PRACTICA Nº 3

EXTRACION DEL DNA GENOMICO Y ELECTROFORESIS EN GEL

RESUMEN

El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas en la estructura de estos dos tipos de macromoléculas. El primer paso en la purificación del ADN por lo general consiste en homogeneizar las células y aísla los núcleos de los cuales se extrae el ADN. El medio de extracción ordinario contiene un detergente (SDS); a continuaciones le agrega solución de te para resuspender el ADN, luego los ácidos nucleicos se precipitan añadiendo etanol .Para concluir el análisis de la extracción del ADN hay que resaltar que e n este proceso ocurre una lisis celular lo cual significa que el ADN queda libre por consiguiente hay que protegerlo de las enzimas porque estas podrían degradarlo .

La electroforesis es el movimiento de partículas eléctricamente cargadas a través de un gel de agarosa como resultado de un campo eléctrico formado entre unos electrodos sumergidos en el medio , este procedimiento permite la separación de moléculas como consecuencia de su diferente movilidad en un campo eléctrico .

INTRODUCCION

El ácido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molécula que guarda el código genético de todas las células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético.

Durante el laboratorio de hoy estaremos utilizando un método rápido para aislar DNA a partir de tejidos animales. Este se llama "DNeasy Tissue Kit" y es producido por QIAGEN. Este usa tecnología avanzada de membranas de silicato para purificar rápidamente DNA celular total sin usar extracciones orgánicas ni precipitación con etanol.

El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.

El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y proteínas.

La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interfase. La fase acuosa se retira del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se enrolla sobre una varilla de vidrio conforme sale de la solución. En la interfase el RNA sale de la solución salina.

En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados que se asienta en el fondo del vaso. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa. Enseguida se quita la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.

La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación. Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a su cargas.

Los fragmentos de ADN lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases. Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los fragmentos está la concentración de agarosa.

La mayoría de los estudios de electroforesis son para comparar una secuencia conocida como el ADN plásmido con una no conocida; El ADN plasmidico presenta tres líneas, circular abierta - lineal - circular covalente cerrado.

MATERIALES

• Centrifuga

• Eppendorf 1.5 ml

• Tubos falcon de 12.5 ml

• Micropipetas y puntas desechables

• Pipetas de vidrio

• Colador

• Mortero y pistilo

• Hígado

• Cebada

• Cloruro de sodio

• Solución de etanol

• Isopropanol

• Detergente SDS

• Solución de lisis celular

• Agua destilada

• Vortex

• Hielo

• Vaso de precipitado

• Tubos eppendor

• Incubadora

• Agua destilada

• Agarosa

• RNAsa

• Buffer TAE

• Marcador de membrana.

• Cámara de electroforesis

• Bromuro de etidio

RPOCEDIMIENTO

HIGADO

• Picar el hígado y Triturar el hígado con sal, solución de lisis y SDS hasta que la muestra quede liquida.

• Filtrar y llevar a tubas falcon.

• Centrifugar por 20 minutos a 500 rpm.

• Tomar el sobrenadante y agregar 20 ml de alcohol isopropanol el cual precipita el DNA.

• Centrifugar por 20 minutos a 500 rpm.

• Eliminar el sobrenadante y tomar el pele a este agregar 1 ml de solución de te y mezclar en vortex sino aparece un halo que indica la presencia del DNA.

• Agregar 3 ml de etanol absoluto.

• Almacenar a 4ºC.

• Centrifugar por 5 minutos a 500rpm, y desechar el sobrenadante.

• Lavar el pele con etanol al 70%, por 5 minutos a 500 rpm.

• Dejar el tubo destapado para que se evapore el etanol, luego resuspender en solución de TE 200l.

• Tomar 100l de la resuspensión y llevarlos a un eppendor.

• Agregar 20l de RNAsa, y llevar a incubadora por 30 minutos a 37ºC.

• Agregar el buffer de carga (1l azul de bromofenol mas 1l glicerol).

• Llevar a electroforesis a 120v.

CEBADA

• Macere las semillas de cebada, tamice el macerado eliminando residuos de las conchas de las semillas y siga el procedimiento anterior.

El gel de agarosa que se utilizo para la electroforesis se preparo de la siguiente forma:

• Preparar una solución al 0.8% de agarosa (4g de agarosa, 450ml de agua destilada y 50ml de buffer TAE) con un volumen final de 500ml a una temperatura de 400ºC.

También se preparo la solución stop que contiene el fago  hind III, y la solución del DNA plasmidico 12l.

RESULTADOS

1.

La solución del DNA obtenido se almacena a 4ºC para posteriores estudios.

2.

Al observar la electroforesis en gel de agarosa después de 2 horas, solo se desplazo la muestra numero uno y el AND plasmidico.

ANALISIS DE RESULTADOS

Se debe tener en cuenta para posteriores extracciones de ADN que es importante utilizar todos los materiales completamente esterilizados, porque puede alterar los análisis de la muestra.

Debido a que se mantuvo la muestra a una temperatura adecuada (4ºC), se evito que el ADN desnaturalizara.

Gracias al rápido proceso de maceración impedimos que las enzimas destruyeran el ADN.

El procedimiento de extracción del ADN no se puede interrumpir ni prolongar pues el ADN con el tiempo se va deteriorando.

Gracias a la técnica de electroforesis debíamos evidenciar los fragmentos de ADN

El bromuro de etidio es el reactivo fundamental para la detección por tinción de fluorescencia y observación bajo luz ultravioleta .

La muestra de nosotros (numero 3) no evidencio desplazamiento en el gel de agarosa, posiblemente porque:

En el procesamiento del hígado y de la cebada se realizo un excesivo rompimiento del ADN.

Al agregar inicialmente la solución de lisis no se logro una desintegración total de las células.

CUESTIONARIO

• ¿Cuáles son las funciones del NaCl, etanol absoluto y el detergente?

Con el NaCl conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.

El etanol se utiliza para precipitar la solución del ADN.

La acción de este detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así nos quedará el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas, e inhibe cualquier actividad nucleasa presente en la preparación. 

• ¿Por qué se lava con etanol?

Porque el etanol siempre forma una capa arriba de la solución acuosa.

• ¿Que otras técnicas son empleadas en biología molecular para la extracción del ADN?

- Separación del DNA mediante electroforesis en gel.

- Técnica de extracción de DNA de leucocitos (técnica de miller)

- Método wizard (promega, usa)

- PCR

- Ultra centrifugación

- Espectrofotometría

- Técnica de sedimentación de ácidos nucleicos.

BIBLIOGRAFIA

• Gerald karp. Biología celular y molecular. ED McGrawHill 1998. Pág. 727-730.

• Biología Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P. Sanders., 1a edición. Editorial

• Trillas. México 1991: página 97, 98.

• http://pdf.rincondelvago.com/biologia-molecular_1.html