ANTECEDENTES.

El Laboratorio se realizan procedimientos analíticos para la vigilancia de factores de riesgo y eventos de interés en salud pública a través de los grupos de trabajo de Vigilancia del Ambiente y el Consumo y Vigilancia de Enfermedades, los diferentes procedimientos analíticos generan resultados que son base la para la realización de acciones en salud pública.

El Laboratorio de Salud Pública en busca del proceso de mejoramiento continúo esta desarrollando un sistema de aseguramiento de la calidad, operativizado a través del trabajo conjunto de todos los funcionarios, dentro de este proceso es pilar fundamental la validación de las técnicas analíticas de acuerdo con los requerimientos de la Norma Técnica Colombiana NTC ISO 17025, de tal suerte que las pruebas utilizadas cumplan con los diferentes requisitos establecidos para estas. Uno de los mecanismos para la monitorización de la eficiencia de estos procedimientos analíticos es la ESTANDARIZACION, etapa posterior a la validación de las técnicas. .

OBJETIVOS

• OBJETIVO GENERAL

Planear, diseñar y ejecutar la estandarización de las metodologías analíticas cuyo montaje ha sido realizado con anterioridad, que son el soporte de los resultados que se emiten en los distintos procedimientos analíticos de eventos de interés en salud pública

• OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Reconocer la reformación de los reactivos analíticos en el ámbito de la sociedad moderna, obviamente encaminado a enriquecer la forma de ver la química en las múltiples ramas de la ciencia.

• Cumplir con los parámetros de la asignatura y efectuar una depuración de los temas aseguir.

MARCO TEORICO

DEFINICION. La estandarización es ajustar un método analítico a determinadas normas y formas y comprende las siguientes etapas:

• 1. Montaje

• 2. Validación

• 3. Cálculo de atributos

• 4. Cartas de Control

1.- Montaje.

Es establecer un procedimiento analítico. Etapa de la estandarización mediante la cual se definen los atributos del método a ensayar, que incluye los siguientes pasos:

• • Procedimiento detallado de análisis, asimilación del método.

• • Verificación de equipos, reactivos y elementos de laboratorio.

• • Ensayo de respuesta o señal

• • Concentraciones más baja y más alta esperadas encontrar en la muestra

• • Ensayo preliminar de reproducibilidad.

2.- Validación.

La validación es un proceso netamente experimental, efectuada mediante estudios de laboratorio, que permite evaluar o determinar la conveniencia o capacidad de un esquema analítico particular, cuyas características de diseño cumplen con los requerimientos metodológicos y de resultados para la aplicación analítica propuesta; que involucra el desarrollo de un protocolo, que incluye la estimación de las medidas de precisión y exactitud aplicables a cualquier método analítico, esté o no normalizado.

3.-Cálculo de los atributos.

Son los que se derivan del proceso de validación, que identifican al método, dentro de los que podemos citar:

• & Límite de detección : mínima concentración detectable del analito que no puede cuantificarse

• & Límite de cuantificación : valor de la concentración a partir de la cual tiene significado cuantitativo

• & Exactitud :es el grado de proximidad entre una medida y el valor verdadero o esperado y está definido por la recuperación

• & Precisión : es el grado de proximidad entre resultados que se efectúan repetitivamente y en forma independiente y está relacionada con el coeficiente de variación

• & Sensibilidad: corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo.

• & Rango útil : rango de concentración comprendido entre el límite de cuantificación y el límite de liealidad ( máximo valor de la concentración a partir de la cual no tiene significado cuantitativo)

• 4.- Cartas de Control

Es el procedimiento interno que se realiza para verificar que el método validado cumple con los requisitos establecidos, permite llevar un registro diario del procedimiento, siempre que se haga una marcha analítica.

METODOS

A continuación se describe la metodología empleada en el proceso de estandarización:

Norma Guía

Se utiliza la norma GUIA ISO 5725, que fija las pautas para determinar la exactitud de un método de ensayo y sus resultados, tomando como referencia la REPETITIVIDAD Y REPRODUCIBILIDAD, que permite calcular la precisión y exactitud de un método estándar de medida.

METODOLOGÍA

• 1. ENSAYO PRELIMINAR DE REPRODUCIBILIDAD

Una vez que se tiene establecido el método de ensayo, cuya asimilación se ha llevado a cabo con detalles y se conoce la respuesta o señal que lo caracteriza, hay que definir:

• & Concentración máxima de interés, que se denomina C.

• & Se prepara una solución acuosa del patrón, en una concentración equivalente al 9 % C (0.09C) y otra del 90 % de C ( 0.9C)

• & Se preparan 10 réplicas del blanco, 10 réplicas de la concentración baja ( 0.09C) y 10 réplicas de la concentración alta (0.9C)

• & Se corren estas soluciones por el procedimiento analítico a ensayar

• & Se tabulan los datos de las concentraciones y la respectiva señal

• & Se grafican los datos anteriores, es decir : señal obtenida vs Concentración

• & Se calcula la ecuación correspondiente.

Mediante un programa establecido para la calibración de métodos analíticos denominado KALIBO, se calculan tanto la ecuación correspondiente, como los atributos definidos anteriormente, de donde se determina también el coeficiente de variación del método el cual se compara con la literatura. Este coeficiente de variación de acuerdo a la gráfica de HORWITZ, establece los valores que según las unidades de concentración del analito que se determine, fija las pautas para determinar la precisión del método.

• 2. INTERFERENCIA POR MATRIZ.

Una vez que se ha realizado el ensayo preliminar de reproducibilidad, es necesario verificar el comportamiento del analito en la muestra, o matriz de interés. Para ello se requiere:

Disponer de dos muestras M1 y M2, cuya concentración del analito sea lo más cercana a cero.

Adicionar estas muestras con el analito en las siguientes concentraciones: 0.4C y 0.7C, denominadas A1 y A2 respectivamente asi:

M1 + A1 = 0.4C

M2 + A2 = 0.7C

Preparar lo que se denomina un lote de soluciones, que consta de lo siguiente:

• & 2 Blancos denominados BK1 y BK2 ( soluciones sin analito)

• & 1 patrón de concentración 0.9C

• & 1 patrón de concentración 0.09C

• & 1 Muestra M1

• & 1 Muestra M2

• & 1 Muestra M1 + adición 0.4C

• & 1 Muestra M2 + adición 0.7 C

Se procesan estas soluciones por el procedimiento analítico a ensayar

Los datos obtenidos de la señal y la concentración se grafican y se determina la ecuación, por el mismo procedimiento que el ensayo de reproducibilidad,

Se compara la pendiente obtenida con la del ensayo de reproducibilidad:

Si son similares, se dice que el procedimiento analítico no presenta interferencia por matriz, es decir que el analito se comporta de la misma forma en la matriz de interés que en la solución acuosa.

• 3. VALIDACION

DISEÑO EXPERIMENTAL.

Una vez realizados los anteriores procedimientos, los cuales corresponden a la etapa de montaje, se entra de lleno a lo que se denomina la etapa de validación.

De acuerdo a la metodología adoptada por el INSTITUTO NACIONAL DE SALUD (INS), la mínima cantidad de soluciones a analizar que conforman el diseño experimental son 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada uno. Si el analito es estable, todas las soluciones pueden prepararse el mismo día, que una vez codificadas en forma aleatoria debe entregarse un lote para ser procesado diariamente y en forma consecutiva por el analista. Si el analito no es estable, se realiza el mismo procedimiento, pero cada lote debe prepararse diariamente hasta completar el total de soluciones que conforman el set.

Una vez que se procesan la totalidad de las muestras que conforman el set, se descodifican las soluciones por parte del Referente de Validación en presencia del analista responsable. Los datos de concentraciones y la respectiva señal de cada una de las soluciones analizadas se registran en la tabla de captura de datos, para su tratamiento estadístico.

De acuerdo a la Norma Guia ISO 5725, dentro de cada lote solamente los blancos se repiten, por lo tanto se habla de repetitividad dentro del lote (r) y además se reproducen entre los seis lotes o sea que se cumplen condiciones de reproducibilidad ( R). Las demás soluciones solamente cumplen condiciones de reproducibilidad.

Los datos obtenidos expresados en unidades de concentración, son sometidos a tratamiento estadístico, para verificar condiciones de repetitividad y reproducibilidad mediante el análisis de varianzas y desviaciones estándar entre lotes y dentro de los lotes, cuya desviación estándar total elevada al cuadrado, o sea la varianza, se comparan con los límites de confianza establecidos.

Cuando los datos analizados se encuentran dentro de los rangos permisibles se dice que se han alcanzado las metas en cuanto a precisión.

De otra parte, se hace la diferencia entre las concentraciones de las muestras adicionadas ( M1 + A1 ) y ( M2 + A2 ), de las respectivas muestras sin adicionar M1 y M2, el resultado se conoce como la recuperación real, el que se compara con la recuperación teórica esperada. Si el valor obtenido está dentro del rango del 95 al 105 %, se dice que el método de ensayo tiene una recuperación satisfactoria. ( exactitud)

Cuando el método de ensayo ha alcanzado las metas en cuanto a precisión y a exactitud, se dice que el método ha sido validado

• 4. ATRIBUTOS FINALES

Con los datos de las señales y las correspondientes concentraciones se construye la función lineal final, que por el programa KALIBO nos permite calcular de nuevo los atributos finales del método, definidos en el ensayo de reproducibilidad.

Cuando el método validado, presenta los atributos finales, se dice que ha sido estandarizado.

• 5. CONTROL INTERNO.

Para monitorear el método estandarizado se elaboran lo que se denominan las cartas de control, donde una muestra o un patrón son sometidos a 20 ensayos repetitivos , cuyos datos se tabulan y se calculan el valor medio y la desviación estándar. Se establecen unos límites de confianza del valor medio más dos desviaciones estándar y el valor medio menos dos desviaciones estándar, denominados límites superior e inferior. Una vez se realice una marcha analítica, se corre de la misma forma la muestra o patrón con la que se elaboraron los límites y se registra el dato obtenido. Los datos obtenidos deben presentar una distribución normal alrededor de la media. Cuando cinco datos consecutivos presentan tendencia ascendente o descendente alrededor de la media, significa que los datos que se obtengan al utilizar este control en la sexta lectura no podrán reportarse, obligando a revisar la metodología de análisis.

RESULTADOS

ATRIBUTOS DE LAS METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS

METODOS CUANTITATIVOS

CONCLUSIONES

1.- Todas las Metodologías sometidas al proceso de estandarización, cuyo montaje había sido realizado con anterioridad , donde la experiencia de los profesionales en cada procedimiento analítico era comprobada, fueron factores preponderantes para llevar sin tropiezos el proceso de estandarización.

2.- Todos los equipos del Laboratorio de Salud Pública empleados en las distintas marchas analíticas presentaron respuesta satisfactoria en todas las etapas del proceso, gracias al servicio de mantenimiento preventivo y correctivo establecido.

3.- La evidencia científica permite determinar la alta confiabilidad de los procesos analíticos del LSP, y por ende la seguridad para la generación de intervenciones sanitarias.

4.- La metodología aplicada para validación evidenció resultados prácticos acordes con los diseños teóricos.

5.- A pesar de la aparente dificultad metodológica del proceso de validación, la experiencia práctica del Laboratorio de Salud Pública demuestra la posibilidad de aplicar esta metodología en todos los laboratorios de nuestro país.

6.- La experiencia de validación de técnicas analíticas en Laboratorio de Salud Pública prueba que el proceso de validación se puede realizar paralelamente con el trabajo rutinario analítico del laboratorio, sin el requerimiento de dedicación exclusiva

RECOMENDACIONES

1.- Expandir el proceso de validación de técnicas analíticas a los laboratorios de salud pública del país y a los laboratorios de análisis en general.

2.- Iniciar los procesos de validación de grandes laboratorios por las técnicas de mayor relevancia para la salud pública en general o para el proceso analítico en particular.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Instituto Nacional de Salud. Curso de Capacitación en Validación de Metodologías Analíticas, Jaime Ortiz Barón

Norma Técnica Colombiana NTC/ ISO 5725

AOAC, Asociation of Official Analytical Chemists, 15 edición, 1990.

CODEX ALIMENTARIUS, edición 1999.