Caso 8: DNA FINGERPRINT.

INDICE

Introducción

En este caso vimos como podemos usar las técnicas de PCR o de Southern Blot en el campo de la criminología como también en pruebas de paternidad.

El DNA Fingerprint es una técnica utilizada para saber si una muestra de DNA pertenece a cierta persona. Al igual que una huella digital el DNA de cada persona es único, o mejor dicho, la secuencia de los pares de bases del DNA es única para cada persona. Científicos son capaces de identificar a una persona solamente por el ordenamiento de los pares de bases de su DNA. El DNA Fingerprint es usado en casos de paternidad y maternidad para identificar a los padres de un niño. Otra aplicación es en la medicina forense en casos de identificación de víctimas y establecer la inocencia o culpabilidad de los sospechosos. Y una tercera aplicación sería como identificación personal, pero por el momento el Fingerprint es muy complejo y costoso para usarse como identificación personal.

El DNA Fingerprint requiere la utilización de otras técnicas. El Southern blot es utilizado para el Fingerprint ya que con el uso de una sonda radioactiva es posible identificar fragmentos de una secuencia de DNA. Otra técnica usada es el PCR. Con esta técnica es posible amplificar el DNA de una pequeña muestra. El PCR es una técnica necesaria para casos criminales ya que el DNA encontrado en la escena del crimen generalmente no es suficiente para poder trabajar con él.

Caso 10

Juan sobrevivió al síndrome de Li-Fraummeni, pero desgraciadamente fue encontrado asesinado en su departamento.
Muestras de sangre fueron halladas sobre el sofá y al parecer Juan prestó una feroz resistencia antes de ser asesinado. Se sospecha de "un amigo" con el cual mantenía relaciones.
El amigo es arraigado en el hotel "EMIS" localizado en la avenida Colón y ahí se le pide una toma de sangre.
Por ley tú tienes que explicarle con lujo de detalle a este "amigo" que es lo que vas hacer con su sangre.
Le explicas muy generalmente que le vas a practicar un "DNA Fingerprint".
Como vas de prisa le dices que mañana le explicarás con más detalle en que consiste esta nueva tecnología (en México).

TERMINOLOGIA

• DNA Fingerprint.

El patrón único de fragmentos de DNA identificados por hibridización southern (utilizando una sonda que se une a una región polimórfica de DNA) o por reacción en cadena de la polimerasa (utilizando iniciadores - primers- que flanquean la región polimórfica).

IDENTIFICACION DEL PROBLEMA

JERARQUIZACIÓN DEL PROBLEMA

HIPOTESIS

La muestra encontrada en el cuarto se usará como prueba para ver si la muestra del amigo de Juan es la misma y determinar si “el amigo” fue el que asesinó a Juan. La técnica de DNA fingerprint es la que nos va a decir si las 2 muestras coinciden.

OBJETIVOS

ESTUDIO

Organización cromosómica y DNA no codificador

Quizá más del 90% no codifica precursores de mRNA. En organismos multicelulares este DNA contiene regiones muy similares pero no idénticas las variaciones de este DNA repetido son tan grandes que es posible distinguir a cada persona por sus “huellas dactilares” de su DNA.

Las regiones codificantes, es decir, los genes se encuentran entre estas secuencias.

Un gen lo podemos definir como una secuencia completa de ácidos nucleicos necesarios para la síntesis de un polipéptido funcional.

Las regiones codificadoras que solo se representan una vez en el genoma haploide se llaman genes solitarios y abarcan de un 25 50% de los genes.

El DNA a menudo contiene secuencias que son copias parecidas pero inexactas del gen estas se denominan genes codificadores de proteína duplicados que constituyen cerca del 50% de las secuencias codificadoras.

Estas secuencias dan origen a las familias de genes que son genes duplicados que codifican secuencias similares pero no idénticas por lo tanto dan origen a familias de proteínas con estructuras similares así como sus funciones.

Una variación a este tipo de secuencias duplicadas son los seudogenes sólo que son secuencias no codificantes.

Los genes codificadores de mRNA, tRNA e histonas pertenecen a secuencias dispuestas en tandem es decir aparecen una después de otra, estas a diferencia de las duplicaciones son repeticiones idénticas.

Otras clases de secuencias repetidas de DNA que en base a su desnaturalización y velocidad de reintegración se clasificaron en 3:

De baja velocidad que abarca del 50 a 60 % de DNA no codificante y es de copia única se le llama puesto que no tiene función importante DNA espaciador.

De velocidad intermedia o repeticiones intermedias son el 25 a 40 % del DNA son secuencias complejas que se pueden copiar y reinsertar en nuevos sitios del genoma se les llama elementos móviles del DNA.

De velocidad muy grande alrededor de un 10 a 15% del DNA que son secuencias repetitivas muy cortas de 5 a 10 pares en largas disposiciones en tandem estas por lo general se encuentran cerca de los centrómeros y de los telomeros.

Estas secuencias están muy conservadas en cada especie mas no su numero de repeticiones a causa de entrecruzamientos no equitativos, esto es lo que hace las llamadas “fingerprints”.

Southern Blot

El Southern Blot recibe su nombre de Edward M. Southern quién desarrollo la técnica, en 1970, para localizar secuencias de DNA especificas. Los pasos para realizar un Southern blot se muestran a continuación.

1.- El primer paso es aislar el DNA del núcleo, ya sea usando detergentes para eliminar el resto del material del núcleo, o aplicando presión para forzar el DNA a que salga.

2.- El segundo paso es cortar el DNA en cadenas cortas. Esto sea hace usando enzimas de restricción.

3.- El tercer paso consiste en separar las cadenas por tamaño. El proceso usado es la electroforesis de gel. El DNA es puesto en un gel, como el de agarosa, y una carga eléctrica es aplicada al gel, con el polo negativo arriba y el positivo abajo. El DNA tiene carga negativa por lo que se moverá hacia abajo, pero las cadenas más pequeñas se moverán con mayor rapidez que las grandes.

4.- El cuarto paso es desnaturalizar el DNA en el gel usando calor ó químicos.

5.- El quinto y último paso consiste en copiar el DNA del gel a un papel de nitrocelulosa. Una vez que el DNA se adhiera permanentemente a este papel, el Southern blot ya está terminado.

Para analizar el Southern blot, se usa una sonda de DNA radioactiva. Una sonda es un fragmento de DNA o de RNA que se aparea con una cadena complementaria en el Southern blot. Después de esta reacción de hibridación se toma un X-Ray del Southern blot y solamente en dónde se haya unido la sonda aparecerá en el film.

Northern Blot

El Northern blot es una técnica para localizar secuencias específicas de RNA. Debido a que la técnica para localizar secuencias de DNA se llamó Southern blot, los científicos que usaban la técnica de RNA la llamaron Northern blot. Procedimiento usado por el Northern blot es exactamente el mismo que el del Southern blot, con la diferencia de que el Northern blot busca secuencias en el RNA en vez del DNA.

Electroforesis convencional

La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas de elevado peso molecular de interés biológico y bioquímico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. Esta será la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas, controlando así su migración uniforme.
Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza, caracterización, cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y RNA.
Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no solo reprimen la convección sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes. En cambio los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. De este modo la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis, que separa por la relación carga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida.
La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que gracias a su poder de gelificación y propiedades físico-químicas, lo han convertido en el soporte más común para electroforesis en el área de Biología Molecular. La poiliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N,N´ metilenbisacrilamida. La concentración de ambos reactivos define el grado de reticulación del gel.
Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamente libres de cargas iónicas. Esto es importante para evitar que la disolución tampón se desplace por el gel cuando se active el campo eléctrico.
A continuación se ofrece un esquema con los aditamentos necesarios para realizar esta técnica de separación:
Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnológica, aspecto este que se ha podido comprobar a partir de los numerosos resultados que se encuentran en la literatura más actual.
Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa, electroforesis en campo pulsado y la electroforesis preparativa. Estas técnicas no son de aplicación tan general pero no por ello dejan de ser importantes.

Electroforesis Capilar (CE)

La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. Esta afirmación no nos permite aumentar el potencial, aun sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el campo eléctrico. Esto se debe a que el calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la calidad de la separación. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. Esta técnica está representada en el siguiente esquema:
El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias.
Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el orden de los µL, con una elevada resolución y rapidez. Ofrece además mayor facilidad y velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora los principios de la automatización a través de un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado, aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se pueden utilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un electroferograma con picos característicos de cada compuesto separado. En realidad ambas técnicas son complementarias al basarse en mecanismos de separación diferentes.

Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar:
La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. Permite la separación en función de la migración electroforética y también en función del peso molecular de las muestras. Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampón donde ocurre la separación. Estos geles están contenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son también de agarosa y poliacrilamida.
Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la separación de los analitos según la relación carga/tamaño.
En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Su principal inconveniente es que no permite separar los compuestos neutros.
Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se aprovecha para separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este método se basa en establecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel. Este gradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que migran por sí mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. Cuando al gradiente de pH se le introduce una proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica, generando una separación isoeléctrica conocida como electroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de la velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder o guía en un extremo. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a separar. Luego se introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola, cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la muestra. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos los componentes de la muestra.
En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zona adyacente. Esta característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Se requiere usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica.
La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde se reúnen algunas de las mejores características de cada técnica por separado, por lo que tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la electrocromatografía capilar puede usarse para la separación de especies no cargadas. Proporciona una elevada eficacia en las separaciones de microvolúmenes de disolución de muestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta presión.
En la electrocromatografía capilar la fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria por el bombeo ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo mecánico, lo que simplifica significativamente el equipo.
Se diferencian dos tipos de electrocromatografía capilar:

• Electrocromatografía rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo electroosmótico a través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase inversa. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno.

• Cromatografía capilar electrocinética micelar. Esta técnica requiere la utilización de un tensoactivo en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Estas micelas son capaces de alojar compuestos no polares en su interior. La interacción de las micelas y los solutos es la que produce la separación.

En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicas ampliamente utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica. Muestra de ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se encuentra en la literatura especializada.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación.

PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Sus siglas en español significan “Reacción en cadena de la polimerasa” y es una técnica realizada “In Vitro” utilizada en Biología Molecular para a partir de un fragmento de ADN, sintetizar miles y/o millones de estos.

Para poder hacer esto, se necesita:

La técnica PCR para sintetizar las miles de cadenas de ADN se divide en 2 ciclos:

• El primer ciclo de síntesis producirá nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los primers. Este tipo de productos se irá acumulando de forma geométrica, con cada ciclo de síntesis, utilizando como moldes las moléculas de ADN parental de la reacción.

• Durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a su vez como moldes, generándose en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del fragmento que engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirán de molde a su vez para sucesivos ciclos de síntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulando de forma exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrán aparecido

El termociclador hace los cambios de temperatura y logra las 3 fases:

Durante la primera, desnaturalización el fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 92º a 96 ºC; esto provoca la separación de las dos cadenas. En la segunda fase, llamada hibridación, la temperatura de la mezcla se rebaja hasta 40-60 ºC para que los cebadores se enlacen con el ADN escindido. En la tercera fase de extensión o polimerización, la temperatura de la mezcla se eleva hasta 72°C para la extensión, una enzima la Taq DNA polimerasa la cual es termoestable y es la que en buena cuenta ha permitido la mejoría del proceso PCR en una forma relativamente sencilla, copie rápidamente la molécula de ADN.

Estas tres fases constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos o tres minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN.

La técnica de PCR tiene varias aplicaciones actualmente, se usa en la secuenciación, en estudios evolutivos y para el ADN “fingerprint”.

Conclusión

Después de haber analizado el caso se puede llegar a la conclusión de lo que es el DNA Fingerprint o huella genética.

Esta técnica es muy importante básicamente para dos cosas, para el campo forense y para comprobar la paternidad de una persona. Esto se logra mediante dos técnicas mas comunes y que han sido utilizadas en México, conocidas como Southern Blot y Reacción en Cadena Polimerasa(PCR).

Como se vio anteriormente el Southern Blot es un proceso mas laborioso y con menor precisión que el PCR, por lo que actualmente alrededor del mundo se utiliza mas el PCR, ya que además de ser un proceso rápido y exacto, permite analizar muestras parcialmente degradadas o impuras como cabello, saliva, hueso y semen.

Estas técnicas han producido un gran avance en materia forense, ya que permiten analizar evidencias con una mayor facilidad y exactitud, además gracias al PCR se pueden sacar datos de muestras mínimas.

El DNA Fingerprint ha sido, en general, un gran avance para la medicina y para la ciencia en general, es una técnica que parece sencilla, pero que es asombrosa y que de seguro en su tiempo de descubrimiento causo gran revuelo como lo esta haciendo ahora el genoma humano.

Referencias.

http://www.bioxamara.tuportal.com/diccionario.htm

www.uprm.edu/biology/cursos/genetica/pcr.htm

www.biomedicina.ucse.edu.ar/docencia1.htm

http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/index.html

http://www.biology.washington.edu/fingerprint/blot.html

“Química orgánica”

William d. stansfield

Mc Graw Hill

Tercera edición

Páginas 335 - 339

“Biología Celular y Molecular”

Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S.Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James.

Capítulo 7 “DNA recombinante y genómico”; parte 7.7 “Reacción en cadena de la polimerasa: una alternativa a la clonación”; páginas 246-247.

18