repiten en tamden.

Las poblaciones humanas son polimórficas para el número de secuencias que se repiten, y se llaman secuencias "minisatélite" o "microsatélite".

Microsatélite, la secuencia que se repite es menor de 10 pb (1-10 pb).

Minisatélite, la secuencia que se repite es mayor a 10 pb (10-100 pb).

Si analizamos el ADN de toda la clase observaríamos que el numero de veces que se repiten estas secuencias es variable en cada uno de nosotros. Pero que en todos nosotros estas secuencias están en regiones concretas de nuestro ADN.

Este polimorfismo se usa para hacer la huella genética de un individuo. Es imposible encontrar dos individuos con la misma huella genética.

Ejemplo fig 1, tenemos tres individuos:

Individuo A* alelo 1= (CA)16 * 16 repeticiones de secuencia de 2 pb.

Individuo B* alelo 2= (CA)14 * 14 repeticiones de esa misma secuencia.

Individuo C* alelo 3= (CA)11 * 11 repeticiones de esa misma secuencia.

Estas secuencias tienen un alto valor informativo por la gran variabilidad. Para detectar estas repeticiones usamos la PCR. Para ello debemos conocer:

- En que región del ADN están estas repeticiones y así saber que región debemos amplificar.

- Las secuencias adyacentes a la zona de repetición para diseñar los cebadores.(P1 y P2)

Amplificamos y puesto que la secuencia que se repite = 2 pb y los 2 Oligos = 40 pb+ 2= 80 pb, obtenemos que:

Individuo A* amplificamos 16 repeticiones. * 16*2+80=112 pb

Individuo B* amplificamos 14 repeticiones. * 14*2+80=108 pb

Individuo C*amplificamos 11 repeticiones. * 11*2+80=102 pb

Y por tanto al correr en un gel de poliacrilamida, los productos de la PCR, que nos separa la muestra por sus distintos tamaños, obtenemos tres bandas distintas correspondientes a los tres individuos.

Al tener dos cromosomas, podemos resultar ser homocigóticos para ese alelo y entonces nos aparecen una banda o podemos se heterocigóticos para ese alelo y obtenemos dos bandas diferentes de distintos tamaño. Alelos

1 2 3

112

108

102

Esa variabilidad en el número de repeticiones permite hacer patrones de bandas de cada individuo de la población con la PCR. Obtenemos un gel con distintas bandas pertenecientes a distintos individuos, usando cebadores para varios polimorfismos.

Esquemas de patrones de bandas:

Esquema 1:

Representa un gel donde hemos hecho una electroforesis de muestras de distintos individuos. El gel muestra el patrón de banda de los individuos.

Ejemplo: Tenemos tres parejas que tienen un hijo a la vez en el hospital y se mezclan los niños. Se realiza una PCR para identificarlos.

Se cogen muestras del ADN de cada pareja y de cada niño y se comparan los patrones de bandas.

El patrón de bandas corresponde a la secuencia de ADN que se amplifica de cada para de cromosomas.

Observamos el patrón de bandas de cada niño y comparamos con las distintas parejas para ver a cuál se parece más.

Niño 1: su patrón no corresponde con la pareja Smith, no coincide ninguna de las bandas del patrón del niño con las bandas de esta pareja.

En cambio es muy similar al patrón de bandas de la pareja Stevenson.

Niño 2: es hijo de los Jones.

Niño 3: es hijo de los Smith.

Smith. Steven. Jones 1 2 3

Es muy difícil encontrar dos patrones iguales si no son parientes.

Esquema 2.

Ejemplo caso en el que tres señoras reivindican la paternidad de sus hijos a un mismo hombre.

El patrón es más complejo que en el caso anterior.

Comparamos el patrón del supuesto padre con los patrones de las madres y los niños.

En el hijo X aparecen bandas que no aparece en el patrón de la madre X ni del supuesto padre. Lo mismo ocurre con el niño Z. Por tanto no son hijos de este "padre".

En el hijo Y tiene cuatro bandas que proceden de la madre y otras cuatro que proceden del padre (es su hijo).

Padre Mad X hijo X Mad Y hijo Y Mad Z hijoZ

Esquema 3

Es muy usado en el mundo forense para identificar pistas y relacionarlas con sospechosos. Por ejemplo por restos de sangre de la víctima o del asesino, pelos, semen...existe mucho material de donde se puede sacar ADN. La PCR amplifica eficazmente muestras muy pequeñas de ADN.

Existen sistemas estandarizados, se venden en forma de "kits" y se aplican en los análisis de estas muestras. Cuanta más información de ese "Kits" más fácil es obtener una relación genética.

Por ejemplo una víctima que tiene dos sospechoso, comparamos el pelo que se ha encontrado en la víctima con el ADN de los dos sospechosos.

Están basados en patrones de hibridación.

El ADN humano a parte de ser polimórfico para secuencias repetidas también lo es para regiones del ADN no basadas en repeticiones. Tenemos genes de antígenos que son muy variables en la población (regiones variables).

Se han elaborado sondas de ADN específico de una serie de variantes antigénicas, estas sondas las pegamos a unos filtros y las comparamos con un control.

Hibridamos la sonda desnaturalizada, marcada con un fluorocromo o con un producto radiactivo y pegada al filtro, con el ADN que hemos extraído de los sospechosos y observamos que ocurre comparando los patrones de hibridación con el de la víctima.

La sangre de la víctima tiene el patrón 1.1,3 por que en el filtro hibrida con 3 y con 1.1: 1´2

1 2 3 4 c 1´1 1´3 1´3 todos excepto 1.3

4

El pelo encontrado en la víctima presenta el patrón 1.3,4, pues da positivo en 1.3 y en 4, por tanto el pelo no pertenece a la víctima y podría pertenecer a uno de los sospechosos:

1´2

1 2 3 4 c 1´1 1´3 1´3 todos excepto 1.3

4

comparamos este patrón con el del ADN sacado de la sangre de los sospechosos:

sospechosos 1 tiene el patrón 1,4.

1´2

1 2 3 4 c 1´1 1´3 1´3 todos excepto 1.3

4

Sospechosos 2 tiene el patrón 1,3.4:

1´2

1 2 3 4 c 1´1 1´3 1´3 todos excepto 1.3

4

El sospechoso 2 es por esta prueba más culpable que el sospechoso 1, al menos el pelo encontrado en la víctima pertenece al sospechoso 2.

Otras aplicaciones.

*Aplicación de la PCR a tejidos enteros.

Son aplicaciones más básicas.

Se usan sondas específicas de los tejidos,además los tejidos están ligados y pegados a un soporte determinado.

Para esta técnicas se han desarrollado aparatos específicos

Las sondas están pegadas a los portas, estos portas se impermeabilizan, se les añaden los reactivos de la PCR, se introduce en la maquinaria específica para los ciclos de las PCR y se amplifica ADN de una célula concreta.

Es muy útil para la aplicación de la PCR a estudios de expresión génica. Podemos observar en que momento se está transcribiendo un determinado gen.

Ejemplo: tejido vegetal con células que están expresando genes que no se transcriben en las células vecinas. (zona oscura es zona de expresión, se observa por la tinción resultante).

Cuando se transcribe un determinado gen tenemos mucho ARN-m perteneciente a ese gen, por retrotranscripción lo pasamos a ADNc in situ y realizamos la PCR con oligos específicos correspondientes a ese ADN, de manera que amplificamos las regiones del ADN que se están expresando más.

Además teñimos los productos de la expresión y se pueden observar directamente.

Se han desarrollado enzimas que llevan la actividad retrotranscriptasa y polimerasa de ADN dependiente de ADN a la vez.

Esto también se hace en maquinarias especiales que permiten meter las placas que llevan pegada la enzima.

* Estudios de evolución.

Se saca ADN de momias, insectos en ambar...

La mayoría de los estudios de amplificación de ADN extraído de estos lugares suelen ser falsos por que es difícil de amplificar, está en mal estado y es muy fácil de contaminar.

* Detección y diagnóstico de enfermedades genéticas

Se detectan las mutaciones en embriones (clonación...),

Fecundación in vitro: El embrión en estado temprano (6-10 células) se implanta en la madre. Normalmente se implantan varios óvulos y por eso hay riesgo de que nazcan gemelos (partos múltiples).

El hecho de que podamos manejar óvulos hace posible el que podamos detectar enfermedades sobre todo cuando hay historial en la familia, por ejemplo hemofilia o la distrofia muscular que va ligada al cromosoma X y es recesiva.

I). Enfermedades hereditarias ligadas al sexo:

Sobre todo es situaciones en las que la madre es portadora del gen mutado y hay riesgo de que sus hijos puedan padecer la enfermedad.

Con la PCR se puede controlar que el óvulo que se implanta esté libre de esa enfermedad. Se puede controlar el sexo y conocer si es hombre o mujer.

Extraemos el ADN y hacemos PCR, amplificamos la secuencia específica del cromosoma "Y", si hay amplificación es que el óvulo es XY (hombre)y si no es que el óvulo es XX (mujer). Si es mujer se implanta y no hay enfermedad.

II). Leucemia mieloide crónica o enfermedad del cromosoma Filadelfia. Se presenta en determinadas familias y se debe a una translocación entr dos cromosomas. Una porción del cromosoma 9 se transloca al 22 formando el cromosoma Filadelfia. Se produce la fusión de dos genes abl y cbl. En el cromosoma Filadelfia cuando se transcriben estos genes forman un híbrido de tamaño anormal y determina la aparición de un tumor provocando la leucemia.

Se puede diagnosticar en fetos la aparición de esta enfermedad.

Se retrotranscribe el ARN-m a ADNc, se amplifica con cebadores que contiene un trozo de la secuencia de esa fusión. Si no hay fusión de los genes abl y cbl no se amplifica. Se debe hacer un control con cromosomas de individuos sanos (control negativo).

TEMA 2. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE GENOMAS COMPLETOS (GENÓMICA).

* CONCEPTO:

Genómica :

Es la subdisciplina de la genética que se encarga de la caracterización molecular de los genomas completos.

La genómica se puede dividir en dos clases:

* Genómica estructural: trata de caracterizar la naturaleza física de los genomas; secuencia de nucleótidos.

* Genómica funcional: es la más importante pues se encarga de:

* Transcriptómica: Analizar los patrones globales de expresión génica dentro de una célula.

* Proteómica: Estudiar del conjunto de proteínas de una célula en un momento determinado y bajo unas condiciones determinadas.

* PROYECTO GENOMA.

El Proyecto genoma se basa en la secuenciación de organismos modelos:

Tabla:

Organismo eucarióticos de los que se ha obtenido la secuencia completa de nucleótidos.

Se están secuenciando el genoma de muchos organismos modelos

Estos organismos modelos se utilizan para la investigación genética ya que de su genoma se obtiene mucha información que puede ser útil para conocer el funcionamiento del genoma humano, (mucho más complejo).

También se secuencia el genoma de arqueas y bacterias, pues algunos son organismos modelos bien porque son patógenos ( interés farmacéutico) o bien por que son especies que pertenecen a grupos taxonómicos diferentes y una vez conocidas las secuencias de las especies representativas de cada grupo podemos estudiar como ha ido variando el genoma con el tiempo.

* Aspectos básicos: Conocer la secuencia completa del organismo permite:

• Establecer las reglas que sigue el diseño de los organismo, es decir, conocer que tipo de genes son necesarios para crear una célula o un organismo, y saber que diferencias genéticas hacen que los organismo sean distintos unos de otros.

• Poder realizar estudios evolutivos: ver como ha ido evolucionando la organización génica en los diferentes grupos de organismos.

• Biomedicina: Diseñar estrategias para detectar genes alterados en individuos de la población, genes que son responsables de una enfermedad y diseñar medicamentos concretos (terapia génica). Conlleva problemas éticos pues hay muchas compañías de seguros que se niegan a asegurar a personas que tienen un elevado riesgo de padecer enfermedad y en determinadas empresas a la hora de contratar a un empleado, miran si tienen más predisposición o menos de contraer enfermedades.

• Desarrollar técnicas necesarias para llevar a cabo proyectos de secuenciación como es el desarrollo de herramientas que se utilizan en estudios moleculares muy diferentes.

* DESARROLLO DE TÉCNICAS ESPECÍFICAS PARA LOS DISTINTOS NIVELES DE RESOLUCIÓN.

El proyecto Genoma tiene técnicas avanzadas en niveles de resolución cada vez mayores.

Para poder secuenciar el genoma completo de un organismo tenemos que realizar los siguientes pasos (fotocopias pagina 2):

* Asignación de genes y marcadores a cromosomas específicos:

Hay que conocer los genes que hay en cada cromosoma, esto se realiza con análisis genéticos como por ejemplo los cruzamientos entre individuos, y mapas genéticos más o menos bastos (genes separados como mínimo 1cM (centimorgan)=1000 kb).

Es una técnica clásica y la proporción de genes que podemos analizar es pequeña en comparación con el total.

Por ejemplo:

Conocer si dos genes están en el mismo cromosoma, para ello realizamos un cruzamientos entre individuos que tengan alelos diferentes para un determinado gen (Aa y Bb) y observamos la segregación de los genes. Si la segregación es independiente, se debe a dos genes en distintos cromosomas.

* Mapas cromosómicos de alta resolución:

Mediante marcadores moleculares. Se hacen para genes separados por una corta distancia. También se usan secuencias microsatélites, secuencias de polimorfismo, etc.

* Mapas físicos:

* Vectores de clonación:

El objetivo de los mapas físicos es obtener colecciones ordenadas de clones que contengan entre todos ellos el genoma completo de un organismo.

Cada clon contiene un fragmento diferente del cromosoma del organismo.

Esta colección de clones se secuencia para conocer la secuencia completa del cromosoma.

Lo complicado es ordenar los fragmentos secuenciados de los miles y miles de clones. Para ordenar correctamente los fragmentos es importante tener fragmentos solapantes entre los fragmentos de los distintos clones.

Se identifican los fragmentos contiguos y así podemos ordenar la información de todo el cromosoma.

Las secuencias de los fragmentos solapantes se denominan "secuencias contiguas" o "conting".

Se hacen genotecas de cada cromosoma por separado, para facilitar el proceso.

*Citómetro de flujo (fig 11.7):

La Citometría de flujo se utiliza para aislar los cromosomas.

Cada cromosoma tiene una proporción de pares A-T y C-G característica que permite la identificación de cada cromosoma.

Se tiñen los cromosomas en metafase con colorantes fluorescentes específicos de las regiones AT y colorantes fluorescentes específicos de las regiones ricas en pares C-G. Esto diferencia a cada cromosoma, cada uno tiene un patrón de bandas distinto.

La preparación de los colorantes fluorescentes con los cromosomas se introduce en un spray. La preparación está en una disolución tal, que cada gota contiene un solo cromosoma o ninguno.

Cada gota con un solo cromosoma pasa por un rayo láser y al incidir el haz de luz en el cromosoma, el colorante emite fluorescencia que es detectada por un aparato.

Cuando pasa el cromosoma con la distribución en bandas que nosotros buscamos, se activa un campo eléctrico (placas reflectoras) que lo carga positivamente y el cromosoma cargado va hacia el polo negativo donde se recolectan en un tubo. De esta manera en el tubo obtenemos una preparación purificada del cromosoma que queremos.

De este cromosoma se aísla los fragmentos de ADN y se crea la genoteca específica de este cromosoma.

* Vectores de clonación utilizados en genómica:

Se utilizan vectores de clonación (plásmidos) específicos que permiten clonar grandes secuencias de ADN.

Vector A

Vector-ADN

ADN Fragmento

A A (enzima de restricción)

Estos vectores tienen secuencias necesarias para que una molécula de ADN se mantenga de forma replicativa dentro de la célula. Los más usados son:

* Cromosomas artificiales de levaduras (YACs):

Permiten clonar fragmentos de hasta 1000 kb. Contienen todos los elementos necesarios para que se comporten como un cromosoma de levaduras:

*Secuencias de los centrómeros; para asegurar su segregación.

*Secuencias del origen de replicación en levaduras.

*Secuencias de los telómeros para sellar sus extremos.

Cortamos con enzima de restricción:

telómeros ori lev marcador seleccionable centrómero sitio de clonación telómero

Insertamos ADN que queremos clonar .

En los sitios de policlonación podemos meter secuencias de hasta 1000 kb y convertir las levaduras en levaduras con un cromosoma extra.

El inconveniente es que hay que trabajar con levaduras.

* Cromosomas artificiales de bacterias (BACs).

Contienen las secuencias necesarias para su replicación y segregación en bacterias.

Tienen la ventaja de que trabajamos con bacterias y en inconveniente de que no podemos meter secuencias tan grandes, debemos introducir menor cantidad de ADN (100-300 kb).

* "hibridación in situ mediante fluorescencia" o FISH.

Existen distintos métodos para ordenar las colecciones de clones que tienen diferentes niveles de resolución. El método más fácil de usar es la técnica del

FISH o "hibridación in situ mediante fluorescencia":

* Tenemos ADN clonado en BAC o LACs, podemos aislarlo y marcarlo con una molécula fluorescente.

* Hibridamos el ADN marcado con cromosomas interfásicos desnaturalizados.

* Los cromosomas interfásicos dan fluorescencia en la zona donde han hibridado con el ADN clonado y marcado. Esto nos dice la posición que ocupa ese fragmento de ADN en el cromosoma.

La sonda da señal de hibridación en las dos cromátidas de cada cromosoma homólogo.

Nos da una idea de por donde mapea el YAC en el cromosoma.

Tienen un alto poder de resolución. Ha mejorado mucho esta técnica con el uso de marcadores fluorescente, antes se usaba radioactividad pero daba una señal muy grande que cubre todo el cromosoma.

Fotocopia, (pag 6): Human Genome Integrated BAC/PAC Map: vemos como se ordenan los YACs (flechas) y nos da una aproximación de por donde mapea.

* "Clone fingerprint" o comparación de mapas de restricción.

(fotocopias, pag 7)

Se puede usar técnicas más precisas como establecer los extremos solapantes de los fragmentos de ADN de los distintos clones.

Por ejemplo:

Tenemos dos clones diferentes que creemos que tienen regiones solapantes.

Cada clon se somete a un tratamiento con la misma enzima de restricción.

Corremos la muestra en un gel de electroforesis. si esos dos clones tienen regiones solapantes darán lugar a fragmentos del mismo tamaño en un gel de electroforesis (Southern).

Obtenemos un patrón de restricción.

Los patrones van a ser muy complejos y además analizar a ojo si las calles contienen bandas en común es bastante difícil. Hoy en día se lleva acabo por ordenador y es el ordenador el que trata de encontrar las bandas comunes entre los clones.

Se establece que si dos clones comparten 5 bandas del mismo tamaño, deben tener regiones solapantes.

* STS o sequence-tagged sites (sitios marcados por su secuencia) . ( pag 8)

Si dos clones llevan regiones solapantes, las secuencias son iguales en esa región de solapación.

Si encontramos una forma fácil de analizar la presencia de una secuencia concreta en las colecciones de clones, podemos decir que los clones positivos llevan la secuencia que queremos.

Lo que se hace es:

Aislar una secuencia aleatoria del genoma que represente una secuencia única, una secuencia que esté presente en una posición única de un solo cromosoma ( FISH).

Secuenciamos un trozo pequeño de esa secuencia única y diseñamos cebadores complementarios a esa zona.

Intentamos amplificar con los cebos de la secuencia única dos clones diferentes, si se produce la amplificación en los dos clones, significa que tienen secuencias comunes.

Cogemos un conjunto de clones y usamos diferentes parejas de cebadores.

Comparamos que cebos tienen en común. Algunos cebadores serán comunes a los distintos clones y otros no. Tabla (pág 8):

* Del 1 al 12 son las parejas de cebos que amplifican secuencias diferentes.

* A, B, C, D y E son los clones (YACS).

Analizamos cada clon con la pareja de cebos nº=1, vemos si los cebadores son capaces de amplificar algún gen. Solo se produce amplificación si el clon contiene la secuencia complementaria a la pareja de cebos nº=1. En este caso solo hay amplificación en los clones C y E, por tanto esos clones contienen la secuencia complementaria a esos cebos y es una secuencia común en ambos clones.

Hacemos lo mismo con la pareja de cebos nº= 2 , y vemos que el clon C tiene secuencia en común con el clon A.

De esta manera se pueden ir ordenando los fragmentos de los distintos clones:

El resultado sería: E-C-A-D-B.

El disponer de secuencias ordenadas de genes no solo nos sirve para secuenciar nucleótidos sino que también para estudios a nivel molecular.

(pag 9): Tenemos 6 cromosomas, debajo de cada cromosoma tenemos representados los clones que cubren cada secuencia (rayas), tenemos en total 958 clones ordenados perfectamente.

Hacemos una microplaca donde colocamos ADN de cada clon de forma ordenada y cada microplaca contiene el ADN de todos los clones (desde el clon 1 al 958).

Estas microplacas son útiles para aislar un gen concreto de un organismo, por ejemplo queremos aislar de un gen, su homólogo en levaduras solo tenemos que hibridar la secuencia del gen que queremos clonar con el ADN de la levadura que lo tenemos en la placa. Donde de positivo tenemos al gen.

* Secuenciación genómica.

No es sencillo pues hasta un BAC tienen 500 kb.

Cada clon se debe romper y secuenciar los trozos más pequeños, a esto se le denomina "Shotgun cloning".(fig pag 10)

Las empresas privadas cortan el ADN y lo secuencian directamente con ordenadores, luego ensamblan las secuencias con el ordenador pero puede que en los fragmentos hayan tramos de secuencias repetidas y se puede equivocar. Para evitar tanta equivocación se deben disponer de información sobre los mapas de clones (hechos por la empresa pública).

* ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS.

(Pag 11)

Las secuencias se deben analizar antes de ser publicadas. El análisis consta de:

Identificación de genes: tenemos que saber cuantos y que genes están incluidos en el genomio. Se hace por:

a). Homología con otros genes incluidos en bases de datos, esto solo nos da una porción de la información.

b). ORFs putativos: Se realiza contando las fases de lectura abierta (ATG) que dan lugar a una proteína.

El problema reside en que si la fase de lectura que da lugar a 200 aminoácidos es más que probable que sea un gen pero existen ORFs pequeños que dan lugar a estructuras de menos de 100 aminoácidos y quizás no nos represente a un gen.

Para saber si representa a un gen hay que identificar su ARN-m. Si Identificamos el ARN-m es probable que sea un gen.

Análisis del genomio.

Densidad génica.

Porcentaje G+ C.

Tamaño medio del gen.

Número de intrones/exones.

Secuencias repetidas.

3) Análisis comparativo de distintos genomios.

Número total de genes de distintos organismos:

(pag 12)

No parece que halla una relación lineal entre la complejidad de un organismo y el número de genes, por ejemplo en Drosophila melanogaster hay una mayor complejidad que en los nematodos y el número de genes (densidad genética= nº genes/total ADN) no encaja con esa relación.

En términos globales el número de genes aumenta con la evolución pero la relación al comparar con los distintos organismo no parece lineal.

Número mínimo de genes necesarios para construir distintos tipos de organismos:

( Pag 13)

& Podemos afirmar que con 500 genes podemos formar una bacteria parásita y la mayoría están implicados en la replicación y funcionamiento vital.

& El número mínimo de genes para fabricar una bacteria de vida independiente es de 1500 genes.

& Para una célula eucariota unicelular como puede ser una levadura es de 5000 genes.

& Para la formación de un eucariota multicelular (dropsophila) hacen falta unos 13000 genes.

& 15000 genes para plantas superiores y 40000 para mamíferos.

La densidad génica va disminuyendo conforme subimos en la escala evolutiva.

El 90% del genoma de las bacterias son genes, es un genoma muy compacto.

También son muy compactos los genomas de las levaduras, la mayoría son genes que determinan proteínas.

Mapa del cromosoma 3 de levaduras (pag 14).

En el mapa aparece representado:

þ Los distintos clones de YAC que se usaron para la clonación de ese organismo.

þ Los genes que ya se conocían antes del proyecto de secuenciación.

þ Los ORFs que se identificaron. Los ORFs de gran tamaño representa probablemente genes de la levadura, los ORFs pequeños que darían lugar a proteínas de menos de 100 aminoácidos no podemos asegurar que sea un gen.

Organización génica en levaduras: S.cerevisiae y S.pombe.

En S. cerevisiae se han identificado 1400 pb y en S. pombe se han identificado 1426 pb.

La principal diferencia entre los genomas de ambos organismos es la estructura del gen:

* S.cerevisiae tiene un bajo porcentaje de intrones, solo el 5% de los genes de esto organismo tienen 1 intrón.

* S.pombe Tiene un alto porcentaje de intrones. El 43% de los genes tienen intrones, además como media tienen 2 intrones por gen.

En las dos levaduras, los genomas son muy pequeños con secuencias intergénicas muy pequeñas. (200pb-500pb)

Comparación del genoma de eucariotas superiores:

(Pag 16)

Cuando analizamos el genoma de eucariotas superiores vemos que los genes se encuentran más dispersos por el genoma. Hay gran cantidad de secuencias intergénicas.

El genomio de Caenorhabditis elegans tiene un gen cada 5 kb.

El genomio de Drosophila melanogaster tiene un gen cada 9 kb.

Factores explican la falta de una relación lineal entre el número de genes y la complejidad del organismo:

Tres causas que ayudan a disminuir el número de genes que hacen falta para fabricar un organismo.

Procesamiento diferencial del ARN-m

En Drosophila se da un alto procesamiento diferencial de los ARN-m.

De un mismo gen por procesamiento diferencial podemos obtener diferentes ARN-m. El procesamiento se produce en drosophila pero no en C. elegans. Drosophila da por tanto un mayor número de proteínas con menos genes.

2) Secuencias repetidas: familias de genes.

En los diferentes organismo hay diferente número de genes repetidos.

En eucariotas hay genes de los cuales no hay una sola copia, sino varias que dan lugar a proteínas similares que se consideran de la misma familia, por ejemplo las kinasas que cumplen la misma función en diferentes tejidos. Esos genes repetidos no aumentan la capacidad de hacer cosas diferentes por ese organismo. por tanto lo importante no es el número total de genes si no el número de familias de genes diferentes.

En C. elegans el número de genes duplicados (8971 genes) es mucho mayor que en drosophila (5536 genes), pero si comparamos el número de familias de genes diferentes, las diferencias no son tan grandes. C. Elegans tiene 9453 familias de genes diferentes y drosophila tienen 8065 genes.

Esto nos puede ayudar a disminuir las diferencias entre organismos simples con alto número de genes y organismos complejos con bajo número de genes.

Complejidad de las proteínas: Dominios funcionales.

Lo importante no es el número de genes o el número de proteínas diferentes, si no la complejidad de esas proteínas. Se puede observar la complejidad de las proteínas mirando los dominios funcionales que tienen.

Si consideramos que tenemos la secuencia de aminoácidos de una proteína, podemos encontrar las regiones de esa proteína que pueden llevar a cabo una determinada actividad, por ejemplo regiones con capacidad de unir ATP, secuencias de aminoácidos con actividad quinasa, dominios de dimerización.

Analizamos las diferentes proteínas que se pueden obtener de diferentes organismos y observamos que a medida que avanza en complejidad por la escala evolutiva, aumenta la complejidad de las proteínas, es decir aparece un mayor número de dominios por proteínas:

Drosophila>gusano>levaduras.

(Pag 17)

En bacterias prácticamente todos los genes son únicos; el 89% de los genes son únicos.

En plantas (A. thaliana) aparecen un alto porcentaje de genes que pertenecen a familias diferentes y un bajo porcentaje de genes únicos (35%).

Debemos comparar el número de familias de genes diferentes= nº de familias + nº de genes únicos.

Representación de la estructura del genoma humano:

Grandes Duplicaciónes 5% transposones 45%

Repeticiones simples 3% exones 1%

regiones intergénicas intrones 24%

(entre genes)

(Pag 18) Solamente el 1% de nuestro genoma corresponden a exones (son las secuencias que fabrican las proteínas).

El genoma humano tiene gran cantidad de secuencias repetidas, ocupan un 55% del genoma. El 45% son transposones.

Los transposones son secuencias que se mueven por el genoma, saltan de un lado a otro y dejan una copia donde estaban y otra donde saltan. Solamente un 1% son activos, los otros no se mueven pero su distribución nos hace ver lo importante que fueron en la evolución.

El papel de los transposones no se conoce todavía, no se sabe por que se mantienen en el genoma, una teoría es que sirven para facilitar los entrecruzamientos.

Representación de un gen humano:

Como media un gen humano tiene 9 exones

El tamaño medio de un gen humano es de 25-30 kb de ADN, de los cuales 1300 pb son intrones. (es una alta cantidad de ADN que se elimina en la transcripción).

Exón = Intrón=

Solapamiento entre los genes humanos identificados en dos análisis independientes.

(pag 19).

Se han identificado secuencias a través de la empresa privada y pública, solo coincide en un 15,852%, el resto es diferente, se debe a que han considerado unas secuencias como exones y en otro caso se han considerado como genes diferentes.

Genes comunes en diferentes especies. (pag 23)

Tenemos secuencias de origen bacteriano en nuestro genoma, estas secuencias no aparecen a lo largo de la escala evolutiva. Aparecen directamente en vertebrados. Parece que es debido a una transferencia horizontal, nuestro ancestro adquirió el genoma bacteriano y todos sus descendientes contienen esos genes.

Si comparamos los genes humanos con otros organismos:

El 21% de nuestros genes están presentes en todos ellos, estos genes están implicados en las funciones comunes de una célula; plegamiento de proteínas, replicación,...

El 32% están presentes en todos los eucariotas, pero no en bacterias, son los necesarios para el desarrollo de estructuras de la célula eucariota; desarrollo de orgánulos, citoesqueleto.

El 24% son Genes presentes en todos los organismos multicelulares, implicados en el desarrollo de los tejidos.

El 22% están presentes en todas los vertebrados; implicados en el sistema inmune y nervioso.

TEMA 3 GENÓMICA FUNCIONAL:

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CONJUNTO DE ARN-m (TRANSCRIPTÓMICA) Y PROTEÍNAS (PROTEÓMICA) PRODUCIDOS POR UNA CÉLULA, TEJIDO Y ORGANISMO.

* INTRODUCCIÓN:

EL conocimiento y análisis de la secuencia íntegra de nucleótidos del genoma completo de un número creciente de especies (genómica estructural) plantea el reto de comprender la función de todos y cada uno de los correspondientes productos génicos ( genómica funcinal).

* Niveles de análisis (pág 1):

* A nivel de Genoma:

El genoma es la serie completa de genes de un organismo o sus orgánulos.

A este nivel podemos reconocer el repertorio completo de genes que son capaces de desarrollar un organismo completo, pero tenemos que reconocer que papel juegan esos genes en el desarrollo.

El método usado para el estudio del genoma es el de la secuenciación del ADN.

Uno de los sistemas es el de identificar los ORFs pero no es fácil pues los ORF en eucariotas contienen exones e intrones, y da lugar a confusiones.

* A nivel de transcriptoma:

El Transcriptoma es la serie completa de moléculas de ARN-m de una célula, tejido u órgano.

Transcriptómica: Es un parte de la genómica estructural que ayuda a obtener información sobre que genes se expresan, que proteínas forman, su estructura, etc.

En el análisis del genoma no obtenemos toda la información sobre el papel de cada gen.

Tenemos que saber cuando, donde y con que intensidad se expresan, es decir, conocer el juego de transcripción de cada gen, esto es lo que se conoce como transcriptómica, es el análisis del transcriptón, conocer el conjunto de secuencias de ARN-m que aparece en cada individuo y en cada situación ambiental.

El transcriptoma es dependiente del contexto: cambios patológicos, cambios físiológicos, cambios de desarrollo.

* A nivel del proteoma:

El Proteoma es la serie completa de proteínas de una célula, tejido u órgano.

Las moléculas capaces de reaccionar frente a estímulos, capaces de regular la expresión de los genes y responsables de la síntesis de diferentes moléculas son las proteínas.

Debemos conocer que proteínas aparecen en una célula, en un organismo, en cada estado del desarrollo, en diferentes condiciones, etc por que el gen no nos dice a que tipo de proteína da lugar, contiene intrones y se da el procesamiento diferencial.

Esto sería el análisis del proteoma que también es dependiente de contexto; depende del tejido, momento y situación.

* A nivel del metaboloma.

EL Metaboloma es la serie completa de metabolitos de una célula, tejido u órgano.

También se estudia la célula u organismo a nivel del metaboloma, es decir cualquier tipo de metabolito (ATP, GTP, lípidos...) que aparece en un momento concreto.

*Métodos de análisis:

* Genoma:

* Secuenciación de ADN..

* Transcriptoma:

* Hibridación o chips de ADN.

* SAGE

* Northern sistemático

* Proteoma:

* Electroforesis bidimensional (procedimiento bioquímico)

* Huella de Pm.

* Sistema de 2 híbridos (averigua que proteínas interaccionan en momentos determinados para hacer una determinada acción).

* Metaboloma:

* Infrarrojos.

* Espectrometría de masas.

* NMR

* OBTENCIÓN DE SONDAS PARA ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GLOBAL DE GENES.

(pág 2) Representación del genoma con 3 genes separados por regiones intergénica.

El detectar por este sistema que un gen se transcribe se basa en la capacidad de hibridación de dos moléculas de ADN1c complementarias.

Creamos de cada gen una sonda o cebo que hibride con el ARN que se expresa de ese gen.

La sonda la marcamos para poder detectarla con fluorescencia.

Tenemos dos formas para fabricar estos cebos:

PCR.(pag 8)

Cogemos todo el genoma de una célula y de cada gen diseñamos dos oligos (flechas) cuya secuencia es específica de ese gen.

EN cada tubo amplificamos específicamente una región y obtenemos una secuencia de ADN que representa a esa región (gen).

El ADN que produce PCR es de doble cadena, lo desnaturalizamos para poder detectar el ARN-m

Cada pareja de oligos específica para un determinado gen la tenemos en un tubo, de manera que en cada tubo tenemos amplificado una secuencia específica de un gen, ordenamos los tubos según la ordenación de los genes en el ADN.

Usamos un sistema robotizado que coloca en una placa una gota de cada tubo.

La placa es de vidrio tratado especialmente de manera que el ADN se fija a la placa. De esta manera fabricamos una matriz de una serie de gotas ordenadas de ADN.

Al final en el microchips tenemos una colección de oligos representativa de todo el genoma.

Marcamos ARN-m problema y lo hibridamos con el CHIP y donde observemos fluorescencia hay hibridación.

.

oligonucleótidos sintéticos. (pag 6)

Trata de sintetizar en el propio chips una molécula pequeña de una sola cadena con la secuencia que queremos. (síntesis in situ del oligonucleótido)

Con PCR obtenemos una representación de un gen, es un tramo lo suficiente mente largo de secuencia como para ser específico del gen del que procede.

Con el sistema de los oligonucleótidos sintéticos, sintetizamos oligos de unas 25 bases por tanto es menos específico.

De los diferentes exones de un gen, de los que conocemos la secuencia, cogemos de 20-24 aminoácidos y le decimos al ordenador que haga cebos con esa secuencia, de manera que esos cebos deben hibridar con la secuencia de la que procede.

Se utilizan aparatos de rayos láser cuya luz se dispersa poco.

* 1º chips con grupos bloqueados.

Tenemos un sustrato (porta de vidrio especial) que hemos tratado con un compuesto que puede unirse a nucleótidos por una reacción química. Este compuesto persé no se une a nucleótidos, porque contiene un grupo químico que bloquea la unión (grupo bloqueador).

* 2º colocamos pantalla con determinados cuadrados abiertos

Encima del porta se colocan pantallas o máscaras con minicuadrados que pueden estar abiertos o cerrados.

* 3º láser y desbloqueo

Proyectamos láser sobre la pantalla que deja pasar a los rayos por los cuadrados abiertos. El láser libera al grupo químico bloqueador expuestos bajo cuadrados abiertos.

* 4º añadimos NTP.

Añadimos por nucleótido que queremos y se une a los grupos sin bloqueador (cuadrado abierto).

* 5º ponemos 2º pantalla con diferente apertura de cuadrados.

Según vayamos abriendo o cerrando los cuadrados, vamos añadiendo los nucleótidos que queremos poner.

En cada cuadrado hay miles de moléculas con la misma secuencia.

Marcamos ARN-m y lo hibridamos con el CHIP y donde observemos fluorescencia hay hibridación.

* VENTAJAS DE LOS CHIPS.

Fabricados por Microgotas PCR: obtenemos 900.000 muestras diferentes en un porta.

Fabricados por Síntesis de oligonucleótidos: 6000 genes en un cuadrado.

* APLICACIONES DE LOS CHIPS.

Podemos conocer:

a) Genes que se expresan en una determinada célula de un tejido.

Intensidad de expresión de un determinado gen:

Cuando la señal de fluorescencia da un determinado rango de intensidad, el ordenador, le concede un color determinado y por los diferentes colores podemos conocer la intensidad con que se expresan los distintos genes de una célula.

Diferencias en la expresión de genes de células distintas (silvestre y mutante):

Se pueden usar diferentes fluorocromos para distinguir entre los genes que se expresan en una situación determinada en una célula normal y los genes que se expresen en la misma situación en la célula mutante:

* Extraemos ARN normal y marcamos con fluorocromo verde.

* Extraemos ARN mutante y marcamos con fluorocromo rojo.

Ponemos los ARN de ambas células en diferentes chips y le decimos al ordenador que superponga los resultados. si en la representación sale color amarillo es que el ARN se transcribe en las dos células.

Algunos no se superponen por que dejan de expresarse en la célula mutante ( en verde, solo se expresan en la célula normal) o por que antes no se expresaban y lo hacen ahora en la célula mutante (aparecen de rojo)

Por tanto es posible que en un espacio reducido (chips ADN) podamos obtener sondas de ADN que permiten detectar que molécula de ARN-m están en una célula en un momento determinado bajo unas condiciones determinadas.

Expresión de un mismo gen en dos situaciones diferentes.

Se extrae todo el ARN de una célula en una situación control y todo el ARN de la célula en una situación experimental y comparamos las diferencias. Cada molécula de ARN va a estar poco representada y no se va a detectar, no está marcada, para solvantar esto hacemos lo siguiente:

1) Usamos a la transcriptasa inversa para pasar al ARN a ADN2c.

Amplificamos por PCR. En la PCR añadimos NTP marcados. usamos 2 fluorocromos diferentes:

* Un fluorocromo para ADN2c de control

* Otro fluorocromo para ADN2c del experimento.

Desnaturalizamos los ADN2c por que solo una de las cadenas hibrida con la sonda del CHIP.

Hibridamos con CHIP y observamos la fluorescencia.

* Excitamos al CHIP con longitud de onda determinada para detectar la fluorescencia verde.

* Excitamos al CHIP con la longitud de onda necesaria para detectar la fluorescencia roja.

Por procedimientos informáticos mezclamos ambas señales y superponemos los resultados.

Esta técnica se usa para hacer análisis de transcriptómica.

La mayoría de trabajos realizados con esta técnica se refieren a S.cerevisiae por que fue el primer organismo eucariota secuenciado por completo (ADN de pequeño tamaño).

Por ejemplo: Aislamos ADN de una célula que se han irradiado (situación experimental), esta radiación produce un daño al ADN que provoca la síntesis de proteínas de reparación. Y en el control aislamos ADN de células no irradiadas.

* Con el Fluorocromo Rojo se marcan los ARN de las células irradiadas: si en el chip aparece fluorescencia roja es que el gen se expresa cuando se irradia pero no cuando no es irradiada.

* Con el fluorocromo Verde se marca ARN de la célula no irradiada: si en el chip aparece fluorescencia verde es que el ARN se expresa cuando la célula está en condiciones normales.

Obtenemos un Panel donde se observa la expresión de 800 genes a la vez ordenados. Los resultados están digitalizadas, podemos jugar con el ordenador y hacer la ordenación con un programa informático.

Estudios del ciclo celular:

Uno de los fenómenos por los que la levadura ha sido muy usada ha sido para estudios del ciclo celular. Ciclo celular: M/G1<G1<S<G2<M.

Los Genes que participan en la regulación del ciclo celular deben estar muy conservados en la naturaleza, por eso si los identificamos en levaduras podemos usarlos para encontrar los genes humanos que regulan el ciclo celular y por tanto pueden ser utilizados para los estudios sobre el cáncer.

La identificación de los genes del ciclo celular se hizo paso a paso buscando mutantes en el ciclo celular, que por tanto son mortales. Buscamos mutantes termosensibles.

Así se averiguó que la expresión de esos genes varían a lo largo del ciclo celular. Muchos de los genes que intervienen en el ciclo celular tienen una transcripción cíclica.

Por tanto con este sistema podemos que genes tienen expresión cíclica. Además la expresión de estos genes no es al azar a lo largo del ciclo, si no que tienen una expresión coordinada.

En la levadura es fácil obtener una división sincronizada por procesos que permiten parar a la célula en un punto de la división. Todas las células del cultivo se acumulan en ese punto. Cuando se vuelve a activar la división lo hacen a la vez. Así obtenemos todas las células en la misma fase del ciclo.

Existen 4 formas diferentes de sincronizar el cultivo celular:

* factor .

CDC 15

CDC 18

Elu.

El control en este experimento es el ARN obtenido de un cultivo asincrónico.

Conclusión : de 6000 genes ; 800 son cíclicos.

Estudios sobre el cáncer:

Otro trabajo realizado con genes humanos fue el de identificar genes que se expresan con particular intensidad en el cáncer o también que genes se inhiben en el cáncer.

(Pag 10) Analizamos todos lo genes de 60 tipos de cáncer diferentes (60 líneas celulares continuas). Existen trabajos más finos que observan variaciones entre los diferentes tipos de cáncer.

El control del experimento es el ARN de células del mismo tipo pero sin ser cancerígenas.

Obtenemos un panel con 1161 genes.

El ordenador agrupa las líneas celulares con patrones similares:

A la Izquierda del panel tenemos los patrones celulares del cáncer del sistema nervioso central.

A la derecha del panel (cerca de C) tenemos el patrón del cáncer de leucemia.

Cada cáncer tiene un patrón característico, esto permite hacer un árbol de relación entre los diferentes tipos de cáncer. Dentro de un mismo tipo de cáncer también hay variaciones.

Permite averiguar que genes debemos estudiar para mantener o detener el crecimiento del cáncer y ver que relación tiene la expresión de esos genes con la formación del cáncer.

Es una demostración molecular de la alta variabilidad de cáncer por eso es muy difícil encontrar una solución común a todos.

Detectar que cambios genéticos provocan enfermedades hereditarias:

Analizamos el ADN de los individuos que padecen la misma enfermedad.

Se observa si es la misma mutación la que provoca la enfermedad en todos los casos.

Son casos en los que una mutación original se ha extendido entre la población.

Podemos diseñar chip con secuencias de nucleótidos que se unan a ADN de los individuos mutados pero no al ADN de individuos silvestres lo que nos permite hacer un diagnóstico precoz de si un individuo tienen esa enfermedad o de si tienen la probabilidad de padecerla.

comparación de los patrones de expresión de diferentes especies:

Nosotros tenemos 98% de genes comunes con los chimpancés lo que nos diferenciamos de ellos es en el patrón de expresión de esos genes. Por ejemplo las diferencias en el Patrón de expresión del tejido nervioso es brutal, la riqueza de genes que se expresan en nosotros es mucho mayor que en los chimpancés.

ELEMENTOS REGULADORES DE ACCIÓN CIS.

(Pag 14)Tenemos representados tres exones gobernados por un promotor.

En eucariotas la expresión de un gen y su regulación depende de muchas secuencias de ADN que actúan en CIS.

Estas secuencias actúan como tales secuencias de ADN ya que son reconocidas por algunas proteínas que regulan la expresión de los genes de ese ADN.

Son Secuencias que ejercen su efecto sobre secuencias localizadas más atrás en la misma molécula de ADN.

En bacterias es más sencillo. En eucariotas se han necesitado trabajar durante muchos años para identificar los elementos de actuación en cis.

Estos elementos son de diferente tipo:

Promotor:

Es una secuencia importante de acción en cis. Es el sitio de unión de la polimerasa de ARN pero en eucariotas la frecuencia de unión de las polimerasas depende también de otros elementos de acción en cis.

Secuencias intensificadoras (enhancer):

Actúan lejos del promotor y del gen, pueden estar por debajo o por arriba. Eleva el nivel de transcripción independientemente de la posición, orientación o distancia.

Silenciadores:

Hacen lo contrario, su presencia hace que silencie la expresión del gen. Reduce el nivel de transcripción, independientemente de posición, orientación o distancia.

LCR (regiones de control de locus):

Control temporal de especificidad de tejido. Independiente de posición pero dependiente del número de copias. Abre la estructura nucleosómica para dar entrada a otros factores. Por ejemplo los genes de la globina tienen regiones LCR lejos del gen que son responsables de que en el desarrollo se expresen o no determinados genes y cambien las globinas de la sangre.

Secuencia A:

Aparecen a ambos lados del gen y se denomina aisladores, ya que aíslan al gen de los elementos de acción en cis que corresponden a otros elementos. Hacen que los elementos cis de dentro de su secuencia actúen solo en sus genes y no en los de fuera.

Secuencia SAR (región de unión al esqueleto nuclear):

Podría generar "super-estructuras" de los cromosomas y afectar a su expresión dividiéndolos en dominios reguladores. Es una secuencia cis, su acción tienen que ver con el ADN muy desenrollado. El ADN tiene una determinada organización y entre los elementos organizadores están las secuencias SAR.

COMPARACIÓN DE REGIONES ORTÓLOGAS.

Es muy complicado estudiar todos estos elementos, el estudio se hace a escala global con comparación de regiones ortólogas de especies relativamente cercanas, como hombre y ratón :

El ratón es un mamífero y muchos de sus genes los expresan en el mismo lugar, momento y situación que en el resto de mamíferos.

En el genoma de los mamíferos hay mucho ADN basura y en el caso del ratón esas secuencias basuras han tenido tiempo de cambiar durante la evolución y que sean diferentes a las nuestras. Estamos lo suficientemente alejados en la escala evolutiva como para que sean diferentes.

El chimpancé tiene su secuencia prácticamente similar a la nuestra, no es lo suficientemente diferente como para llevar a cabo una comparación con nuestros genomas.

Tanto el ratón como nosotros tenemos sitios en el genoma que contienen genes que codifican apolipoproteínas (cuadraditos son los exones) (pag 15).

El tanto por ciento de parecido entre las secuencias de apopoliproteínas de hombre y ratón aumenta considerablemente en las regiones de los exones.

El tramo de secuencias cis para la regulación de esos genes es un intensificador que está aguas debajo de gen (región de control hepático).

Al comparar el resto de la secuencia, el parecido es mucho menor pero hay dos regiones intergénicas (X e Y) donde nos volvemos a parecer mucho, no determinan proteínas, nos lleva a suponer que son regiones Cis con lo cual podemos decir que son sospechosas de ser secuencias reguladoras.

Ahora debemos hacer experimento de mutagénesis para ver su función en la expresión.

En algunos casos un determinado gen tiene un operón gobernando al promotor. Este operón tiene a su vez un regulador que lo activa o inhibe.

Cada vez aparecen más proteínas que regulan la expresión de muchos genes, genes que no paracen tener relación.

Se hacen combinaciones de los reguladores de un alto número de genes diferentes, para conocer su relación.

Hay posibilidad de identificar todas las regiónes de acción cis que son reguladas por una misma proteína o factor transcripcional.

Por ejemplo, Experimento realizado con levaduras: (pag 16).

Extraemos ADN de la levadura con cuidado para aislar la cromatina (ADN y proteínas) con la esperanza de que proteínas queden unidas a las zonas cis.

Rompemos el ADN de la levadura, sin destruir su estructura.

Precipitamos el ADN de la levadura con anticuerpos contra un factor de transcripción determinado, lo centrifugamos y tiramos el sobrenadante. De manera que la solución se enriquece en tramos reconocidos por ese factor de transcripción.

El control no lo rompemos ni lo inmunoprecipitamos.

Desproteínizamos y nos quedamos con los fragmentos, los amplificamos con PCR y marcamos con fluorocromo.

hibridamos con una matriz ordenada de "genes" (CHIP con todo el ADN del organismo) hibridamos el control y el ADN roto.

El CHIP está formado con el tramo de ADN intergénico, es decir, que no codifica proteínas, es donde se unen los factores de transcripción.

PROTEÓMICA

(pag 17)

La investigación actual trata de conocer los genes que codifican las proteínas y su localización, tenemos que llegar en un futuro a conocer donde, como, y cuando se expresan, es decir conocer las zonas intergénicas que regulan la expresión de esos genes; secuencias que codifican elementos intergénicos, silenciadores, reguladores, aisladores y conocer los genes que expresan estos factores. solo el gen de Gal 4 tiene 6361 regiones intergénicas.

Las proteínas trabajan en conjunto para cumplir sus funciones, están jugando en una red de interacciones que debemos conocer.

Por ejemplo los genes que regulan el ciclo sexual de la levadura. Cuando se hibrídan CHIPS de ADN de levadura con la secuencia de ADN que codifica el factor transcripcional que regula el ciclo sexual de la levadura, se observa que muchos genes están regulados por este mismo factor transcripcional.

Estudios de dos híbridos de levaduras (pag 11):

Se basa en el conocimiento de un activador transcripcional llamado Gal4.

Gal 4 está formado por dos dominios que tienen acción independiente:

Dominio BD: es un dominio de unión a una secuencia específica del ADN, se une a la secuencia promotora.

Dominio AD: es un dominio activador de la transcripción. Atrae a la maquinaria de inicio de la transcripción.

La unión de Gal 4 a su promotor, activa la transcripción del gen que lleva aguas abajo.

• Fabricamos una secuencia que contiene un promotor de GAL 4 y un gen Chivato (lacZ).

El gen chivato es un gen fácil de detectar o un gen que suprime una mutación de la levadura.

Metemos en la levadura dos plásmidos:

1º plásmido: contiene el dominio de unión a ADN de Gal 4 (BD) unido a la secuencia que codifica a una proteína "cebo". (Proteína quimérica)

2º plásmido: contiene el dominio activador de Gal 4 unido a la secuencia que codifica a una "proteína diana".(proteína quimérica).

Como los plásmidos llevan las secuencias necesarias para la expresión de estas secuencias en la levadura, dan lugar a sus respectivos productos dentro de la célula y:

Si no interacciona la proteína cebo con la diana:

1º plásmido produce la proteína cebo que se une al promotor.

2º plásmido produce la proteína que puede activar la transcripción pero no lo hace por faltarle el dominio de unión.

Si interaccionan la proteína cebo con diana: los dos dominios se unen y se activa el gen chivato.

Han cogido los 6000 tramos de ADN que codifican proteínas y los han unido con los dominios de unión GAL4 y los han introducido en plásmidos.

Han cogido los 6000 tramos de ADN y los han unido al dominio activador de GAL 4 y los han introducido en plásmidos.

Por combinaciones de los distintos plásmidos han podido comprobar que proteínas con dominio de unión se unen a que proteínas con dominio activador.

• Se utilizan CHIPs de colonias de levaduras en vez de fragmentos de ADN.

Tenemos colonias con plásmido que contiene secuencia de dominio de unión.

Tenemos colonias con plásmido que contiene secuencia de dominio activador.

Metemos los plásmidos en las levaduras, serán diploides para esos genes, solo crecen las levaduras de la colonia inicial (plásmido 1) cuyas proteínas interaccionan con las proteínas de las levaduras de la colonia del sexo contrario (plasmido 2).

• Muchos genes de las levaduras también los tenemos nosotros.

Muchas proteínas de las levaduras tienen homólogos en la especie humana, muchos de los cuales no sabemos que hacen en la especie humana, y podemos sospechar que se van a producir las mismas interacciones aunque sean especies diferentes.

TEMA 4. MANIPULACIÓN GENÉTICA DE MICROORGANISMOS, CÉLULAS VEGETALES Y ANIMALES EN LA PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS DE INTERÉS COMERCIAL.

INTRODUCCIÓN.

La biotecnología puede ser definida como la aplicación de los principios científicos y técnicos para la obtención de productos y servicios usando agentes biológicos.

Hace milenios que el hombre produce sustancias usando microorganismos.

No fue hasta los trabajos de Pasteur que se tomó conciencia de que los microorganismos eran los que producían esas sustancias.

A partir de ese descubrimiento empiezan a usarse los microorganismos para la biotecnología.

Desde Pasteur hasta 1973 lo que hizo la industria fue producir sustancias siguiendo un esquema básico (pag 1):

La Materia prima se somete a unos tratamientos previos.

La materia prima tratada se pone en contacto con los organismos que van a llegar a cabo la biotransformación a una sustancia de interés.

La sustancia de interés se purifica del medio de cultivo para obtener el producto.

Desde Pasteur hasta 1973 se estableció y mejoró del proceso de transformación logrando un trabajo rentable para la industria.

En esa etapa las investigaciones relacionadas con la biotecnología se habían centrado en el aislamiento de organismos, generalmente microorganismos, que llevaban a cabo algún proceso o producían alguna sustancia de interés, como hongos y bacterias para la producción de anticuerpos.

Obtención de organismos productores de sustancias de interés.

Procedimiento clásico:

Primero se lleva a cabo la identificación del organismo productor.

Los organismos, normalmente cuando se aíslan del medio en el que viven son muy ineficaces y producen bajas cantidades de proteínas o de la sustancia en cuestión, como para producirla a nivel industrial.

Por ello una vez identificados se someten a procesos de mutagénesis para buscar organismos altamente productores y que se acomoden a las condiciones industriales.

En este procedimiento la mutagénesis es un proceso aleatorio, al azar, se trata al organismo con agentes mutagénicos, hacemos una primera selección, para volver a producir mutagénesis y conseguir que sean más eficaces.

Biotecnología molecular.

En 1973 sucedió un proceso revolucionario: la generación de la primera molécula de ADN recombinante.

El ADN recombinante está formado por ADN de dos especies diferentes.

1º Identificación del organismo o de la célula que produce la sustancia de interés ya sean células de tejidos humanos, de plantas, no solo microorganismos ( se abre el campo de investigación).

2º Identificación por la técnica del ADN recombinante de los genes implicados en la síntesis de esa sustancia.

3º Clonación de esos genes en un vector de expresión.

4º Una vez en el vector puede llevarse a cabo una modificación dirigida de los genes.

5º Introducir en células, en animales o en plantas que se denominan "factorías".

6º Modificación de las células factoría

Hoy en día se hacen los dos procedimientos en paralelo.

INDUSTRIA BIOTECNOLÓGICA (pag 2).

En EEUU. Datos de 1993-2001: observamos que según las estadísticas:

Las Ventas de productos biotecnológicos: pasa de 5,9 en el año 1992 a un 18,1 en el 2000.

El número de empleados ha aumentado considerablemente.

Cantidad de dinero ("expense") que invierten a pasado de un 4,9 a 13,8 billones.

Patentes: (gráfica pág 2)

En los últimos 10 años ha habido un incremento importante en el número de patentes relacionadas con la biotecnología, no solo son frutos relacionados con la industria si no también con universidades y en investigaciones en centros sin ánimo de lucro.

Medicamentos biotecnológicos aprobados para su comercialización: (Pag 3)

En los últimos 10 años se ha producido un incremento considerable de medicamentos aprobados obtenidos por técnicas biotecnológicas.

• Hay más de 250 millones de personas beneficiadas de más de 130 productos biotecnológicos comercializados.

• Más de 350 productos biotecnológicos para más de 200 enfermedades se encuentran en la fase de análisis clínico.

Fases para la comercialización de medicamentos biotecnológicos:

La industria debe invertir 16 años para sacar al mercado un producto biotecnológico.

1º Descubrimiento e identificación de los genes (2-10 años años).

2º Análisis preclínico: La proteína aislada debe tener alguna aplicación de interés. Esta etapa se realiza en animales de laboratorio.

3º Análisis clínico:

Fase I: se realiza en pacientes sanos: 20 - 30 voluntarios sanos para comprobar la seguridad y la dosis.

Fase II: de 100-300 pacientes para comprobar eficacia y efectos secundarios.

Fase III: 1000-5000 pacientes para comprobar los efectos a largo plazo.

4º revisión y aprobación por la FDA.

5º control post-comercialización.

PRINCIPALES PRODUCTOS OBTENIDOS POR MANIPULACIÓN GENÉTICA DE LOS ORGANISMOS (Pag 4)

• Medicina:

1. Productos naturales presentes en organismos diferentes al hombre.

2. Productos naturales producidos por el propio hombre:

Agentes terapeuticos.

Terapia de reemplazamiento.

3. producción de vacunas:

Las vacunas están formadas por el propio agente que provoca la enfermedad, eso supone que en algunos casos se puede estar contaminando con el agente infeccioso. Por bioreactores se puede obtener vacunas, en este caso se suministra la molécula antigénica y no se le inyecta todo el organismo productor de le enfermedad.

• Agricultura y ganadería:

1, hormonas de crecimiento

2. interleucina 2: para combatir enfermedades.

3. interferón para combatir enfermedades.

• Aditivos y enzimas para la industria alimenticia: como colorantes de origen natural.

• Productos para otras industrias: como proteasas para los detergentes.

ORGANISMOS PRODUCTORES DE SUSTANCIAS.

• El propio organismo productor: por ejemplo hongos que producen antibióticos.

• Expresión heteróloga: organismos diferentes a los que producen la sustancia. Los Genes de un organismo determinado se introducen en otro organismo para obtener sustancia de interés.

a) Procariotas.

b) Células eucariotas:

Hongos

Células animales.

Células vegetales.

c) Animales y plantas concretas.

EXPRESIÓN HETERÓLOGA.

Se necesita un vector de expresión.

Un vector de expresión es un elemento genético que contiene todos los elementos necesarios para la expresión de un gen en un organismo determinado.

Ejemplo: Un plásmido contiene (pag 5):

Promotor.

Inicio de transcripción.

Zona de clonación (polilinker).

Señal de terminación de la transcripción.

El vector recombinante (plásmido con el gen que queremos expresar) se introduce en la célula factoría y obtenemos la proteína purificada.

Microorganismos manipulados genéticamente para llevar a cabo procesos biotecnológicos (pag 11).

Todos son procariotas excepto Acremonium chrysogenum, Saccharomyces cerevisiae y Trichoderma reesei. El más usado es E.coli.

No todos las proteínas se pueden expresar en E.Coli.

Dianas de manipulación para incrementar la expresión génica.

El objetivo es obtener la mayor cantidad posible de una determinada proteína para eso utilizamos un vector de expresión manipulado para conseguir una alta expresión. Las dianas de manipulación para incrementar la expresión de un vector son:

• Las secuencias relevantes del promotor y terminador de la transcripción.

• La eficacia de la traducción del ARNm viene determinada por la secuencia de unión al ribosoma y de su traducibilidad.

• El Número de copias del gen clonado.

• El mantenimiento del gen; en plásmidos o integrado en el genoma.

• La localización celular de las proteínas sintetizadas.

• La estabilidad de la proteína en la célula hospedadora.

SECUENCIAS PROMOTORAS:

Tenemos que conseguir un promotor con una alta afinidad por la polimerasa de ARN.

Un promotor constitutivo y fuerte es tóxico para la célula. no es viable. Hace que la célula pierda el plásmido pues la célula sin el plásmido crece mejor.

Los promotores que se usan son promotores inducibles. Los cultivos se crecen en condiciones de no inducción, una vez alcanzada un biomasa suficiente se produce la activación del promotor que produce la proteína de interés.

Toda la energía de la célula la dedica a la síntesis de esa proteína por tanto es una situación letal.

Uno de los promotores más usados es el promotor lac.(pág 6)

Genes estructurales (lac)

polimerasa

Lac I P O Z Y A

ADN

ARN-m ARN-m

proteína lactosa

represora

Los productos relacionados con la salud humana no se pueden purificar del propio organismo que las produce. Se requiere de la expresión heteróloga, es decir expresar proteínas de un organismo en organismos factorías que la produzcan en gran cantidad.

Los mejores candidatos para expresar un determinado gen son los procariotas y si no funciona en procariotas, recurrimos a otros organismos como los hongos, algas, etc.

Los vectores de expresión se han manipulado para conseguir la máxima expresión el gen:

• Son manipulaciones que dan lugar a una alta expresión del gen.

• Son manipulaciones que aseguran una traducción eficiente del ARNm.

Se sustituyen los genes naturales de lac por los genes heterólogos.

Promotores más utilizados para la expresión de proteínas en E.coli.

Se han fabricado diferentes promotores que derivan del operón lac (pag 7).

Lac: Inducido por lactosa o análogos como el IPTG. A partir de él se han obtenido promotores como lacUV5 y tac.

Lac UV5: es el promotor lac con una mutación en la región -10, esta mutación hace que sea un promotor más fuerte que lac. Es inducido por lactosa o análogos como IPTG.

Operón del triptófano: Indución por la eliminación de triptófano en el medio, Es un promotor más barato por que es más barato controlar la concentración de triptófano que añadir lactosa al medio.

Operón tac: tiene la región -10 de lac y la región -35 del promotor del triptófano. Es inducido por lactosa o análogos (IPTG)

Los promotores más fuertes son los derivados de los fagos:

PL o promotor tardío del fago : está controlado por el represor cI. Se han aislado estirpes termosensibles.

Fago T7: promotor del gen 10 del fago T7. Se regula por la presencia de la polimerasa específica del fago T7. Es tan fuerte que cuando se activa (polimerasa en el medio) la célula sólo se dedica a fabricar esa proteína, condena a la célula la muerte.

El Inductor es un compuesto barato, la industria no gasta dinero en comprar inductores caros que no serían rentables, esto hace que se usen sustancias derivadas de otras industrias, por ejemplo sustancias que son ricas en triptófano para el promotor de Trp.

Se han diseñado sistemas en el que la expresión de promotor PL regulado por la proteína cI (termosensible aunque no podemos usar esta ventaja) depende de triptófano:

En un plásmido introducimos el gen de cI (represor) bajo el promotor del triptófano.

En otro plásmido introducimos el gen heterólogo bajo el promotor de fago .

Sin triptófano: El promotor del triptófano, se expresa, da lugar al represor cI que se une a PL y reprime la expresión del gen heterólogo.

Con trp: El Trp provoca la represión del promotor del triptófano, no hay expresión de cI, no se reprime PL y se produce la síntesis de gen heterólogo.

Las bacterias las crecen en molasas (derivados baratos de la industria) que proceden de la caña de azucar, son pobres en triptófano. Cuando las bacterias crecen en estos derivados de la industria todo el sistema esta reprimido por que no hay triptófano.

Cuando queremos producir el gen heterólogo se ponen derivados ricos en triptófano que reprimen al promotor de triptófano, no se sintetiza cI y se expresa el gen heterólogo.

AUMENTO DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO.

La transcripción se puede aumentar con el uso de promotores más fuertes , pero llega un momento en que no se pueden encontrar promotores más fuertes, esto se puede solucionar añadiendo más copias del gen dentro de la factoría.

Cuando trabajamos con plásmidos es fácil aumentar la expresión del gen con el aumento del números de copias dentro de una factoría. Sólo tenemos que conseguir plásmidos que se repliquen muy bien, su replicación depende del origen de replicación por tanto hay que seleccionar plásmidos con origen de replicación que se expresen muy bien.

El Problema es que las células gastan mucha energía en mantener tantas copias de plásmidos en su citoplasma.

Efectos del número de copias de plásmidos en la tasa de crecimiento de sus células hospedadoras. (Pag 8) Tabla 6.6:

A mayor números de plásmidos, menor crecimiento de la célula, debido al consumo de energía en el mantenimiento de los plásmidos.

Efectos de la temperatura sobre el número de copias de plásmidos en tres vectores de expresión. (Pag 8) Tabla 6.1.

Para solucionar el problema del mantenimiento del número de copias de plásmidos, se han encontrado orígenes de replicación inducibles que se regulan con la temperatura. Cuando aumenta la temperatura, aumenta el número de plásmidos dentro de la célula.

Se crece la célula a baja temperatura y cuando se necesita que se exprese la proteína heteróloga se aumenta la temperatura, aumentando el número de copias y se pone el inductor de la transcripción.

Por ejemplo en el vector pCD3:

A 28 ºC tiene 60 copias dentro de la célula.

Al aumentar la temperatura a 42 ºC, el número de copias sube a 713.

Con estos sistemas se ha conseguido que el 20% de las proteínas de una célula sea proteína heteróloga.

INTEGRACIÓN DE GENES EN LOS CROMOSOMAS.

Hace que la célula no use energía para mantener el plásmido.

La integración de genes en los cromosomas se realiza Por recombinación homóloga.

En bacterias es casi siempre homóloga.

En eucariotas superiores es heteróloga. no es homóloga.

Debemos tener la secuencia de la bacteria para usarla como molde para la recombinación.

Dos formas de integrar un gen en un sitio cromosómico concreto:

(Pag 9)

Por dos hechos de recombinación.

En el plásmido se introduce el gen clonado y dos secuencias flanqueándolo que son homólogas a una secuencia del cromosoma de la bacteria.

Se interrumpe el gen de la bacteria y se introduce un nuevo gen.

La secuencia del cromosoma de la bacteria donde se introduce el gen clonado debe ser un gen no esencial o una región intergénica.

Por un hecho de recombinación.

En este método es más fácil seleccionar las bacterias en las que se ha producido la inserción.

En el plásmido solamente se introduce una de las regiones homólogas a un lado del gen clonado.

Se produce:

• La introducción de todo el plásmido.

• La duplicación de la región homóloga donde ha ocurrido el hecho de recombinación.

• La introducción del ADN del plásmido. El ADN del plásmido contiene secuencias de los genes de antibiótico lo que da una ventaja a la hora de aislar los superproductores.

La selección de las bacterias que han introducido el plásmido se realiza por aumento de la concentración de antibiótico en el medio de cultivo.

Actividad y número de copias del gen para la -amilasa en B.subtilis:

(pag 9)

• Estirpes con dos copias son más sensibles a cloranfenicol.

• Estirpes con 4 copias son mucho más sensibles que las anteriores.

• Estirpes con 9 copias, aumenta su sensibilidad muchísimo más.

Si lo hacemos con plásmido multicopia ( no integrado en el cromosoma) el mantenimiento del plásmido supone un gasto de energía y supone menor resistencia al antibiótico. Son peores para la producción de la proteína heteróloga. Los plásmidos además se pierden con alta frecuencia.

Los plásmidos integrados son mucho más estables.

EFICACIA EN LA TRADUCCIÓN DEL ARNm. (Pag 10).

Debemos asegurar que el mensajero se traduce bien (eficacia de traducción) para ello:

Una manera de garantizar la eficacia de la traducción es que el plásmido contenga secuencias que garanticen la correcta traducción del mensajero. Como secuencias de alta afinidad por ribosomas, donde el ribosoma se une con mucha eficacia (rbs).

No se deben formar estructuras secundarias entre las secuencias rbs y la secuencia del gen que hemos clonado, estas estructuras secundarias dejarían a la secuencia rbs recluida en la estructura secundaria y no podría unirse el ribosoma.

Para evitarlo, se utiliza la mutagénesis dirigida, es decir, se producen cambios pequeños en el número de nucleótidos del gen de forma que no cambie el significado del gen (no de lugar a cambios de aminoácidos) pero que impida la formación de estas estructuras.

Para un aminoácido determinado, cada especie usa unos codones con mayor frecuencia que otros, esto está asociado con el número de ARN-t de la célula. Por tanto cada organismo tiene un uso de codones específico.

Debemos tenerlo en cuenta porque debemos elegir organismos con un uso de codones similar al organismo del que procede el gen, si no faltarían ARN-t para determinar de descifrar los codones y bajaría la concetración de proteínas.

Además debe ser estable en el sistema (organismo) donde se expresa. La estabilidad depende de:

Formación de puentes disulfuro.

Regla del extremo amino:

Estabilidad de la galactosidasa con la adición de ciertos aminoácidos al extremo N-terminal. (Tabla 6,4, pag 10).

Vemos como la presencia de un determinado aminoácido afecta a la estabilidad de una proteína.

La estabilidad de la proteína depende de los aminoácidos del extremo N-terminal y de los puentes disulfuro.

Secuencias reconocidas por proteasas:

La estabilidad también depende de la secuencia reconocida por las proteasas de la célula huesped que la pueden degradar. La solución es por mutagénesis dirigida y cambiar la secuencia reconocida por la proteasa o usar sistemas sin proteasas.

La Expresión depende de la posición subcelular de la proteína. Ejemplo: proinsulina humana es 10 veces más estable si se excreta al espacio periplásmico, que si se queda en el citoplasma.

Secreción de proteínas mediante la adición de una secuencia señal bacteriana.

(Pag 12)

El hGH antes se extraía de la hipófisis de cadáveres y muchos enfermos padecían por ello la misma enfermedad que la de las vacas locas.

Actualmente la hGH procede de bacterias.

Al vector de expresión que contiene el gen clonado de la hGH se le adiciona las secuencias necesarias para dar lugar a péptido señal unido a hGH. El péptido señal transporta a la proteína al espacio periplásmico.

Para separar la proteína del péptido señal se produce un corte entre ambas por una proteasa y queda la proteína hGH sin metionina. La proteína normal tampoco contiene metionina en el extremo amino.

hGH (hormona el crecimiento humano) no contiene metionina por que se fabrica como precursor, se produce un corte proteolítico que separa parte de su secuencia.

La secreción favorece la purificación de la proteína heteróloga ya que no tenemos que separarla del resto de proteínas de la célula.

En la purificación se da un choque periplásmico que provoca que todas las proteínas del periplasma salgan al exterior y nos la del citosol.

Esto supone aporte ilimitado de hGH al contrario que la obtención a partir de los cadáveres.

Proteínas recombinantes:

A veces para aumentar la estabilidad de la proteína lo que se hace es unir la proteína heteróloga a una proteína natural de E.coli o a un fragmento de proteína natural de E.coli formando así una proteína de fusión.

La Proteína de fusión es por tanto una mezcla de la proteína de E.coli con la proteína que queremos expresar.

Se expresa a partir del mismo vector donde fusionamos el gen de proteína de E.coli con el gen de proteína heteróloga.

Por ejemplo la Interleucina 2 se produce como proteína de fusión.

Aumenta la estabilidad y la purificación del resto de proteínas.

Purificación de las proteínas recombinantes.

Se han diseñado diferentes moléculas para purificar proteínas de fusión (pag 13):

Columnas con anticuerpos contra péptidos: se fabrica una columna con anticuerpos contra una proteína, el anticuerpo reconoce un determinado péptido bacteriano y en la columna queda el anticuerpo unido al péptido con la proteína.

A veces en vez del péptido marcado se ponen 6 histidinas y en la columna moléculas se pone níquel.

Al final obtenemos la proteína híbrida unida a la columna. Normalmente se adiciona en la proteína de fusión una secuencia reconocida por proteasas específicas , por tanto una vez purificada la proteína de fusión, se trata con proteasas y se separa la proteína y el péptido.

Producción de insulina: (Pag 14)

La molécula de insulina está formada por dos cadenas peptídicas unidas por un puente disulfuro. E.coli no puede producir puentes disulfuro por tanto se usan dos cultivos bacterianos:

1º cultivo: se produce la cadena A de la insulina.

2º cultivo: se produce la cadena B de la insulina.

Cada cadena se produce como una proteína de fusión con galactosidasa (-gal):

En la bacteria se introduce un plásmido con:

Promotor bacteriano.

Gen de -gal,

Secuencia de la cadena A de la insulina.

Gen de resistencia a ampicilina,

La bacteria que introduce este plásmido produce la cadena A fusionada con -gal.

Lo mismo hacemos con la cadena B.

Se purifican las dos proteínas quiméricas (gal-cad A y gal-cadena B) usando anticuerpos contra -gal.

La insulina no tiene metioninas en su cadena, de forma que se pueden separar con bromuro de cianógeno que produce el corte detrás de la metionina. La proteína de fusión tiene la metionina en puntos de unión de -gal a la cadena de insulina.

In vitro se renaturalizan las cadenas y se provoca la formación de los puentes disulfuro (oxidación de las Cisteinas).

UTILIZACIÓN DE CÉLULAS EUCARIOTAS PARA LA PRODUCCIÓN HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS. (pag 15)

Problemas más frecuentes asociados con la expresión de genes eucarióticos en procariotas:

Algunos proteínas eucariotas son inestables. Forman cuerpos de inclusión que son grandes agregados de proteínas heterólogas y no son funcionales.

Algunas proteínas carecen de actividad biológica por falta de modificaciones postraducionales. Los procariotas no llevan a cabo las modificaciones postraducionales de eucariotas como la adición de azúcares y otras moléculas o la formación de los puentes disulfuro.

Productos purificados pueden estar contaminados con compuestos bacterianos.

Todo esto lleva a buscar sistemas alternativos:

Los cultivos de células de mamíferos son sobre todo cultivos de células procedentes de tumores aunque son muy costosos, necesitan suero bovino y se contaminan fácilmente por hongos. Solo se recurre a ellos cuando no queda más remedio.

Los Eucariotas que pueden llevar a cabo modificaciones postraducionales son las levaduras y los hongos. Dentro de las levaduras, la más usada es Saccharomyces cerevisiae.

Ventajas de Saccharomyces cerevisiae para la expresión heteróloga.

No en todos los casos realiza la mismas modificaciones postraducinonales que los mamíferos ya que es un organismo diferente pero:

• Es unicelular y crece bien en bioreactores.

• Genética, fisiología y bioquímica muy bien conocidas.

• Fácil de manipular genéticamente.

• Se han identificado promotores fuertes y plásmidos naturales.

• Lleva a cabo muchas modificaciones postraduccionales.

• Secreta las proteínas al medio exterior, esto hace que si el vector de expresión lleva el péptido señal sea fácil de aislar.

• Es un organismo seguro.

Se usan para la producción de muchas sustancias para el hombre (pag 16):

Agentes terapéuticos:

Factor de crecimiento epidermal.

Insulina.

factor de crecimiento similar a la insulina.

• Vacunas:

• Antígenos de superficie de virus de la hepatitis B.

Las vacunas normalmente están constituidas por organismos inactivados o atenuados, esto conlleva el riesgo de que en ellas quede algún organismo capaz de producir la enfermedad, por eso se siguen buscando sistemas alternativos con la expresión heteróloga, por ejemplo la introducción simplemente de las moléculas que producen las respuestas inmunes (moléculas antigénicas).

Por ejemplo los agregados de proteínas de la envuelta del virus de la hepatitis B son componentes más inmunogénicos que el propio virus, pero es difícil de producir.

Se intentó la expresión de estas proteínas en bacterias pero no se pudo obtener en altas cantidades.

Se recurrió a la levadura; se aisló el gen a partir del cromosoma del virus y se clonó en un vector de expresión de levadura, a estos vectores se les denominan transbordadores.

Todo el proceso de manipulación genética se realiza en las bacterias y solo se introduce en levaduras para la expresión.

El vector transbordador tienen todos sus componentes duplicados: promotor, marcador y origen de replicación.(uno para cada célula; bacteria y levadura)

Se transformó a las levaduras y se seleccionaron las que habían incorporado el plásmido.

Producen agregados de proteínas iguales a las que se producen en el paciente vacunado contra la hepatitis B.

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN CULTIVOS DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS.

La primera proteína humana expresada en cultivos de células de mamíferos fue el activador del plasminógeno tisular. Este factor se inyecta en individuos que han padecido infarto de corazón.

El activador del plasminógeno tisular activa a la plasmina que disuelve el coágulo de sangre del trombo que causa el infarto.

Se usó un vector de expresión para células de mamíferos, este estaba formado por:

Promotor de mamíferos.

Terminador de mamíferos.

Dos Genes de selección en mamíferos (marcador).

Origen de replicación en E.coli.

Marcador seleccionable en E.coli.

Para la selección en células eucariotas, el vector lleva dos marcadores:

1º marcador de TK (timidina quinasa). selecciona la entrada del plásmido en mamíferos. Las células que se transforman son TK(-), cuando se transforman se vuelven TK(+). Se siembran en medios que seleccionan las células TK(+).

2º Marcador de DHFR (hidrofolato reductasa). Selecciona células altamente productoras de la hormona. El gen de hidrofolato reductasa (DHFR) da resistencia al metotrexato. La resistencia a metotrexato tiene la ventaja de que al aumentar la concentración de metotrexato en el medio de cultivo, se selecciona células con mayor número de genes de resistencia (mayor número de plásmidos integrados) y por tanto con alta producción del plasminógeno tisular.

La proteína va a ser finalmente secretada al medio por que en el vector se clonó el gen completo incluyendo el péptido señal.

En las células de los mamíferos, el plásmido se integra de forma heteróloga en el cromosoma.

- Los cultivos de mamíferos tienen la ventaja de que las proteínas que secretan son funcionales.

- El inconveniente es que tienen un elevado coste, es un proceso lento y son fáciles de contaminar.

ANIMALES TRANSGÉNICOS PRODUCTORES DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS.

La ventaja de esta técnica es que algunas especies utilizadas para la producción de proteínas heterólogas han sido criadas durante mucho tiempo por el hombre y existen infraestructuras para criar a esos animales.

Los primeros experimentos se hicieron en ratones por que son mamíferos y se ha trabajado con ellos en el laboratorio durante mucho tiempo. Se trabajó con ellos solamente para establecer el protocolo experimental para más tarde llevarlo a cabo en cabras, vacas, etc.

La primera proteína aislada en animales fue la antitrombina 3 que los enfermos operados del corazón con bypass no la producen.

La antitrombina 3 se produce hoy en día, en la leche de cabras transgénicas.

La idea es producir las proteínas de interés en órganos de reserva del animal; básicamente en la leche y en los huevos.

La Estrategia para obtener los animales transgénicos es:

Utilizamos como vector, un plásmido de E.coli que contiene:

• El gen de proteína que queremos clonar: antitrombina 3.

• Promotor que se expresa únicamente en células mamarias.

Microinyección del vector en óvulos recién fecundados pero antes de la fusión de los dos núcleos. El ADN se inyecta en uno de los pronúcleos, normalmente en el del espermatozoide, aunque depende de la especie animal.

El vector se integra al azar en alguno de los cromosomas del pronúcleo.

Se deja que siga el desarrollo normal y los óvulos se implantan en ovejas o en cualquier otro mamífero (dependiendo del origen del óvulo) y en madres pseudopreñadas.

Hacemos un análisis de la progenie para saber en que madres se había insertado. Se seleccionan las ovejas de la progenie que expresan adecuadamente la proteína en las células mamarias.

Se extrae la leche y se separa la proteína humana.

Existen otras proteínas que se están intentando aislar por este método como la proteína antitripsina- necesaria para los enfermos de efisema pulmonar.

Por el método actual solo se extrae antitripsina- suficiente para un tercio de los enfermos, se extrae de la sangre directamente y se cree que para el 2007 se va a poder obtener de la leche.

GENERACIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS MEDIADA POR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS.

• Las plantas llevan a cabo prácticamente todas las modificaciones postraducionales.

• Su ciclo de vida es más corto y más controlable.

• Son más baratas de mantener y más rápidas de reproducir.

Se pueden generar plantas transgénicas de dos formas:

Transformación mediada por agrobacterium tumefaciens

Bombardeo del tejido con micropartículas recubiertas de ADN.

Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Se usa los plásmidos Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Estos plásmidos tiene la capacidad de transferir el ADN desde las bacterias a la planta. Se transfiere todo el ADN localizado entre dos secuencias llamadas borde izquierdo y borde derecho.

A partir de estos plásmidos se han ideado otros en los que se ha eliminado toda la secuencia que había entre los bordes izquierdo y derecho de Ti y en su lugar se ha colocado:

• El marcador seleccionable en la planta: gen de resistencia a canamicina.

• Sitio de clonación múltiple donde se introduce el gen.

En el resto del plásmido se inserta:

• Marcador seleccionable en E.Coli.

• Origen de replicación en E.coli.

El gen que se quiere expresar en el plásmido está bajo un promotor fuerte, generalmente es el promotor de un virus, el más usado es el promotor del virus del mosaico de la coliflor.

La secuencia fusión (promotor + gen) se introduce en la región de clonación múltiple del plásmido.

El plásmido con la secuencia se introduce en E.coli.

Mezclamos en un cultivo E.coli con Agrobacterium y por conjugación el plásmido pasa a Agrobacterium. Tenemos que transferirlo a Agrobacterium por que es quien tiene la capacidad para introducir al plásmido en la planta

Tenemos Agrobacterium con un plásmido Ti normal (tiene genes necesarios para la transferencia a la planta) y el plásmido anterior (vector). Agrobacterium transfiere tanto al gen que queremos expresar (con el promotor) como el marcador seleccionable de resistencia a canamicina.

El plasmido Ti natural produce todas las proteínas necesarias para transferir el plásmido a la planta.

Agrobacterium transfiere todo el ADN entre el borde izquierdo y derecho. El ADN se integra en el cromosoma de la planta de forma aleatoria.

Se colocan en un medio de cultivo que induce la formación del callo, el medio lleva canamicina por tanto forman callos las células que hayan introducido el ADN del plásmido (lleva gen de resistencia a canamicina).

A partir del callo se puede generar la planta resistente a canamicina y que expresa el gen en grandes cantidades gracias al promotor fuerte.

Esta técnica se ha utilizado sobre todo para la producción de anticuerpos humanos.

El primer producto comercial generado por esta técnica se llama Caro Rx, es un anticuerpo humano monoclonal contra Streptococcus mutants que coloniza los dientes y produce caries. Este producto se ha obtenido con la planta del tabaco.

INGENIERIA PROTEÍNICA.

La ingeniería proteínica es una rama de la biotecnología que intenta cambiar las proteínas para mejorar sus propiedades naturales.

Uno de los productos obtenidos por ingeniería proteínica es el factor de activador del plasminógeno tisular.

La proteína natural no es ideal por que:

Es eliminada rápidamente del torrente sanguíneo y se deben inyectar altas cantidades en los enfermos, lo que puede llegar a producir derrames internos y en algunas ocasiones provoca la muerte por su alta actividad en plasma (derrame cerebral).

La proteína natural tiene alta afinidad por la fibrina, se pega al exterior del trombo y no entra en el interior del trombo ( no cumple su función).

Esto hace que busquemos formas para que dure más en sangre y baje la afinidad. Dos formas de hacerlo:

Mutagénesis dirigida:

(Tabla 8.6 pag 20). Cambios de aminoácidos por mutagénesis dirigida.

Todos los valores se dan en comparación con la versión silvestre, es decir:

• Un valor = 1 quiere decir que es igual al valor de la versión silvestre.

• Un valor <1 es un valor menor que el de la versión silvestre.

• Un valor >1 es un valor mayor que el de la versión silvestre.

Cambio 1: Thr(103) ! Asn:

• Aumenta la estabilidad de la proteína en plasma, aumenta 10 veces más que la silvestre.

• Baja la capacidad de unión a fibrina.

• Baja la actividad en plasma.

• Baja la actividad en los coágulos.

Cambio 2: cambio de 4 aminoácidos (296-299) por alanina:

• no afecta a la estabilidad.

• No afecta a la capacidad de unirse a fibrina.

• Baja considerablemente la actividad en el plasma.

• No afecta a la actividad frente a los coágulos.

Cambio 3: combinación de las dos mutaciones anteriores.

• baja el efecto estabilizador en comparación con el cambio 1 pero aún su valor es mayor que la versión silvestre.

• Baja la capacidad de unión a fibrina

• Baja la actividad en plasma.

• Poca actividad frente a los coágulos.

Cambio 4: Thr(103) !Asn; Asn (117) ! Gln:

• aumenta la estabilidad frente a los coágulos respecto a la silvestre.

• La capacidad de unirse a fibrina se mantiene.

• La actividad en plasma prácticamente se mantiene.(aumenta poco).

• La actividad en los coágulos aumenta.

Cambio 5: combinación de mutación 2 con la 4.

• aumenta la estabilidad muy poco en comparación con las anteriores mutaciones.

• Aumenta la capacidad de unión a fibrina

• Baja considerablemente la actividad en plasma.

• Aumenta considerablemente la actividad en los coágulos.

Cambio 6: combinación de todas las mutaciones anteriores:

• aumento de la estabilidad : 8,3> que en silvestre (1).

• Baja la capacidad de unión a fibrina: 0,87< silvestre.

• Baja la actividad en plasma: 0,06< 1

• Mantiene niveles normales frente a los coágulos 0,85

Clonación de subregiones del gen natural.

Se conoce su estructura tridimensional y se sabe cual es la función de cada dominio:

• Peptido señal.

• Dominio de dedo: unión con alta afinidad a la fibrina.

• Dominio de EGF: dominio de degradación de la proteína. Baja la estabilidad de la proteína en sangre.

• Dominio de rosquilla 1. Función sin determinar

• Dominio de rosquilla 2: baja la afinidad por la fibrina.

• Dominio proteasa: dominio de actividad que convierte el plasminógeno en plasmina.

Cada dominio está determinado por un exón de manera que pueden cogerse exones concretos para formar una proteína.

Fusionamos la secuencia del dominio de rosquilla 2 con la secuencia del dominio proteasa y nos olvidamos de todos los demás dominios.

Introducimos las secuencias en un vector de expresión y expresamos la proteína resultante en E.coli.

La proteína resultante se denomina reteplasa, contiene los dos dominios y no lleva unido los azúcares. E.coli no realiza modificaciones postraducionales. Los azúcares le dan inestabilidad y acortan la vida media.

Esta proteína es más estable y tiene baja afinidad por la fibrina por tanto entra con mayor afinidad en el coágulo. Además se expresa en E.coli lo que equivale un menor gasto y más facilidad a la hora de la manipulación.