I. INTRODUCCIÓN

Para la medida de la toxicidad de muestras producidas por fenoles, metales pesados, anillos cíclicos, etc., que impiden que el agua sea potable se utilizan Métodos Respirométricos. Estos métodos se basan en la respiración de la bacteria. Las bacterias y los microorganismos en general respiran durante el ciclo normal. Aquellas bacterias que entren en contacto con agentes tóxicos van a dejar de respirar. En una muestra de agua que contenga sustancias tóxicas las bacterias van a dejar de respirar mientras que si el agua es destilada o está libre de dichas sustancias, éstas seguirán respirando.

Para saber si están respirando nos basamos en la reducción de una sal, el cloruro de 2(p-iodofenil)-3-(-p-nitrofenil)-5-fenil tetrazolio (INT) que en su forma normal es incolora y cuando se reduce es de color rojo llamado formazano. Los microorganismos utilizados en este tipo de ensayo son la bacteria Pseudomonas fluorescens y la levadura Saccharomyces cerevissiae. Para nuestro ensayo vamos a utilizar levadura comercial de panadería, es decir, Saccharomyces cerevissiae. Para su conservación, la levadura en fresco es distribuida en tubos Eppendorf y almacenada a -30°C hasta su liofilización, proceso que dura aproximadamente 24 horas hasta su total deshidratación, tras lo cual se cierran los Eppendorf que han permanecido abiertos durante el mismo, sellándose con papel de parafina. La levadura liofilizada de este modo se guarda a -20°C hasta el momento de ser utilizada en los ensayos.

A. ENSAYO MICROSCÓPICO

Este ensayo se denomina convencionalmente ensayo de inhibición de la respiración de levadura de panadería. Ensayo que sólo es aplicable de forma sencilla con levadura, ya que se trata de células relativamente grandes y fáciles de observar a microscopía óptica convencional. En cambio, un ensayo con bacterias es más complicado, ya que debido a su pequeño tamaño es my difícil discernir con certeza la presencia o ausencia de gránulos de formazano en el citoplasma celular.

El protocolo ensayado es el descrito por Bitton et al (1984):

1. Suspendemos las levaduras al 1% en solución salina estéril, y posterior homogeneizamos en un agitador magnético durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se emplea una solución salina de cloruro de sodio (PANREAC) al 0.85%, que se esteriliza a 121°C, durante 15 minutos y se conserva a 4°C.

2. Incubamos en tubos de plástico de 0.8 ml de la suspensión de levaduras con 0.2 ml de una solución de la muestra a ensayar durante 30 min. en un baño termostático a 30°C con agitación. El control contiene 0.2 ml de agua desionizada estéril.

3. Adicionamos 0.1 ml del extracto de levadura al 10% y 0.1ml de la solución de INT al 0.1% con posterior incubación durante 1 h en una baño termostático a 30°C, con agitación y en oscuridad. La adición del extracto de levadura pretende aportar los elementos nutritivos necesarios para activar el metabolismo celular, y por consiguiente, la actividad respiratoria (Bitton et al). Se prepara disolviendo 3 g. de extracto de levadura (DIFCO) en 20 ml de agua destilada, completándose hasta un volumen final de 30 ml. Se esteriliza en el autoclave a 121°C durante 15 minutos y se conserva a 4°C. Es conveniente preparar poco volumen, dado que se contamina con mucha facilidad. La solución de INT es el elemento que va a poner de manifiesto la actividad respiratoria de la suspensión microbiana, tras u incubación con el tóxico (Bitton et al., 1984). Se prepara disolviendo 200 mg de INT (ALDRICH) en 90 ml de agua destilada y 0.5 ml de etanol al 95% (PANREAC), completándose hasta un volumen final de 100 ml con agua destilada. Tras permitir su completa disolución durante 24 horas, se esteriliza a través de un filtro de membrana de 0.22 m de diámetro de poro. La solución se puede conservar a 4°C, pero debe desecharse después de un mes de fabricación (Kopman & Bitton).

4. Para la detención de la reacción de reducción del INT y fijación de la muestra adicionamos 0.1 ml de formaldehido al 37% (QUIMON).

5. Preparamos una extensión con 2 ó 3 gotas de la suspensión de levaduras sobre un portaobjetos, secado al aire y fijación por calor. Teñimos con verde malaquita (MERCK) al 0.025% durante 1 minuto como colorante de contraste, tras lo cual se lava el colorante y se deja secar la preparación.

6. Finalmente observamos a microscopio de campo brillante con objetivo de inmersión (100x).

7. Hacemos el recuento de células que respiran (verdes con gránulos rojos) y de células que no respiran (sólo verdes). Debemos contar alrededor de unas 500 células para que el ensayo sea fiable.

8. Calculamos la actividad respiratoria tras la exposición al tóxico mediante la siguiente fórmula:

A.R (%)= nº células respiran/nº células totales en sol. ensayo×100

nº células respiran/nº células totales en sol. control

B. ENSAYO DE DETECCIÓN ESPECTROFOMÉTRICO

1. Con lo que nos queda en los tubos vamos a centrifugar a 4000 r.p.m. durante 15 minutos y eliminaremos el sobrenadante.

2. Añadimos 2 ml de DMSO (dimetilsulfóxido), compuesto que rompe la pared celular de la levadura. Procedemos a su agitación en un Vortex durante 30 minutos.

3. Centrifugamos a 4000 r.p.m. durante 10 minutos para eliminar los restos celulares.

4. Cogemos el sobrenadante y lo echamos en un nuevo tubo a partir del cual leeremos la absorbancia a 460 nm frente a un blanco de DMSO.

5. Calcularemos la actividad respiratoria tras la exposición al tóxico, mediante el cociente de la absorbancia de la muestra y la absorbancia del control, expresado en tanto por ciento.

A.R (%)= Absorbancia460nm MUESTRA × 100

Absorbancia460nm CONTROL

RESULTADOS DEL ENSAYO MICROSCÓPICO

A.R (%)= nº células respiran/nº células totales en sol. ensayo×100

nº células respiran/nº células totales en sol. control

A.R.(%) =(126/280) × 100

(126/70)

A.R (%) = 25%

RESULTADOS DEL ENSAYO ESPECTROFOTOMÉTRICO