DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS

POR EL METODO DE LA NINHIDRINA

REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS.

Los aminoácidos participan en muchas reacciones en las cuales intervienen las funciones - amino, carboxilo y los diversos grupos R. La revisión de todos estos tipos se encuentran fuera de los objetivos de un curso de unas cuantas reacciones importantes:

DETECCION Y MEDICIÓN CUANTITATIVA.

La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuantra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido.

La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificación de todos los aminoácidos primarios se evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de 540 nm.

Aminoácidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos; estos son amarillos t tienen su máxima absorción a 440 nm. El cálculo de la concentración se basa en la relación de Beer-Lambert.

El orto-ftaldehído (OPA, del ingles orto-ptaldehyde, también llamado fluoraldehído) es un nuevo reactivo de revelado, más sensible, con el cual puede detectarse concentraciones de aminoácidos de orden de picomoles (10E-12) a femtomoles (10E-15). Esta enorme diferencia en sensibilidad se debe a la productos intensamente fluorescentes. Después de la reacción, la exposición a una radiación de 360 provoca una emisión fluorescente a 445 nm, cuya intensidad se relaciona con la concentración del aminoácido. Esta reacción ocurre con rapidez si se trata de aminoácidos primarios, pero no cuando son secundarios. No obstante, la prolina puede detectarse oxidándola primero a una amina primaria.

Los derivados de la feniltiohidatoina que absorbe la luz ultravioleta, los derivados fluorescentes del densilo y los derivados amarillos del dinitrofenilo son útiles no son solo para la detección cuantitativa de aminoácidos, sino también para su identificación.

METODOS PARA DETERMINAR CUANTITATIVAMENTE A LOS AMINOACIDOS.

Hay diferentes métodos para determinar cuantitativamnete a los aminoácidos como lo son, las cromatografias, electroforesis y otros métodos en el que participan tanto las cromatografias como reacciones con dinitrofluorobenceno y fenilisotiocianato.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

El cambio ionico sucede cuando los constituyentes ionicos de la manera se retienen selectivamente por intercambio con sus iones sustituibles del empaque. Este fenomeno de iones puede definir como que posee grupos ionicos fijos y grupos ionicos móviles. Estos últimos pueden ser sustituidos por otros, bajo condiciones especificas.

La cromatográfia de intercambio ionico consiste en intercambiar iones de la fase estacionaria, la cual es un polímero con iones lábiles (cationes o aniones) de estructura porosa, insolubles, pero capaz de aumentar su volumen al ser humedecidos.

CROMATOGRAFÍA CUANTITATIVA DE CAPA FINA

Existen varios métodos para medir la cantidad de un componente individual en una mancha. Un método general es raspar el absorbente que rodea a cada mancha con una navaja o puede limpiarse con agua, proceder a analizar el constituyente de la muestra por algún método espectrofométrico o colorimétrico. También es posible usar un método microanalítico, como una microtitulación.

El segundo método consiste en analizar directamente el compuesto sobre la placa. Suele utilizarse un aparato llamado densitómetro. Si el compuesto es fluorescente, puede utilizarse un tipo de fluorómetro para medir la cantidad de fluorescencia que emite la mancha.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL.

Esta técnica se basa en el principio de que un compuesto se reparte o distribuye entre dos fases líquidas. En un ambiente que contiene vapor de agua, el papel de cromatografía absorbe una cantidad de agua que mantiene entre las fibras de la celulosa del papel. Esta agua se considera como uno de los disolventes y constituye la fase estacionaria. Si se permite que un que un disolvente no acuoso ( la fase móvil) se traslade por el papel impulsada por la acción capilar, tan pronto como el disolvente alcance a cualesquiera moléculas de soluto en el papel, están se distribuirán entre las dos fases en una proporción característica de sus coeficientes de reparto. Cuanto más soluble sea un soluto en la fase movil, tanto más se trasladara el compuesto por el papel en la dirección del flujo del disolvente y viceversa

Podemos citar como ejemplo del procedimiento de cromatografía en papel la separación de aminoácidos en fracciones por cromatografía descendente en papel Whatman No. 1, empleando la elución fenol saturado con agua. Los aminoácido aparecen como manchas coloridas después de revelar el cromatograma rociándolo con reactivo de ninhidrina.

Se desconoce con certera el mecanismo de la cromotagrafía en papel. Es probable que los constituyentes de la muestra probablemente sean retenidos por el papel a causa de su solubilidad en el agua que el papel absorbe, o por absorción de los propios constituyentes de la muestra o por una combinación de ambos.

REACCION CON DINITROFLUOROBENCENO.

Es una reacción que se usa para la medición y detección cuantitativa de los aminoácidos, la principal aplicación sé encuantra en la determinación del residuo N-terminal de cadenas peptidicas.

El complejo formado es el dinitrofenil derivado (DNP) de color amarillo; cromatografía en papel o en capa fina de un DNP- aminoácido desconocido contra estándares conocidos de DNP aminoácidos proporciona la base para identificar al conocido.

REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.

Se le conoce también como reacción de Edman; se utiliza para la identificación de aminoácidos con la aplicación principal de determinar la secuencia de cadenas peptídicas desde el extremo N-terminal.

REACCION CON FLUORESCAMINA.

Este es un reactivo aún más sensible para la determinación cuantitativa de aminoácidos, ya que puede detectar nanogramos de aminoácido, al igual que la ninhidrina, la fluorescamina forma un complejo con aminas de otros compuestos además de aminoácidos.

METODOLOGIA DE LA PRACTICA.

Para preparar el reactivo de ninhidrina se disuelven 400 mg de cloruro estanoso en 250 ml de amortiguador de citrato de 0.2 M ph de 5 (4.3 gr de ácido cítrico más 8.7 gr de citrato trisodico en 250 ml, se ajusta a pH 5 con NaOH o HCl). Se añade esta solución a 250 ml de metilén celosolve ( etilen glicol monometil éter), en los que se ha disuelto previamente 10 gr de ninhidrina.

Después de añadir ninhidrina, se agita y se coloca en un baño de agua hirviendo durante de 20 minutos. Terminado el calentamiento, se enfría en otro baño de agua y se añade 8 ml de n-propanol al 50 %. Se vuelven a aguitar los tubos, y se deja en reposo durante 10 minutos para que aparezca el color y después se lee a 570 nm.

CALCULOS.