EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO EN EUCARIOTAS

Objetivo:

Obtener DNA genómico de Drosophila Melanogaster y de Hígado de cordero. Determinar, asi mismo, la pureza y la concentración de DNA mediante medidas de absorbancia.

Introducción:

El mapa genético del cromosoma nos da información sobre la posición de los genes en el cromosoma, el orden de éstos, y las distancias relativas de unos con otros. Un gen es una secuencia de nucleótidos de un acido nucléico (generalmente y en nuestro caso ADN) que contienen iinformación sobre un determinado carácter. El científico utiliza en entrecuzamiento, sobrecruzamiento, crossing over, que se produce en la meiosis, para determinar lo cercano que esta un locus de un cromosoma a otro. El locus expresa la posición fenotípica del gen en el cromosoma. Así se elaborará un mapa del cromosoma, y del genoma del organismo con el que estamos trabajando: Drosophila Melanogaster. Se dice que los loci que están en el mismo cromosoma están ligados entre sí. El número de grupos de ligamiento es el número de cromosomas en una dotación haploide.

Suponemos que los intecambios genéticos se producen con frecuencias comparables en todos los puntos del cromosoma. A más distancia entre genes, más probabilidad de que éstos estén separados por un intercambio genético. Dos loci a y b muy juntos en el cromosoma tendrán una frecuencia de recombinación muy baja en comparación con otros loci, c y d, bastante más lejanos.

Un marcador génico no es más que una mutación que descubre o marca la existencia de un gen determinado. La frecuencia de recombinación es alta cuando los marcadores están muy separados entre ellos. Por el contrario, si están muy próximos, lógicamente, la frecuencia de recombianción es baja. Si comparamos las frecuencias con distintas combinaciones de marcadores, podemos ordenar linealmente los marcadores, así sus distancias relativas son distancias recombinanatres entre ellos.

Fudamento teórico:

Sutton propuso la existencia de una relación entre el comportamiento cromosómico en la meiosis, y la segregación y distribución independiente de los genes. Tres puntos explican la teoría que afirma que los genes están en los comosomas: 1.- Genes y cromosomas están a pares. 2.- Los miembros de cada par de genes o homólogos segregan en los gametos. 3.- Diferentes pares génicos o cromosómicos actúan con independencia.

Es evidente que cada cromosoma contenía muchos genes ligados. Se observó empíricamente que los resultados eran distintos a los que cabía esperar según las leyes de mendel, se observó un ligamiento parcial. No se podía pensar en la distribución independiente.

Morgan sí interpretó este ligamiento parcial basándose en el análisis de cruzamientos de Drosophila Melanogaster: “No se cumple Mendel porque el gen que se estudia está en el cromosoma X, y el cromosoma Y no tiene su alelo.” Éste es un carácter que se trasmite ligado al sexo.

En Drosophila la hembra es XX, el macho XY, y la herencia del cromosoma X sigue el modelo de transmisión de genes ligados al sexo: El macho transmite su cromosoma X a su progenie, pero sólo a las hembras. Esto no pasa así con las hembras, éstas transmiten su cromosoma X tanto a machos como hembras, a todos los individuos. Entonces un macho transmite la información de su cromosoma X a sus nietos através de sus hijas. Esto pasa con muchas enfermedades conocidas (también en humanos), como el daltonismo, la halopecia...

Morgan también demostró la existencia de ligamiento y recombinación en el cromosoma X de Drosophila. Cruzó dos machos mutantes con dos hembras normales, después cruzo la primera genrecion, F1, y vió que los caracteres se comportaban seguún el modelo ligado al sexo. Se podía haber complido la ley de segregación independiente, o que los genes tuvieran un ligamiento completo, en cambio observó que existía entrecruzamiento:

Fue Sturtevant quien utilizó las frecuencias de recombinación para elaborar un mapa cromosómico, según lo que se ha explicado anteriormente. Los quiasmas dan lugar a intercambio génico o recombinación.

Pasos a seguir para calcular distancias y orden de mapas:

1.- Clasificar descendencia según los intercambios que se producen entre los tres marcadores: parental, recombinante I, recombinante II, doble recombinante.

2.- Contar número de individuos de cada clase y su total.

3.- Calcular frecuancia de cada clase, según la fórmula expresada anteriormente.

4.- Medición de las distancias usando el porcentaje de recombinación. Unidad: u.m. (unidades de mapa)

5.- Cálculo de las distancias reales.

6.- Un quiasma puede causar interferencia. Usamos el coeficiente de coincidencia:

Material de laboratorio:

ð Éter anestésico para las Drosophilas, pincel fino, lentes binoculares, cartulina, frasco donde se depositan las moscas cuya muerte no importa, frascos de cultivo con alimento a base azúcar, harina levadura...

ð Cepa triple mutante (w,cv,sn). Tres mutaciones X recesivas con respecto el alelo normal.

ð Cepa de Oregón R, con fenotipo salvaje (w+,cv+,sn+).

Desarrollo y organización de la práctica:

Primera semana

Diferenciación de los dos fenotipos con los que se va a trabajar. Preparamos un frasco de cultivo donde se dejarán a 6 hembras triple mutantes (vírgenes -pupa-) y 4 machos salvajes. Esperamos una semana para observar la descendencia.

Segunda semana

Comprobación de que han aparecido larvas y posibles pupas. Extracción del frasco de cultivo de los padres para evitar que se crucen en un futuro con la descendencia.

Tercera semana

Observación que la F1 es la que se espera. Tomamos 3 machos y tres hembras de la F1, y un siguiente cruzamiento, comprobar que los cambios de la F2 estarán ligados el sexo.

Cuarta semana

Muerte de los padres de la F2, y observación de la descendencia.

Quinta semana

Contamos el número de individuos de clada clase fenotípica que aparece en la F2, distinguiendo entre machos y hembras. En nuestro caso se produce ligamiento incompleto, ligamiento de recombinación. Datos obtenidos:

Para hallar el orden de los loci se comparan las clases dobles recombinantes, con cualquier clase no recombinante. Si comparamos la clase parental totalmente salvaje con la doble recombinante (w+,cv,sn+), los loci extremos tienen el mismo alelo, el locus cv cambia, por lo que ocupa la posición central.

Para estimar las distancias entre gen y gen clasifico la descendencia y calculo las frecuencias de recombinación.