El Multifacético CFTR

Roberto RochIn; Julio V. Suárez; Mario Yañez

Abstract

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is a chloride channel, and a regulator of the activity of other ion channels, central in the control of secretions in apical epithelial cells. This protein not only regulates the conductance of Cl- but it is also involved in the conduction of HCO3- as well as the regulation of other chloride channels and sodium channels. Thus, a deficiency in this channel represents serious health problems. Here we describe the general aspects on it's structure and function as well as the problems that a deficiency in the CFTR causes in humans, focusing in the ðF508 mutation.

Resumen

El regulador de conductacia transmembranal de la fibrosis cística (CFTR) es un canal de cloro y un regulador de otros canales central en el control de la excreción celular de células epiteliales apicales. Esta proteína no solo regula el paso de iones Cl- sino que está involucrada en la conducción de HCO3- y la regulación de otros canales de cloro y sodio. Por ello una deficiencia en este canal representa serios problemas para la salud. Aquí describiremos los aspectos generales sobre la estructura y función del CFTR así como los problemas que su deficiencia provoca en el organismo, enfocados a la mutación ð08

El gen de 250,000 pares de bases y 27 exones, situado en el cromosoma 7q21-31 que codifica una proteína de 1480 aminoácidos, CFTR. (Hilman, 1997) La importancia de este gen se puede observar claramente en los desordenes que provoca su mal funcionamiento tales como: insuficiencia pancreática y diabetes, obstrucción del conducto biliar, infertilidad masculina y en ocasiones, femenino; alta concentración de Cl- en sudor, obstrucción intestinal, sinusitis crónica, inflamación e infección crónica pulmonar causante del 90% de la mortalidad en pacientes, provocada por: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, las más comunes seguido por Haemophillus influenzae y Stenotrophomonas maltophilia.(Morales et al., 1999)

Estructura

La proteína esta conformada por dos dominios transmembranales (MSD1 y MSD2), con seis subdominios transmembranales (TM), dos dominios enlazadores de nucleótidos (NBD1 y NBD2), un dominio regulador R. Se encuentra mayormente embebida en la membrana, que provee al canal o poro de intercambio de iones Cl- a través de ella. (Morales et al., 1999) Cada MSD esta conformado por 6 hèlices transmembranales (Foskett, 1998) y, aparte de los “giros” que intervienen entre las hélices TM 1 y 2 en el MSD1 y entre 7 y 8 en la posición correspondiente en el MSD2, poca mas del CFTR se presenta expuesta en la superficie exofacial de la membrana celular (Kopito, 1999).

Función

El CFTR funciona como un canal de Cl- de baja conductancia regulado por cAMP y que es independiente del voltaje. Se requiere de la fosforilación mediante Protein Cinasa A (PKA) dependiente de cAMP y de la unión o hidrólisis de ATP para que el canal se active. La fosforilación ocurre en el Domino R (RD) y la hidrólisis en uno o ambos NBD's.(Morales et al., 1999).

Las fracciones TM6 y TM12 del MSD1 forman el poro del canal y la TM6 forma una parte crucial en la determinación de sus propiedades permeables al actuar como un filtro selectivo, (Gupta y Linsdell, 2003) dándole al CFTR una ventaja enorme en comparación con el resto de los canales iónicos que suelen ser menos selectivos.

Regulación del Otros Canales

El CFRT regula los canales de cloro rectificadores hacia fuera (ORCC) mediante un mecanismo que involucra la liberación de ATP, por lo que se ha sugerido que este es un canal dual de Cl- y ATP. Una vez fuera de la célula, el ATP puede interactuar con receptores purigènicos que, una vez activados, pueden estimular los ORCCs a travès de segundos mensajeros, incrementando el transporte de cloro en la célula. El NBD1 y el RD son esenciales para la abilidad del CFTR de regular los ORCCs.(Morales et al., 1999)

Estudios sugieren que la interacción entre el CFTR y los ENaC's puede ser directamente por union de proteínas. Se ha demostrado que el transporte de Cl- por el CFTR contribuye a la inhibición de los ENaC's .(Morales et al., 1999)

El CFTR tambièn lleva a la multiresistencia celular a drogas y parece ser que tiene patrones de expresión complementarios con la P-glicoproteìna.

Regulación de la Actividad del CFTR

El CFTR es regulado por cinasas y fosfatasas y por nucleòtidos de adenina, Mg2+ y fosfato inorgánico (Pi). La cinética de la apertura y cierre es característicamente lenta con largas aperturas (60-200 ms) y cierres independientes de voltaje (100-400 ms). Incluye tambièn cierres más rápidos (2-10 ms) que son más prominentes a potenciales negativos de membrana pero que pueden ser atribuidos a la interacción de otras moléculas con el poro. La característica más inusual de la regulación del CFTR es su dependencia de la hidrólisis de ATP. Con cada ciclo de hidrólisis, el canal normalmente emplea el 50% del tiempo conduciendo Cl-. Se ha especulado que la sensibilidad al ATP puede facultar al CFTR a determinar el estado metabólico de la célula y regular su actividad de acuerdo a ello. (Foskett, 1998)

El Dominio R

Desde la secuenciación de CFTR la función del RD ha sido intrigante. Es imposible inferir dicha función debido a que este dominio es único entre las proteínas ABC y en general entre cualquier proteína.

La característica más remarcable de este dominio es la presencia de sitios de fosforilación por PKA ampliamente conservados entre especies. Esto es consistente con el hecho de que el PKA es el principal agente de fosforilación en la proteína. Otros agentes que fosforilan al dominio R son la Protein Cinasa C (PKC), la PK dependiente de cGMP y la tirosina. Los sitios de fosforilación se localizan entre las Ser-660 y Ser-813.(Ostedgaard et al, 2001)

Si bien las Ser son los principales sitios de fosforilación, experimentos han demostrado que ninguna serina es necesaria para la estimulación del RD, aunque serinas individuales parecen estimular la actividad del canal en diferentes proporciones. La información disponible sugiere que se requiere de distintos eventos secuenciales de fosforilación para activar el CFTR.

Sin embargo en ausencia de serinas los canales se mantienen abiertos en presencia de ATP sin requerir fosforilación. Esto sugiere que el RD tiene función regulatoria. El RD no fosforilado inhibe la actividad del CFTR y que la fosforilaciòn elimina dicha inhibición.

Esto podría sugerir que esta inhibición recae en cambios estructurales del RD resultado de su fosforilación, sin embargo se ha demostrado que este proceso no genera cambios estructurales en el dominio. Aun más, la estructura del dominio no esta definida, sino que es una serie de enrollados aleatorios con una pequeña proporción (5% aprox.) de hélices. Experimentos realizados mediante la sustitución del RD con la región central de conexión entre el NBD1 y el MSD1 de la P-glicoproteìna (otra proteina ABC) que incluye sitios de acción de PKA indican que solo se requiere un sitio de unión para promover la acción del CFTR. Otros estudios han demostrado que en ausencia de un sitio de conexión partes del NBD1 son suficientes para activar el canal iónico.

La función del RD está prácticamente definida, sin embargo no se ha podido establecer la forma en que este regula la actividad del CFTR. Las principales posibilidades propuestas incluyen la interacción de este dominio con otras partes de la proteína o cambios conformacionales sumamente localizados y en escala muy pequeña

Biosìntesis y Procesamiento del CFTR

El CFTR es sintetizado en el RE rugoso como un precursor inmaduro glicosidado básicamente (140 kDa), el cual es asociado con los chaperones HSP70 y calnexina. Una fracción (20-40%) madura, lo que involucra la obtención de su estructura terciaria, hacia el aparato de Golgi (a travès de las vesículas COPII) (Riordan, 1999) consecuente con su disociación de los chaperones y su conversión en un oligosacàrido complejo estable (vida media=7.5 h) de aproximadamente 160kDa. La mayorìa del CFTR inmaduro no madura y es rapidamente degradado. (Kopito, 1999)

La degradación se da por un proceso de ubiquitinaciòn que lleva a la proteína a los proteosomas en donde es degradado por proteasas (Xiong et al., 1999) y otras enzimas proteolìticas rapidamente(Kopito, 1999)

Mutaciones

Las mutaciones del gen del CFTR son las más comunes entre caucásicos y se han encontrado más de 1300 de ellas (Kunzelmann y Mall, 2001) genes CFTR mutados se han encontrado en 1 de cada 25 personas en poblaciones caucásicas (Wang y Li, 2001). La fibrocis cìstica es la principal enfermedad genética potencialmente mortal entre estas poblaciones.

Las mutaciones en el NBD1 son más serias que las del NBD2, la maduraciòn del CFTR parece ser más sensible a estas mutaciones e inclusive mutaciones idénticas en ambos dominios afectan en mayor proporción la maduraciòn del canal cuando se presentan en el NBD1. (Kopito, 1999) Esto indica que el proceso de control de calidad inicia temprano en el proceso de biosíntesis. (Riordan, 1999)

Mutaciones en el gen CFTR ocasiona el mal proceso de esta proteína desemboca en una mala función y regulación de este canal. Se conocen más de mil mutaciones de este gen. Sus consecuencias las podríamos agrupar en cinco clases: (después de Stuhrmann y Dôrk, 2000)

“No síntesis”

“Bloque en procesamiento”: afecta al procesamiento de la proteína. (Eliminación de un aminoácido, fenilalanina el más común, F508del), falla en la creación de una envoltura resistente para su maduración en Retículo endoplásmico.

“Bloque en regulación”: afectando principalmente la regulación de Cl- por el canal. (la más típica en Fibrosis Cistica).

“Conductancia alterada”: afecta la conducción (paso) de Cl- por el canal.

“Síntesis reducida”: Baja de la síntesis de la proteína.

Mutación ðF508

La eliminación de la Fenilalanina 508 (ðF508) es la principal mutación del gen del CFTR, representa más del 70% de los casos. Esta mutación afecta el procesamiento de la proteína la cual no adquiere su estructura terciaria por lo que ya sea no logra separarse de sus chaperones o la ubiquitinaciòn es reconocida más fácilmente por el control de calidad del RE.(Kopito, 1999).

Es necesario que se presenten dos copias del gen mutante para que la enfermedad se exprese y no se ha reportado ningún problema de salud asociado a aquellas personas que portan una sola copia.

La eliminación de la Phe se debe a la eliminación de tres pares de bases entre el 1648 y el 1653 en el exòn 10. Esta locaciòn corresponde al NBD1, que como se mencionò anteriormente es mas susceptible a impedir el procesamiento adecuado de la proteína al ser mutado.

Experimento han demostrado que aun con la mutación una porción de los CFTR's son procesados y se establecen funcionalmente en la membrana, siendo esto el principal punto de estudio en terapias contra la fibrosis cìstica.

Esta mutación está relacionada con fisiopatìas severas y es comúnmente mortal. (Noone y Knowles, 2001)

El impacto tan grande de la FC ha desencadenado una gran cantidad de estudios sobre la función del CFTR, todo esto ha llevado a una importante cantidad de experimentos relacionados con la terapia molecular que van desde la terapia genética con la introducción de genes correctos mediante vectores, ha el intento por aumentar la cantidad de proteínas mutadas que escapan al control de calidad del RE ya sea intentando inhibir este control, promoviendo la obtención correcta de la estructura terciaria de la proteína o promoviendo la overexpresiòn del gen del CFTR, por mencionar algunos.

Sin embargo ha sido difícil, el tratamiento con vectores (virus) ha demostrado poca efectividad pues el organismo adquiere inmunidad rapidamente. En el caso de la inhibición del control de calidad, los procesos que lo rodean son muy poco conocidos como para desarrollar un método directo.

Referencias

Foskett, J. Kevin. ClC and CFTR chloride channel gating. Annual Reviews of Physiology 60:689-717 (1998)

Gupta, Jyoti; Linsdell, Paul. Extent of the selectivity filtered conferred by the sixth transmembrane region in the CFTR chloride channel pore. Molecular Membrane Biology 20:45-52 (2003)

Hilman, Bettina C. Genetic and immunologic aspects of cystic fibrosis. Annals of Allergy Asthma Immunology 79:379-394 (1997)

Kopito, Ron R. Biosynthesis and degradation of CFTR. Physiological Reviews 79:suppl. 1 S167-S173 (1999)

Morales, M.M.; Capella, M.A.M.; Lopez, A.G. Structure and function of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32:1021-1028 (1999)

Noone, Peadar G; Knowles, Michael R.'CFTR-opathies': disease phenotypes associated with cystic fibrosis transmembrane regulator gene mutations. Respiratory Research 2:328-332 (2001)

Ostedgaard, Lynda; Baldursson, Olafur; Welsh, Michael. Regulation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl- channel by its R domain. The Journal of Biological Chemistry 276:11 pp. 7689-7692 (2001)

Kunzelmann, Karl; Mall, Marcus. Pharmacotherapy of the ion transport defect in cystic fibrosis. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 28:857-867 (2001)

Riordan, John. Cystic fibrosis as a disease of misprocessing of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. American Journal of Human Genetics 64:1499-1504 (1999)

Stuhrmann, M; Dôrk, T. CFTR gene mutations and male infertility. Andrologia 32:71-83 (2000)

Wang, Shusheng; Li, Min. Molecular studies of CFTR interacting proteins. European Journal of Physiology 443:suppl 1 pp. S62-S64 (2001)

Xiong, Ximing; Chong, Elaine; Skach, William. Evidence that endoplasmic reticulum (ER)-associated degradation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is linked to retrograde translocation from the ER membrane. The Journal of Biological Chemistry 274:5 pp.2616-1624 (1999)