PRACTICA 1: PIPETEAR

Material:

Prepipeta.

Pipeta graduada.

Vaso de precipitado.

Agua.

Técnica:

En el vaso de precipitado se llena con una cantidad suficiente de agua.

Con la pipeta, limpia y seca, se coloca la prepipeta en la parte superior de la pipeta.

Se mueve la rueda que se encuentra en la prepipeta, con la que conseguiremos que se llene de agua la pipeta.

Si al llenar la pipeta nos hemos sobrepasado en la cantidad de agua deseada, movemos de nuevo la rueda de la prepipeta y así conseguiremos enrasar la cantidad deseada.

Para enrasar debemos de colocar a la altura de los ojos la pipeta para que no se produzca ningún error en la medición.

Acabado el pipeteo, después de haber realizado varias repeticiones, limpiamos el material y lo colocamos en su lugar correspondiente.

PRACTICA 2: PESAR. BALANZA GRANATORIO

Material

Balanza Granatorio.

Pesas.

Portaobjetos (material a pesar)

Técnica:

Antes de comenzar la practica, hay que asegurarse de que la balanza esta en reposo.

En uno de los platillos se coloca el portaobjetos y en el otro platillo se van colocando poco a poco las pesas.

Para comprobar si se necesitan o no mas pesas de las ya puestas, se baja la palanca para que los platillos suban.

Si la balanza no esta equilibrada se vuelve a poner en reposo y se ponen o se quitan pesas, dependiendo del lado al que se incline la balanza.

Así se sigue hasta que se equilibre la balanza.

Si por el contrario la balanza se encuentra equilibrada se vuelve a poner en reposo y se cuentan las pesas utilizadas para saber los gramos necesitados para que la balanza se esté en equilibrio.

PRÁCTICA III: PREPARACIÓN DE UNA DISOLUCIÓN

1. Introducción

Las disoluciones son mezclas homogéneas. Las disoluciones binarias tienen dos componentes: disolvente (el mayoritario o el que da aspecto a la disolución) y soluto (el minoritario). Las disoluciones más frecuentes son aquellas cuyo disolvente es el agua, llamadas disoluciones acuosas.

2. Material

- pipetas

- matraces aforados

- balanza electrónica

- vidrio de reloj

- varilla de vidrio

- frasco lavador

- espátula

3. Procedimiento

Preparación de una disolución a partir de un soluto sólido

El primer paso es pesar la cantidad necesaria de soluto. Pero antes de pesar debemos asegurarnos que el fiel de la balanza marque cero. En caso contrario, se ajustará. Las sustancias a pesar nunca se echan directamente sobre los platillos, sino sobre papel de filtro o un vidrio de reloj, que deben encontrarse escrupulosamente limpios y secos. Para sacar el sólido del recipiente que lo contiene utilizaremos una espátula perfectamente limpia y seca.

Una vez pesado se pone en un vaso de precipitados con la menor cantidad posible de agua destilada (enjuagar con agua destilada el vidrio de reloj echando este agua en el vaso). Se disuelve agitando con una varilla de vidrio y se vierte en el matraz aforado. Enjuagamos con agua destilada el vaso y echamos este agua al matraz aforado. Se añadirá agua con el frasco lavador hasta que el nivel haya subido casi hasta el cuello del matraz, pero no dentro del mismo. A continuación se agita de modo que el líquido se mezcle bien. Se sigue añadiendo agua hasta que falte como un centímetro, para la marca de enrase. Por último, con un gotero y gota a gota, el matraz se llena de agua destilada hasta el enrase. El enrase se considera bien realizado cuando el menisco que forma el líquido queda tangente, por encima, a la marca de enrase.

Preparación de una disolución a partir de una disolución de ácido concentrado comercial

Con un frasco lavador llenamos de agua destilada la mitad del matraz aforado. Utilizando una pipeta graduada con un émbolo o una bureta se toma la cantidad necesaria del ácido concentrado comercial, que se vierte en el matraz aforado. A continuación, se agita para que el líquido se mezcle bien y se vuelve a añadir agua hasta que el nivel suba casi al cuello del matraz, pero no dentro del mismo. Se agita nuevamente para mezclar bien. Se sigue añadiendo agua hasta que falte como un centímetro, para la marca de enrase. Por último, con un gotero y gota a gota, el matraz se llena de agua destilada hasta el enrase. El enrase se considera bien realizado cuando el menisco que forma el líquido queda tangente, por encima, a la marca de enrase.

Primer ejercicio

Disolución de 10 ml: Patrón colorante azul

Dilución:

Tubo 1	Tubo 2	Tubo 3	Tubo 4	Tubo 5
1/2	1/4	1/8	1/16	1/32

Cogemos 5ml de colorante azul (1/2 de 10 ml=5ml) con la pipeta. Enrasamos con agua hasta llegar a 10 ml. Todo esto en el tubo 1.

Ahora pasamos al tubo 2. hallamos la dilución que debemos hacer en este tubo:

1/2 * X=1/4, X=1/2

Esto quiere decir que debemos coger 5ml del tubo 1(lo hacemos de esta forma porque son diluciones seriadas). Enrasamos con agua hasta llegar a 10 ml.

Igual que anteriormente:

1/4 * X= 1/8 , X=1/2

Luego cogemos 1/2 del tubo 2, que son 5 ml. Enrasamos con agua hasta 10 ml.

1/6 = 1/8 * X, X=1/2 . Pipeteamos 5 ml del tubo 3. Enrasamos con agua hasta 10 ml

Y finalmente cogemos 5ml del tubo 4 y lo echamos en el 5. Luego enrasamos con agua hasta 10 ml.

PRACTICA IV: DETERMINACIÓN DEL HEMATOCRITO (Microhematocrito)

Fundamento

Esta determinación se basa en la mayor densidad de los hematíes con respecto a los demás componentes de la sangre.

Por esto cuando los hematíes sedimentan en el fondo del tubo se puede ver el volumen que éstos ocupan con respecto al volumen total. Para acelerar el proceso de sedimentación utilizaremos una centrífuga.

Material.

• Alcohol

• Algodón

• Plastilina

• Lanceta

• Centrífuga para hematocrito

• Lector de microhematocrito o regla milimetrada

Técnica

Marcaremos dos tubos capilares con anticoagulante (EDTA).

Informamos al paciente de la técnica y procedemos a desinfectar la zona a pinchar, normalmente la yema de los dedos. También podremos coger la sangre de una muestra de sangre con anticoagulante

Llenamos cada capilar con sangre del punto de punción o de la muestra. Llenamos las ¾ partes del capilar y sin burbujas.

Sellaremos los extremos por los que hemos llenado los capilares con plastilina.

Luego los colocamos en la centrífuga con el extremo sellado hacia fuera. También hemos de colocarlos de manera que queden equilibrados. Se centrífuga durante 5 minutos.

Al pasar este tiempo observamos que los elementos corpusculares de la sangre están en la parte inferior del tubo.

Resultado

Tras todo el proceso la sangre muestra un hematocrito del 43% ( 4.3. 1012 hematíes/l) cantidad que esta dentro de los valores normales.(Mujer: 42+- 5%)

PRÁCTICA 5: VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR

Fundamento

Es la velocidad a la que sedimentan los elementos formes de la sangre, en una unidad de tiempo de una muestra de sangre anticoagulada.

Si se coloca en un tubo con sangre anticoagulada en posición vertical y se queda en reposo, se observa que pasado un tiempo, las células sedimentan quedando dos fases: la superior al plasma, y la inferior a las células. La velocidad se expresa con un número que indica los mm que la columna de células ha descendido durante un periodo de tiempo que suele ser una hora.

Material

• Pipeta de vidrio

• Pipeta de Westergreen desechable

• Soporte

• Papel para limpiar la pipeta

• Sangre entera

• Anticoagulante citrato sódico al 3,8%

• Guantes

Técnica

Homogeneizar la muestra

Colocar citrato sódico (0,4ml) en un bote al 3,8%

Añadir 1,6ml de sangre con la pipeta de vidrio y mezclarlo bien

Colocar este tubo en el soporte y en el tubo metemos la pipeta de westergreen desechable y aspiramos con el aspirador hasta la señal del tapón

Dejarlo a temperatura ambiente totalmente vertical y protegerlo de la luz directa y de las vibraciones

Dejar pasar una hora. Al cabo de este tiempo se mira cuanto han descendido los elementos formes.

Resultado

El resultado no es significativo ya que han pasado 24 horas desde q se hizo la técnica. El resultado es de 9mm

PRACTICA 6: TECNICA DEL MANEJO DEL MICROSCOPIO

Material:

Microscopio óptico

Papel milimetrado

Rotuladores de colores: Rojo, Negro, Amarillo, Verde y Azul.

Portaobjetos

Técnica:

En el papel milimetrado dibujamos un cuadrado de 1 mm2.

Este cuadro lo dividimos en tres partes iguales en cada lado.

Cada cuadro secundario lo pintamos de un color; el cuadro central deberá esta coloreado de negro.

Recortaremos el cuadro de 1 mm2 y lo pegamos en un portaobjetos con cinta celo.

Lo situamos en el microscopio y comenzamos a observar los cuadros según la hoja inicial y a medir la superficie de cada cuadro.

Resultados:

Objetivo de 4x:

- Diámetro: Horizontal: 131 + 0,4 =131,4 mm

Vertical: 11 + 0,5 = 11,5 mm

Objetivo de 10x:

- Diámetro: Horizontal: 132 + 0,1 =132,1 mm

Vertical: 11 + 0,4 = 11,4 mm

VERDE Horizontal: 132 + 0,1 = 132,1 mm

Vertical: 11 + 1 = 12 mm

ROJO Horizontal: 133 + 0,3 = 133,3 mm

Vertical: 13 + 0,2 = 13,2 mm

AMARILLO Horizontal: 130 + 0,8 = 130,8 mm

Vertical: 13 + 0,3 = 13,3 mm

AZUL *Horizontal: 130 + 0,8 = 130,8 mm

*Vertical: 11 + 0,3 = 11,3 mm

NEGRO *Horizontal: 131 + 0,2 = 131,2 mm

*Vertical: 12 + 0,3 = 12,3 mm

Objetivo de 40x:

El diámetro real del campo es menor de 1 mm.

PRACTICA 7: SUSPENSION DE HEMATIES

Material:

Tubos cónicos para centrifuga

Pipetas Pasteur

Varilla de vidrio

Embudo

Frasco lavador de plástico

Gradillas

Vaso de precipitado

Espátula

Matraz aforado con tapón

Micro pipeta automática

Vidrio de reloj

Parafilm

Balanza electrónica

Sangre entera

Cloruro sódico + agua destilada (suero fisiológico)

Preparación del suero fisiológico:

Preparamos una disolución de suero al 9%. Haremos 0´5 L de disolución.

Pesamos 4´5 g de NaCl en la balanza, sobre el vidrio de reloj:

100 ml --------------- 9g

500 ml ---------------- x , X= 4´5 g

Echamos los 4´5 g en un vaso de precipitado y mezclamos con un poco de agua destilada. Vertemos la mezcla en un matraz aforado de 0´5 L, aclaramos el vaso de precipitado con agua, para asegurarnos que todo el soluto ha sido vertido al matraz. Ahora enrasamos con agua destilada. Para mayor precisión en el enrase, una vez estemos cerca de la línea de enrase, terminaremos echando gota a gota el agua destilada hasta la línea de enrase. Mezclamos y etiquetamos la disolución.

Técnica:

En un tubo de ensayo, echamos una parte de sangre y 4 de suero (hay que echarlo poco a poco, ya que se pueden romper los hematíes)

Tapamos con parafilm el tubo de ensayo y centrifugamos 3 minutos a 3000 r.p.m para proceder al lavado de hematíes. Una vez centrifugados los glóbulos rojos, con una pipeta pasteur desechamos el sobrenadante.

Realizamos el lavado tantas veces como sea necesario hasta obtener un sobrenadante limpio(transparente)

una vez conseguido, haremos una suspensión de hematíes de 5 ml al 10%

100 ------------ 5

10 ------------ x , x= 0´5 ml de GR lavados

PRACTICA 8: RECUENTO DE GR

Introducción

Los recuentos celulares sanguíneos son una determinación fundamental en hematología, los más habituales son: recuentos de GR, GB y plaquetas, aunque también se realizan recuentos más específicos como por ejemplo el recuento de eosinófilos y reticulocitos. También se pueden hacer recuentos en otros líquidos biológicos como el LCR, sinovial, pleural…

Cualquier método de recuento de células lleva consigo 4 fases:

Dilución de la sangre: se puede hacer en cualquier otro liquido biológico

Toma de un volumen determinado de sangre diluida

Recuento de las células en ese volumen

Cálculo matemático, para saber el numero de células por volumen

Material

• Cámara de recuento de glóbulos (Nuebauer)

• Pipeta de dilución de GR

• Papel de filtro

• Sangre entera

• Liquido diluyente (Hayem)

• Tubo aspirador

• Cubreobjetos

• Microscopio

Técnica

Homogeneizar la muestra de sangre

Montar la cámara con su correspondiente cubreobjetos

Mediante el tubo aspirador y la pipeta de dilución, cogemos sangre hasta la señal de 0,5 con la pipeta de glóbulos rojos.

Se limpiará por fuera la pipeta, a continuación, se coge el liquido diluyente (liquido de Hayem) y se enrasará hasta la marca de 101.

Homogeneizamos el contenido del bulbo sujetando la pipeta con el dedo índice y pulgar, y agitamos suavemente durante 2 ó 3 minutos.

Antes de llenar la cámara hay que desechar las 3 ó 4 primeras gotas que corresponden al capilar inferior, ya que es líquido diluyente.

Llenada la cámara, dejamos que por capilaridad se llene la cuadricula, evitando la formación de burbujas y rebosamiento de la muestra fuera de los bordes.

Una vez llenada la cámara, dejamos reposar 3 ó 4 minutos para que sedimenten las células.

Una vez que hayan sedimentado, nos vamos al microscopio, enfocamos el retículo de la cámara con el objetivo de 10x, para comprobar la distribución homogénea de la muestra.

Si está distribuido bien, pasamos al objetivo de 40x y empezamos a contar las células

Una vez contadas las células se realizan los cálculos pertinentes para saber el número de células totales que hay en la cámara de Nuebauer.

Cálculos

Nº células /mm3 = Nº células contadas x Corrección del volumen x Corrección de la dilución

Numero de células contadas ! 45+ 70+ 42+ 53+ 67= 277

277 * 1/0,02 * 200= 2.770.000 GR

Interpretación resultados

Valores normales: 4,5 *10^12/L

En nuestro caso, al utilizar sangre envejecida no sale un resultado correcto

PRACTICA 9: RECUENTO GLOBULOS BLANCOS

Material

• Cámara de recuento (Nuebauer)

• Pipeta de dilución de glóbulos blancos

• Papel de filtro

• Sangre entera

• Liquido diluyente (Trk)

• Tubo aspirador

• Cubreobjetos

• Microscopio

Técnica

Homogenizar la muestra de sangre

Montar la cámara con su correspondiente cubreobjetos

Mediante el tubo aspirador y la pipeta de dilución, cogemos sangre hasta la señal de 0,5.

Se limpia por fuera la pipeta, se coge el liquido de Trk y se enrasa hasta 11

Homogeneizamos el contenido del bulbo sujetando la pipeta con el dedo índice y pulgar, y agitamos suavemente durante 2 ó 3 minutos

Antes de llenar la cámara hay que desechar las 3 ó 4 primeras gotas que corresponden al capilar inferior, ya que es líquido diluyente.

Llenada la cámara, dejamos que por capilaridad se llene la cuadricula.

Una vez llenada la cámara, dejamos reposar 3 ó 4 minutos para que sedimenten las células.

Una vez sedimentadas, nos vamos al microscopio, enfocamos el retículo de la cámara con el objetivo de 10x, para comprobar la distribución homogénea de la muestra.

Si está bien distribuido, pasamos al objetivo de 40x y empezamos a contar las células

Una vez contadas las células se realizan los cálculos necesarios para saber el número total de células.

PRACTICA 10: FROTIS SANGUINEO

Fundamento

La práctica de un frotis sanguíneo también llamado extensión es de gran importancia en hematología ya que el diagnóstico de muchas enfermedades hematológicas puede realizarse con solo observar las características morfológicas de las células sanguíneas Debido a ello la técnica de realización del frotis tiene que ser impecable procurando que este no sea excesivamente fino ni excesivamente grueso. Con ello se conseguirá una distribución adecuada de las células en las diferentes áreas del frotis cuyo conocimiento es fundamental tanto para la observación de la morfología eritrocitaria como para la realización de la fórmula leucocitaria o recuento diferencial de leucocitos.

Existen 3 procedimientos para realizar el frotis sanguíneo:

Método de los 2 portaobjetos o portas

Método de los 2 cubreobjetos

Método automático mediante extensor de frotis por centrifugación.

En cualquiera de estos métodos se tendrán en cuenta las siguientes precauciones:

1- Todo el material que hay que utilizar tiene que estar escrupulosamente limpios y desengrasados.

2·- Si se parte de punción digital no se debe utilizar nunca la primera gota.

3·- Si se parte de punción venosa el frotis deberá hacerse con la máxima rapidez posible con sangre no tratada con anticoagulante. En caso de tenerlo que realizar con anticoagulante será el EDTA potásico, debido a su escasa acción sobre la morfología de las células sanguíneas. El frotis debe ser realizado siempre dentro de las 2 primeras horas de practicada la extracción ya que si no es así el efecto del anticoagulante sobre los leucocitos producen hinchamiento nuclear con falso aumento del número de neutrófilos no segmentados, vacuolización citoplasmática y aparición de diversos artefactos.

En las extensiones de sangre sobre portas diferenciamos una cabeza, un cuerpo y una cola:

• la cabeza es la línea en la cual hemos apoyado un portaobjetos sobre todo antes de hacer la extensión. Es una zona excesivamente gruesa y en ella se aprecia un aumento de los linfocitos.

• El cuerpo representa la mayor parte de la extensión, corresponde a al región intermedia del frotis y en ella existe un reparto equilibrado de las células. Es la zona ideal para hacer el recuento diferencial.

• La cola es una excesivamente fina. Corresponde al final de la extensión y termina con un área donde las células adoptan una disposición acordonada que se conoce como flecos o barbas. En esta región existe un exceso de granulocitos y monocitos.

Limpieza del material: los portas sucios pueden limpiarse sumergiéndolos durante 24 horas en mezcla crómico (100 gr. de dicromato potásico disuelto en 750 ml de agua a la cual se le ha añadido con cuidado 250 ml de sulfúrico concentrado) trascurrido este tiempo se lavan los portas con agua corriente y se enjuagan con agua destilada y se guardan en alcohol del 95% o en una mezcla de alcohol-éter. Antes de utilizarlos se secan y se frotan con un paño limpio

Material

1) Porta objetos

2) Alcohol

3) Sangre entera

4) Porta extensor

5) Pipetas pasteur

Técnica de los dos portas

Para conseguir una buena extensión de sangre es imprescindible utilizar portaobjetos limpios, secos y desengrasados. Estos portas se utilizan siempre cogiéndolos por los bordes

1. Poner un portaobjetos limpio y seco sobre una superficie horizontal

2. Depositar una gota de sangre de 5 microlitros de no más de 3mm de diámetro. La gota se sitúa sobre la línea central del porta aproximadamente a 1cm de uno de sus extremos. Este portaobjetos se sitúa con la gota a la derecha y se sujeta por el extremo opuesto con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda.

3. Para extender la sangre se utiliza otro portaobjeto esmerilado que sujetándolo con la mano derecha se sitúa delante de la gota de sangre de forma que los dos portaobjetos formen un ángulo entre 30º y 45º y desplazarlo suavemente hacia atrás hasta que alcance la gota de sangre.

4. Esperar a que por capilaridad se distribuya uniformemente deslizar suavemente y a velocidad moderada un porta sobre otro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos. El grosor del frotis sanguíneo puede variar según sea el ángulo que formen entre sí ambos portas. Así, si es superior de 45º la extensión obtenida será gruesa y corta. Por lo contrario, si el ángulo es muy pequeño será largo y fijo.

5. El secado del frotis se hará a temperatura ambiente y en posición horizontal

PRACTICA 11: TINCIÓN RÁPIDA O PANÓPTICO RÁPIDO

Material

Extensión sanguínea secada y rotulada.

Reactivos: Fijador (azul claro), colorante ácido (rojo eosina), colorante básico (azul de metileno).

Pinzas de madera.

Frasco lavador con agua destilada.

Técnica

Colocar el porta con la extensión sanguínea en la pinza de madera (para evitar mancharnos con los colorantes).

Sumergir la extensión cinco veces en el bote que contiene el fijador.

Sumergir cinco veces la extensión en colorante ácido.

Sumergir cinco veces la extensión en el colorante ácido.

Lavamos la extensión teñida con agua destilada.

Secamos la extensión teñida al aire.

Se observa al microscopio.

PRACTICA 12: TINCION DE GIEMSA

Material

Extensión sanguínea secada y rotulada.

Cristalizador.

Varillas paralelas.

Reactivos: Solución de Giemsa y metanol.

Pipeta pasteur.

Cronometro.

Frasco lavador con agua destilada.

Técnica

Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.

Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.

Colocar sobre las varillas la extensión.

Cubrir la extensión con metanol y esperar de cuatro a cinco minutos.

Decantar para eliminar el metanol.

Cubrir la extensión con solución de Giemsa y dejar actuar durante veinticinco minutos (una gota de Giemsa por cada nueve de agua destilada)

Lavar la extensión con agua destilada hasta eliminar los restos del colorante.

Secar al aire.

Observar al microscopio para comprobar la calidad de la tinción.

PRÁCTICA 13: TINCIÓN DE MAY- GRUNWALD

Material

Extensión sanguínea secada y rotulada.

Cristalizador.

Varillas paralelas.

Reactivos: Solución de metanol de eosina y azul de metileno.

Pipeta pasteur.

Cronometro.

frasco lavador con agua destilada

Técnica

Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.

Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.

Colocar sobre las varillas la extensión.

Cubrir la extensión con un volumen conocido de solución de May-Grünwald y dejar actuar tres minutos.

Añadir el mismo volumen de agua destilada y soplar ligeramente con la pipeta para homogeneizar, dejar actuar entre ocho y diez minutos.

Lavar la extensión con agua destilada hasta eliminar los restos del colorante.

Secar al aire.

30 . Observar al microscopio para comprobar la calidad de la tinción

PRÁCTICA 14: TINCION DE MAY- GRUNWALD- GIEMSA

Material

Extensión sanguínea secada y rotulada.

Cristalizador.

Varillas paralelas.

Reactivos: May-Grünwald y Giemsa.

Pipeta pasteur.

Cronometro.

29. Frasco lavador con agua destilada

Técnica

Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.

Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.

Colocar sobre las varillas la extensión.

Cubrir la extensión con un volumen conocido de solución de May-Grünwald y dejar actuar dos minutos.

Añadir el mismo volumen de agua destilada y soplar ligeramente con la pipeta para homogeneizar, dejar actuar entre dos y tres minutos.

Decantar.

Cubrir con colorante Giemsa recién diluido y dejar actuar veinte minutos.

Lavar con agua destilada.

Secar.

Observar al microscopio.

PRACTICA 15: TINCION DE WRIGHT

Material

Extensión sanguínea secada y rotulada.

Cristalizador.

Varillas paralelas.

Reactivos: colorante de Wright

Cronometro.

Frasco lavador con agua destilada.

Técnica

Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.

Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.

Colocar sobre las varillas la extensión.

Cubrir la extensión con un volumen conocido de solución de Wright y dejar actuar durante un minuto.

Añadir el mismo volumen de agua destilada y soplando ligeramente con la pipeta.

Dejar actuar durante tres o cuatro minutos.

Lavar con agua destilada.

Secar.

Observar al microscopio.

PRACTICA 16: FORMULA LEUCOCITARIA

Material

Muestra: Sangre venosa o capilar.

Microscopio.

Registrador de células

Técnica

Realizar una extensión de sangre, fijada y teñida preferentemente con May-Gründwald-Giemsa.

Observar la extensión con el objetivo de 10 x y seleccionar una zona del cuerpo de la extensión en que las células estén bien distinguidas.

Cambiar al objetivo de 100 x.

Observar la zona de la extensión elegida y anotar cada uno de los leucocitos observando hasta un total de 100.

No repetir los campos de la observación para no repetir dos veces la misma célula.

También se anotan todas las células que se encuentren en sangre periférica y que no suelen estar presentes.

Todas estas anotaciones se realizan mediante contadores automáticos, aunque se pueden realizar manualmente.

PRACTICA 17: TINCION DE RETICULOCITOS

Material

Sangre total anticoagulada.

Tubo de hemólisis.

Pipeta pasteur.

Portaobjetos (normales, biselados y esmerilados)

Colorante azul cresil brillante (1g.)

Suero fisiológico cantidad suficiente para 100 ml.

Microscopio.

Parafilm.

Técnica

En un tubo de hemólisis se mezclan entre tres y cinco gotas de sangre con otras tantas de colorantes (proporción mitad-mitad)

Se mezcla suavemente con papel parafilm y se deja en reposo a temperatura ambiente durante quince minutos o se pone al baño María a treinta y siete grados cinco minutos.

Se vuelve a homogeneizar la muestra.

Posteriormente realizamos la extensión.

Se seca y lo llevamos al microscopio.

en el microscopio con el objetivo de 40x, se localiza una zona de la extensión donde los glóbulos rojos estén bien distribuidos.

Cambiamos al objetivo de 100x y localizamos una zona en la que el número de glóbulos rojos por campo sea 100.

Entonces se encuentran los reticulocitos en diez campos.

Con el colorante los glóbulos rojos se ven de color azul-verdoso y el ARN azul.

Valores normales

0,5 - 1,5 %

En niños un poco más alto.

Disminución de reticulocitos: Reticulopenia

Aumento de reticulocitos: Reticulocitosis

Cálculos

nº reticulocitos

Reticulocito = ------------------------- = %

10

nº reticulocito contado

Reticulocito = ---------------------------------- x 100

nº GR. contado

Reticulocito contado __________________ GR. contado

X ___________________ 100

PRACTICA 19: METODO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA

Material

Sangre capilar o sangre venosa anticoagulada con edta o heparina.

Tubos de ensayo.

Cubetas.

Espectrofotómetro.

Pipetas automáticas de 20 µl.

Pipetas de 3 ml.

Prepipeta.

Reactivos: de drabkin y patrón de Hb.

Preparación del reactivo de drabkin:

0,5 de hemoglobina con 24,5 de agua destilada, en un matraz enrollado con papel albal.

Técnica

Conectar el espectrofotómetro.

Rotular 3 tubos de ensayo: blanco, patrón y muestra.

En cada tubo añadimos 5 ml. del reactivo de drabkin.

Añadir 20 µl. de muestra en el tubo M.

Añadir 20 µl. de patrón en el tubo P.

Dejar reposar 5min. a temperatura ambiente, para que se forme la cianometahemoglobina.

Pasado este tiempo, metemos el contenido de cada tubo en la cubeta de la muestra.

Colocamos las cubetas en el espectrofotómetro, en el orden: B, P y M.

Ponemos el espectrofotómetro para que nos mida la “A” a 540 nm.

Presionamos “MODE” y seleccionamos la T%.

Tiramos del émbolo para sacar el B y presionamos el OA.

Tras parpadear, se pondrá en 100,00.

Volvemos a presionar “MODE” para poner la “A”.

Tiramos del émbolo, para que la luz atraviese el patrón, y así obtener su “A” 1,566.

Tiramos de nuevo del émbolo para que la luz atraviese la muestra y leemos su “A” 0,725.

Una vez realizado los pasos anteriores, abrimos la tapa, sacamos la cubeta e introducimos el émbolo.

Resultados

A muestra

Hb (g/dl) = --------------- x [] de Hb Patrón;

A patrón

0.725

Hb (g/dl) = --------------- x 15.3 = 7,31 g/dl.

1.566

PRACTICA 19: RESISTENCIA OSMOTICA ERITROCITARIA

Material

Tubos de ensayo.

Pipetas pasteur.

Pipetas graduadas.

Centrifuga.

Espectrofotómetro.

Cubetas.

Matraz aforado.

Vidrio.

Balanza.

NaCl

Agua destilada.

Sangre venosa fresca.

Técnica

Se prepara una batería de 17 tubos de ensayo y se enumeran.

Se añade una cantidad determinada de agua destilada y NaCl siguiendo la tabla.

Tubos	Solución patrón (ml) 0.9%	Agua destilada (ml)	[]NaCl
1	9	0	0.9
2	8.5	0.5	0.85
3	8	1	0.8
4	7.5	1.5	0.75
5	7	2	0.7
6	6.5	2.5	0.65
7	6	3	0.6
8	5.5	3.5	0.55
9	5	4	0.5
10…	4.5 …	4.5 …	0.45 ...

Se añade 50 µl, a cada uno de los tubos, de sangre.

Dejar a temperatura ambiente durante una hora.

Centrifugar a 2500-3000 r.p.m. durante 5 min.

Recoger el sobrenadante de cada tubo con una pipeta pasteur y los pasamos a tubos limpios debidamente rotulados.

Leer la absorbancia de cada uno de los sobrenadantes a 540nm.

La lectura se realiza con una misma cubeta utilizando la cubeta nº 1 como blanco y leyendo el resto de forma ordenada.

Se halla el porcentaje de hemólisis utilizando los resultados de la absorbancia.

A tubo x

% hemólisis = --------------

A tubo 1

Una vez obtenidos todos los resultados, realizamos una gráfica. Sobre la gráfica se determina el valor de NaCl para el que le corresponda una hemólisis del 50%. “H50”.

PRACTICA 20: DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO EN PLACA O PORTA

Fundamento

Los Ags del sistema ABO que tengan los GR de la muestra, reaccionan con los Ac específicos de los sueros usados como reactivos. La reacción Ag- Ac producida se pone de manifiesto por la aglutinación de los hematíes.

Material

Placa o porta.

Pipeta pasteur.

Palillos.

Visualizador luminoso.

Reactivo suero Anti A y Anti B.

6. Muestra: Sangre venosa o capilar

Técnica

Colocar en el porta 2 gotas de sangre separadas una de otra o bien poner una gota en un porta rotulado con la letra A y otro con la letra B.

A: añadir una gota de suero Anti A “Azul”.

B: añadir una gota de suero Anti B “Amarillo”.

Con el palillo mover y mezclar el reactivo y la gota de sangre.

(Utilizar palillos distintos para cada muestra).

Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

Anti A	Anti B	G.S.
+	-	A “Ag A”
-	+	B “Ag B”
+	+	AB “Ag A y Ag B”
-	-	O

PRACTICA 21: DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO EN TUBO

Material

Muestra: Sangre.

Reactivos Anti A y Anti B.

Centrífugas.

Tubo de centrífugas.

Gradillas.

Pipeta pasteur.

Suero fisiológico

Técnica

Preparar una suspensión de hematíes al 5%.

Rotular dos tubos con la letra A y B respectivamente.

Colocar en cada uno una gota de la suspensión.

Añadir al tubo A dos gotas de Anti - A y al tubo B dos gotas de Anti - B.

Mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 15 min.

Centrifugar durante 2 min. a 2000 r.p.m.

Observar si existe o no aglutinación. Para ello se agitan los tubos suavemente, intentando resuspender el botón celular que ha quedado como sedimento tras la centrifugación.

Si hay aglutinación los glóbulos rojos no se resuspenden, sino que el botón celular se resuspende en bloque.

Cuando no hay aglutinación los glóbulos rojos se resuspenden fácilmente.

Se comprobará al microscopio los tubos que aparenten no tener aglutinación.

Para ello se coge una gota de la suspensión, se deposita en un porta, se pone un cubre y se mira con el objetivo de 40 X

PRACTICA 22: PRUEBA SERICA O INDIRECTA

Fundamento

Los Ac contra los Ag del sistema ABO presentes en el suero de un individuo, se identifican enfrentando el suero a hematíes sobre los que se conocen sus Ag ABO. La reacción entre Ag- Ac se pone de manifiesto por la aglutinación de los hematíes usados como reactivos

Material

Tubos.

Pipetas pasteur. Muestra: Sangre.

Microscopio.

Suspensión de hematíes A al 3-5%.

Suspensión de hematíes B al 3-55.

Centrífuga

Suero fisiológico.

Suero problema Plasma

Técnica

Coger 2 tubos rotulados con A y B respectivamente.

Añadir 2 gotas de suero problema a cada tubo.

Añadir al tubo A una gota de la suspensión de hematíes y otra gota de suspensión al tubo B.

Mezclar suavemente.

centrifugar durante dos min. a 1500 - 2000 r.p.m.

Sacar de la centrifuga y observar si existe aglutinación.

Resultados

Ac plasma / suero	Ag A	Ag B	Grupo sanguíneo
Anti-B	-	+	A
Anti-A	+	-	B
Anti-B y A	-	-	AB
Anti-B y A	-	+	0

PRACTICA 23: DETERMINACION DEL RH

Fundamento

Si los hematíes de la muestra tienen antígeno D, este reacciona con los Ac específicos del suero anti- D usado como reactivo. La reacción Ag- Ac se pondrá de manifiesto con la ausencia o presencia de aglutinación.

Material

Portaobjetos

Palillos

Reactivos: suero anti-D y sangre entera

Pipeta pasteur.

Visualizador luminoso.

Técnica

Depositar una gota de anti-D sobre un porta limpio y rotulado.

Poner una gota de sangre sobre el mismo porta.

Mezclar el reactivo y la sangre con un palillo.

Mover el porta con pequeños movimientos y observar si existe aglutinación en el periodo de dos minutos.

Si hay aglutinación, es Rh + y si no se observa aglutinación, es Rh -, pero existe una posibilidad de que sea Rh + débil, por lo se debe de realizar la prueba de determinación del Rh + débil.

PRACTICA 24: VARIANTE DEL Du O Rh + DÉBIL

Fundamento

Bajo el termino Du se engloban todos los Ag D o Rh + débiles. Se manifiestan por una reacción dudosa sobre portas o tubos.

En el laboratorio la investigación del Ag Du se lleva a cabo mediante una prueba de Coombs indirecta o bien mediante enzimas.

Se aconseja la determinación de los Rh débiles en los siguientes casos:

• en la mujer embarazada y el RN de madre Rh -

• en los centros de transfusión al determinar el Rh de los donantes

Esta reacción puede hacerse visible añadiendo antiglobulina humana, después de que se haya producido la reacción Ag- Ac entre el Du de los hematíes problema y el suero anti- D usado como reactivo.

Material

Tubo de ensayo.

Reactivos: suero anti-D.

Suspensión de hematíes 3-5%.

Centrifuga.

Pipetas Pasteur.

Sangre de Rh -.

Técnica

Colocar en un tubo de ensayo rotulado dos gotas de suero anti-D.

Añadir dos gotas de suspensión de hematíes.

Mezclar e incubar a 37ºC durante 30 min.

Sacar y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 2 min.

Resuspender el botón celular.

Si hay aglutinación, Rh +, y si no hay deberemos de continuar.

Lavar los hematíes tres veces con solución salina y en el ultimo lavado, se debe de decantar por completo el sobrenadante.

Añadir dos gotas de suero de “COOMBS” (suero anti-G humana) y mezclar.

Centrifugar durante 2 min. a 2000 r.p.m.

Resuspender el botón celular y observar si existe o no aglutinación.

Resultados

Si existe aglutinación: Du + o Rh + débil.

Si no existe aglutinación: Rh -.

PRACTICA 25: PRUEBA DE COOMBS O PRUEBA DIRECTA

Fundamento

La prueba directa detecta Ac ya fijados a los hematíes y para ello se enfrentan los hematíes del pte con antiglobulina. Se utiliza para detectar la enfermedad hemolítica del recién nacido y para otras anemias hemolíticas

El suero de Coombs puede ser de dos clases: poliespecífico, si esta dirigido contra la Ig G y el componente C3d del complemento, y monoespecifico, si solo esta dirigido contra la Ig G y algunos de los componentes del complemento.

Material

Gradilla.

Centrifuga.

Tubos de ensayo.

Suero fisiológico.

Pipetas Pasteur.

Suero coombs

Suspensión de hematíes problema

Técnica

Preparar una suspensión al 5% en solución salina.

Colocar 1 gota de suero de coombs en 1 tubo.

Añadir 1 - 2 gotas de la suspensión.

Mezclar y centrifugar 1-2 min. a 2000 r.p.m.

Sacar de la centrifugadora y resuspender el botón celular y observar si hay o no aglutinación.

Si hay aglutinación, hay Ac incompletos

PRACTICA 26: PRUEBA INDIRECTA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA O TEST DE COOMBS INDIRECTO

Fundamento

Se pretende detectar generalmente la presencia en el suero del enfermo de Ac incompletos libres.

Se incuba el suero del paciente con unos hematíes tipo (GR que no tienen adheridos a su superficie ningún tipo de Ig y ningún componente del complemento)

La finalidad de esta incubación consiste en lograr una sensibilización in Vitro de los hematíes tipo por parte de los Ac incompletos que pueden estar contenidos en el suero problema. Los hematíes tipo que se suelen utilizar con los 0+.

Material

Gradilla.

Centrifuga.

Tubos de ensayo.

Solución salina.

Pipetas Pasteur.

Suero coombs.

Suspensión de hematíes al 5%

Técnica

Preparar una suspensión de hematíes tipo al 5% en solución salina.

Colocar en 1 tubo 2 gotas de los hematíes tipo y 2 gotas de suero problema.

Mezclar e incubar a 37ºC durante 30 min.

Lavar 3 veces el producto incubado en solución salina.

Tras el último lavado resuspender el sedimento de hematíes.

Añadir 2 gotas del suero coombs.

Mezclar bien y centrifugar a 2000 r.p.m. 1-2 min.

Agitar el tubo y observar si hay o no aglutinación.

Resultados

Si existe aglutinación tiene Ac - incompletos.

Si no existe aglutinación no tiene Ac - incompletos

PRACTICA 27: FACTOR REUMATOIDE

Fundamento

Los factores reumatoideos son un grupo de Ac tipo Ig M (aunque también se ha descrito la presencia de Ig G e Ig A) que reaccionan contra el fragmento Fc de las moléculas de Ig G.

Los FR aparecen principalmente en el suero de ptes con artritis reumatoide pero también otras enfermedades pueden producir FR: procesos inflamatorios crónicos, enfermedades infecciosas como endocarditis bacteriana subaguda, malaria, sífilis, lepra, tuberculosis y variedad de enfermedades autoinmunes como el LES.

Material

Plasma.

Pipeta 50 µl.

Punta de pipeta.

Gradilla.

Reactivo.

Controles “Azul - y Rojo +.

Técnica

Cogemos 4 botes de suero problema.

Ponemos en la plantilla 1 gota de cada suero, en un círculo “de 1 a 4”.

3. En el 5 y en el 6 ponemos en uno el y en el otro

Añadimos el reactivo “1 gota” en cada círculo y agitamos 2 min. con la mano.

Observar si hay aglutinación.(en este caso no existe aglutinación, pero seguiré detallando el proceso en caso de tener resultado positivo)

En el no aparece, en el si aparece. Esto se hace para comprobar si el reactivo está bien.

En el círculo que nos haya salido aglutinación, significa que tiene F.R., cogemos esa sangre y realizamos diluciones seriadas.

½ Tubo 1: Echamos 200 µl suero y 200 µl.

¼ Tubo 2: Echamos del anterior 100 µl suero y 100 µl s.f..

1/8 Tubo 3: Echamos del anterior 100 µl suero y 100 µl s.f.

1/16 Tubo 4: Echamos del anterior 100 µl suero y 100 µl s.f.

Se colocan 1 gota de cada tubo en la plantilla y se añade el reactivo.

En el primer círculo de la plantilla da aglutinación, mientras que en los demás no.

Resultados

Resultados positivos: la presencia de aglutinación indica una concentración de FR en el suero "30 UI/mL. Los suero positivos pueden titularse (en este caso hemos hecho diluciones seriadas)

Resultados negativos: la ausencia de aglutinación indica un contenido de FR en el suero de "30 UI/mL

PRACTICA 28: PRUEBAS CRUZADAS

Fundamento

Las pruebas cruzadas consisten en enfrentar suero y hematíes del donante con suero y hematíes del receptor, para comprobar la existencia o no de aglutinación. Si aparece aglutinación es indicativo de la existencia de Ac en el suero contra los hematíes. La no aglutinación indica la compatibilidad entre ambas sangres.

Las pruebas cruzadas se realizan en tres medios:

en medio albuminoso

con antiglobulina humana

pruebas enzimáticas con bromelina

Objetivos

Determinar la compatibilidad sanguínea enfrentando el suero del receptor con los hematíes del donante.

Detectar los posibles Ac que se hallen fijados a la membrana de los hematíes con antiglobulina humana.

Material

portas

palillos

pipetas pasteur

tubos de centrifuga

centrifuga

pipetas

prepipetas

baño termostatado

Reactivos

Anti A, Anti B y Rh

suero fisiológico

sangre (mínimo dos muestras diferentes)

albúmina bovina

antiglobulina humana

solución de bromelina

Técnica

Primero debemos obtener dos muestras de sangre de igual grupo sanguíneo y Rh. Para ello debemos determinar su grupo sanguíneo y Rh, lo haremos en porta.

Antes, debemos coger con pipetas Pasteur el suero de cada tubo de sangre. Lo depositaremos (el suero) en tubos de centrifuga, un tubo contendrá el suero del donante y el otro el del receptor.

Una vez separado el suero y determinado su grupo sanguíneo, haremos una suspensión de hematíes al 5%. Para ello debemos proceder al lavado de hematíes con suero fisiológico. Una vez lavados, haremos los cálculos necesarios para hacer la suspensión de hematíes.

100 mL suspensión -------------------- 5 mL hematíes lavados

10 mL ------------------------------- x

X= 0,2 mL hematíes lavados

9,8 mL suero fisiológico

4. Se hará una suspensión por cada tubo de sangre, es decir, suspensión del donante y suspensión del receptor.

5. Una vez hechas las suspensiones, realizaremos la prueba en cada uno de los medios antes indicados

A) Prueba cruzada en medio albuminoso

En las pruebas en tubo se hace la prueba mayor y menor a la vez.

Rotular 4 tubos de hemólisis como M, Cr, m, Cd (mayor, control receptor, menor y control donante)

Poner en cada tubo las suspensiones y los sueros según el cuadro:

	M	Cr	m	Cd
Suero receptor	2gotas	2gotas
Suero donante			2gotas	2gotas
Albúmina al 30%	2gotas	2gotas	2gotas	2gotas
Suspensión 5hematíes receptor		2gotas	2gotas
Suspensión 5% hematíes donante	2gotas			2gotas

Mezclar e incubar 10 minutos a 37ºC

centrifugar 2 minutos a 2000 rpm

comprobar si existe aglutinación o hemólisis. En este caso no hay signos de aglutinación macroscópica ni microscópica. Esto significa que hay compatibilidad entre el donante y el receptor

B) Prueba cruzada con Antiglobulina Humana

1. Rotular los 4 tubos como en la prueba anterior

2. Poner en cada tubo las suspensiones y los sueros según el cuadro:

	M	Cr	m	Cd
Suero receptor	2 gotas	2 gotas
Suero donante			2gotas	2 gotas
Suspensión 5% receptor		2 gotas	2 gotas
Suspensión 5% donante	2 gotas			2 gotas

3 Mezclar y centrifugar dos minutos a 2000rpm

comprobar si existe o no aglutinación. Si hay, indica incompatibilidad. En este caso no existe aglutinación, por lo cual continuaremos con la prueba.

incubar 15 minutos a 37ºC

lavar los hematíes 3veces, desechando el sobrenadante

añadir dos gotas de antiglubulina humana a cada tubo

mezclar y centrifugar 2 minutos a 2000 rpm

observar si hay aglutinación. En este caso no la hay, indica compatibilidad.

C) Prueba enzimática con Bromelina

1. Rotular 4 tubos de hemólisis como M, Cr, m, Cd (mayor, control receptor, menor y control donante)

2. Poner en cada tubo las suspensiones y los sueros según el cuadro

	M	Cr	m	Cd
Suero receptor	1	1
Suero donante			1	1
Bromelina	1	1	1	1
Suspensión receptor		1	1
Suspensión donante	1			1

3. mezclar e incubar a temperatura ambiente 5 minutos

4. Centrifugar 2 minutos a 2000rpm

5. Comprobar si existe aglutinación. En este caso no hay. Son compatibles.

Interpretación

La aparición de hemólisis o aglutinación en las pruebas, en cualquiera de los medios, indica incompatibilidad de las sangres. La aglutinación aparecerá en uno u otro medio, dependiendo del tipo de Ac causante de la incompatibilidad.

La aglutinación en un control indica la existencia de autoanticuerpos en la sangre del receptor o del donante, según el tubo control en el que aparezca.

PRACTICA 29: PRUEBAS QUE ESTUDIAN LA COAGULACIÓN MÉTODO DE SABRAZES

Material

1. Capilares sin Acg

2. Lancetas

3. Cronómetro

4. Sangre entera capilar o venosa.

Técnica: Punción capilar

Se hace una incisión en el dedo y se pone en marcha el cronómetro cuando empiece a fluir sangre.

Llenamos 2/3 del capilar.

Se deja en reposo durante 3 min. a partir de los cuales se invierte de un extremo a otro cada 30 seg.

Cuando la sangre deje de desplazarse de un lado a otro se para el cronómetro.

Medimos el tiempo y este será el tiempo de coagulación.

Resultados

Valores normales: 3 - 6 min.

Técnica: Punción venosa

1. Se extrae la sangre venosa y en cuanto entre sangre en la jeringa se pone en marcha el cronómetro.

2. Llenar un capilar a partir de la jeringa.

3. Se deja en reposo durante 3 min., a partir de los cuales se invierte de un extremo a otro cada 30 seg.

4. Cuando la sangre deje de desplazarse de un lado a otro se para el cronómetro.

5. Medimos el tiempo y este será el tiempo de coagulación.

Resultados:

Valores normales: 3 - 6 min.

PRÁCTICA 30: TEST DE HOWELL

Material:

2 tubos de hemólisis.

Pipetas 0'1 ml. (100 microlitos).

Baño a 37ºC.

Cronómetro.

Plasma control normal.

Cl2Ca 0'025 M.

PRP

Técnica:

1. Atemperar los reactivos y las muestras a 37ºC. durante 10-15 min.

Roturar un tubo con la letra M y otro con la letra C “control”.?

Añadir 0'1 ml. de prp “M” y 0'1 ml. de control.

Añadir a cada tubo 0'1 ml. de Cl2Ca 0'025 M y poner en marcha el cronómetro.

Inclinar los tubos “M y C” hacia delante y hacia atrás cada segundo aproximadamente.

Parar el cronómetro cuando exista un enturbiamiento o solidificación del plasma “se ha producido coagulación”.

PRACTICA 31: TIEMPO DE TROMBROPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

Introducción

El Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada es una prueba  que mide la funcionalidad de las vías intrínseca y común de la cascada de la coagulación. El organismo utiliza la cascada de la coagulación para producir coágulos sanguíneos que permiten reparar las lesiones producidas sobre los vasos sanguíneos y los tejidos; también para prevenir pérdidas adicionales de sangre, y para dar a las áreas lesionadas tiempo suficiente para cicatrizar. La cascada consiste en un grupo de factores de la coagulación. Estas proteínas se activan de manera secuencial juntamente a la vía extrínseca (relacionada con los tejidos) o bien juntamente a la vía intrínseca (relacionada con los vasos sanguíneos). Las ramas de ambas vías confluyen en la vía común, y completan su tarea formando un coágulo sanguíneo estable. Cuando una persona empieza a sangrar, estas tres vías han de actuar conjuntamente.

Cada componente de la cascada de la coagulación debe funcionar correctamente y estar presente en cantidad suficiente para asegurar la formación de un coágulo sanguíneo normal. Si existe un déficit adquirido o hereditario de uno o más factores, o si los factores funcionan anormalmente, entonces estará inhibida la formación de un coágulo estable y se podrá producir un sangrado o bien una coagulación excesiva.

La prueba TTPa mide el tiempo (en segundos) que transcurre hasta que se produce el coágulo cuando, en el tubo de ensayo, se añade ciertos reactivos al plasma (porción líquida de la sangre).

Objetivo

La incubación del plasma con cantidades optimas de fosfolípidos y un activador de superficie conduce a una activación de los factores del sistema endógeno de la coagulación. Mediante la agregación de iones de calcio se desencadena el proceso de coagulación, se mide el tiempo transcurrido hasta la formación de un coagulo de fibrina

Material

Cl2Ca 0,025 M

Cefalina activada

Plasma control

Citrato sódico

Coagulómetro

Baño termostatado

Gradilla

Tubo ensayo

Cronometro

Centrifuga

Técnica (puede hacerse manual o automático)

Preparar el plasma citratado: mezclar 1 parte de solución de citrato sódico (0,4 mL) con 9 partes de sangre (3,6 mL), centrifugar 10 minutos a 2500 rpm.

Una vez obtenido el plasma citratado procedemos a realizar la prueba:

Automática

• Echamos 100 µL de plasma citratado (en un recipiente del Coagulómetro) junto a 100µL de cefalina activada, incubamos en el aparato 2minutos a 37ºC.

• Después echamos 100 µL de cloruro cálcico, y el coagulometro empieza a cronometrar el tiempo de coagulación.

Tiempo: 28, 7 segundos

Manual

• en un tubo de ensayo precalentado a 37ºC pipeteamos 100µL de plasma citratado, 100 µL de cefalina activada, incubamos en el baño a 37ºC 2 minutos. Cuando echemos el cloruro cálcico ponemos en marcha el cronometro, y medimos hasta que aparezcan signos de coagulación.

Tiempo: 1minuto 26 segundos

Interpretación de los resultados

Valores normales de TTPa pueden indicar una función normal de la coagulación; sin embargo, no puede descartarse algún déficit aislado de algún factor. Si este fuera el caso, es posible que no quede reflejado en el TTPa hasta que la disminución sea del 30 al 40% del valor normal. Puede suceder que existan anticoagulantes lúpicos que interfieran en la prueba. Si se sospechara de un anticoagulante lúpico (AL), se puede utilizar una prueba TTPa sensible al AL para ponerlo de manifiesto.

Un TTPa prolongado significa que la coagulación tarda más en producirse de lo esperado y puede ser debido a múltiples razones (ver tabla). A menudo sugiere que puede existir un déficit de un factor de la coagulación o un inhibidor específico o inespecífico que interfiere en la capacidad del organismo para formar coágulos. Las deficiencias de los factores de la coagulación pueden ser hereditarias o adquiridas. Muchos factores son Vitamina K dependientes. Si una persona sufre, por ejemplo, una enfermedad hepática, o más raramente un déficit de vitamina K, es posible que presente un déficit de uno o más factores. Las deficiencias hereditarias de factores de coagulación pueden afectar a la cantidad y/o la función del factor implicado.

Los inhibidores pueden ser anticuerpos que atacan específicamente ciertos factores de la coagulación, como sucede con los anticuerpos anti-Factor VIII, o bien pueden ser inhibidores específicos como el anticoagulante lúpico o los anticuerpos anticardiolipina que se unen a moléculas conocidas como fosfolípidos presentes en la superficie de las plaquetas. Puesto que los fosfolípidos participan en el proceso de la coagulación, y dado que los reactivos  (productos químicos para realizar las pruebas) utilizados en la prueba TTPa contienen fosfolípidos, estos anticuerpos pueden prolongar el TTPa, aunque normalmente se asocien más bien a trombosis que a sangrados.

La administración de heparina también causa una prolongación del TTPa, tanto si la heparina está presente en la muestra debido a un tratamiento anticoagulante como si es debido a una contaminación. La heparina es un medicamento que se administra por vía intravenosa (IV) o por inyección (subcutánea) para prevenir y para tratar los tromboembolismos (coágulos que bloquean los vasos sanguíneos). Cuando se administra a dosis terapéuticas debe monitorizarse (si hay demasiada heparina, el paciente sangrará excesivamente; si hay poca, el paciente seguirá formando coágulos). El TTPa se utiliza para monitorizar el tratamiento con heparina y ocasionalmente para monitorizar el tratamiento con otros anticoagulantes como la bivalirudina, o el argatroban.

El TTPa puede estar disminuido si el Factor VIII de la coagulación está elevado. Esto puede acontecer durante una reacción de fase aguda, una situación originada por una inflamación tisular aguda o por un traumatismo. Esta condición suele suponer un cambio temporal que no necesita ser monitorizado con el TTPa. Cuando se resuelve la causa de la reacción de fase aguda, el TTPa vuelve a sus valores normales.

A continuación se indican las condiciones que pueden llevar a TTPa prolongados:

• Problemas preanalíticos. Pueden ser debidos a:

• Muestra insuficiente. La sangre obtenida ha de ser en cantidad suficiente. La relación entre anticoagulante y sangre ha de ser de 1 a 9 (10% del total de la muestra).

• Pacientes con valores de hematocrito elevados o disminuidos pueden tener un TTPa alterado.

• Contaminación por heparina. Este constituye el problema más común, especialmente cuando se ha obtenido la sangre a partir de una vía intravenosa, que con la finalidad de que no se obture, se va limpiando con heparina.

• Muestras de sangre coagulada. El proceso de la coagulación va consumiendo algunos de los factores.

• Deficiencias adquiridas o hereditarias de factores de la coagulación. Algunas deficiencias originan sangrados, otras -factores de contacto- prolongan el TTPa in vitro pero no causan sangrados y por ello presentan poco significado clínico. Los TTPa debidos a deficiencias de factores suelen corregirse después de mezclarlos con plasma normal.

• Un inhibidor inespecífico como el anticoagulante lúpico (AL). Si el AL prolonga el TTPa o el TTPa sensible al AL, no se normalizará al mezclarlo con plasma normal pero sí que se corregirá si se añade a la muestra un exceso de fosfolípido.

• Un inhibidor específico. Aunque relativamente poco frecuentes, se trata de anticuerpos que atacan a un factor en particular. Pueden aparecer en individuos con trastornos de la coagulación que reciben tratamiento sustitutivo con algún factor (como el Factor VIII utilizado para tratar la hemofilia A) o bien espontáneamente como autoanticuerpos. El inhibidor específico prolongará el TTPa y no se normalizará al mezclarlo con plasma normal.

• Tratamiento anticoagulante con heparina (el TTPa que se desea alcanzar suele ser entre 1.5 y 2.5 veces mayor que el nivel previo al tratamiento).
  Tratamiento con Sintrom® (acenocumarol). El TTPa no se utiliza para monitorizar este tipo de tratamiento pero puede verse afectado por el mismo.

• Pueden observarse niveles elevados de TTPa en leucemias y en la enfermedad de Von Willebrand.

PRÁCTICA Nº 32: TIEMPO DE TROTOMBINA O TIEMPO DE QUICK

Material:

Baño.

Tubo.

Reactivo: Tromboplastina cálcica “Tromborel®s”

Gradilla.

Pipeta automática.

PPP.

Técnica:

Reconstituir la Tromboplastina cálcica.

Depositar el volumen de “Tromborel®s” que se va a necesitar en un tubo de ensayo debidamente rotulado.

Atemperar a 37ºC.

Introducir un trocito de acero en una cubeta del coagulómetro.

Añadir 100 µl. de la M en la cubeta e incubar a 37ºC. durante 5 min.

Colocar la cubeta en la celda de medida del coagulómetro y añadir 200 µl. de “Tromborel®s”.

Cuando se forme el coágulo, el cronómetro finaliza la lectura y nos da el tiempo transcurrido desde la adicción del “Tromborel®s”.

Resultados:

Valores normales 11 - 15 seg.

Si se expresa en % de actividad: 70 - 100%

Tp muestra

Posición o tasa de Protombina: ----------------------

Tp control

1 2 3

4 5 6

+

_

+

_