MATERIALES

• Succinato de Na 0.1 M

• Tampón fosfato pH = 7.4

• Malonato de Na 0.3 M

• Agua destilada

• Azul de metileno (A M)

• Succínico Deshidrogenada

• Alfa Naftol

• Parafenilendamina (P F D)

• KCN 0.75 M

• Citocromo Oxidasa

&Preparación Succínico deshidrogenasa:

Se utiliza corazón fresco de cerdo el que se corta en trozos pequeños y se lava tres veces con agua destilada fría. Se filtra enseguida por gasa y los trozos de músculo obtenido, se suspenden en buffer fosfato de pH = 7.4. Esta preparación se homogeniza, en una licuadora fría y la suspensión obtenida se conserva en frío.

OBJETIVOS

Experimento Nº 1

• Demostrar la capacidad de captación de hidrógenos por el azul de metileno ( A M ), y la inhibición de la Succínico deshidrogenasa.

• Ver la reacción del tubo Nº 3 si se cambia el Malonato de Na por CN-.

• Indicar y explicar cambios de color en el tubo Nº5.

Experimento Nº 2

• Determinación de la citocromo oxidasa usando Parafenilendiamina como indicador, inhibiendo la enzima.

• Anotar los resultados del experimento y dar explicación.

MARCO TEORICO

En le naturaleza existen diversos ciclos que se realizan gracias a que se activan o promueven reacciones redox, por ejemplo en los vegetales que utilizan la luz como energía solar para promover reacciones redox y sintetizar moléculas complejas a partir de otras simples como son el agua y el CO2.

Este proceso se revierte por el metabolismo de los animales, que es un proceso en el cual degradan estas moléculas para obtener energía y moléculas simples que son nuevamente el agua y el CO2.

Todos estos procesos se efectúan gracias a la presencia de ATP, que es una reserva de energía de forma transitoria para usarla de forma inmediata. Siendo el ATP tan importante se han determinado 3 formas para sintetizarlo que son:

• Fosforilación a nivel de sustrato

• Fosforilación

• Fosforilación oxidativa

Siendo la fosforilación oxidativa el centro de nuestro estudio dado que posee procesos calificados como cadena respiratoria, donde el ATP se genera por consecuencia del flujo de electrones a través de transportadores y componentes como el NAD y FAD DESHIDROGENASA, UBIQUINONA y CITOCROMO, este último mediador entre el O2 y los sustratos reducidos, estos compuestos se organizan en la membrana interna de la mitocondria de forma específica para asegurar el funcionamiento y las propiedades redox de los componentes, siendo la mitocondria la fuente de poder más importante de las células animales . Entonces para formar ATP dentro de la cadena respiratoria de las mitocondrias, se producen una serie de transferencias de electrones por reducción y oxidación de los componentes de la cadena, tratados de resumir en pequeños complejos mas entendibles, comenzando por la donación de electrones desde el NADH a la UBIQUINONA, catalizado por la Ubiquinona reductasa ( complejo I ) . También se transfieren electrones desde el Succinato a la Ubiquinona ( complejo II ) , nombrándose a este complejo Succinato-reductasa ó Succinato Deshidrogenasa, que ayuda a catalizar la oxidación del Succinato. Es importante mencionar que la transferencia de 2 electrones desde el Succinato a la Ubiquinona comprende un grupo proteico FAD y centro Fe-S. Estos pasos del nombrado complejo II también libera ATP pero en poca cantidad. Los electrones se pasan del complejo II al III formado por los citocromos.

Como forma global se tiene que la transferencia de electrones desde el Succinato a O2 por la cadena y sus transportadores da como resultado ATP, que son 2 moléculas y no 3, que se obtienen del NADH al O2.

Todos estos sistemas dentro de la cadena tienen características redox propias por la donación y la aceptación de electrones en distintos niveles de la cadena, para estudiar y analizar la dinámica de la cadena se utilizan por sus propiedades redox sustancias orgánicas no fisiológicas que se intercalan entre los transportadores, indicando el estado redox de la cadena, mostrando a través de las propiedades del indicador el estado de la reacción.

Por esta razón se utiliza el A.M que cuando se oxida por el O2 da un tono azul, pero este puede ser reducido de nuevo por el Succinato, ya que el A.M es mediador entre electrones, protones, O2 y sustrato que se oxida (Succinato). El A.M reducido es incoloro, mostrando la dinámica de reducción.

Por otra parte con la Succínico deshidrogenasa se emplea un aceptor artificial de hidrógenos que es la P.F.D. ( Parafenilendiamina )con la cual se ve la cadena respiratoria en su etapa final pues esta se oxida en presencia del alfa - naftol quedando de un color azul llamado azul de indofenol.

Así la P.F.D. es dadora de electrones para la siguiente etapa y el A.M aceptor.

En resumen es una cadena transportadora de electrones que oxida al sustrato y transfiere electrones por la cadena ligada a la traslocación de protones, formando en la membrana mitocondrial interna un almacén de energía.

PROCEDIMIENTO

Experimento N° 1: Demostración de la captación de hidrógenos por el azul de metileno e inhibición de la succínico deshidrogenasa.

• Coloque cinco tubos en una gradilla, enumere del 1 al 5 y prepárelos según el siguiente protocolo.

• Agregar enzima como se indica

• Mezcle por inversión

• No colocar vaselina en el tubo N° 5 y si del 1 al 4

• Tomar nota del tiempo que demora en decolorarse el azul de metileno

Experimento N° 2: Determinación indirecta de la citocromo oxidasa, usando PFD como indicador e inhibición de la enzima.

• Usar la enzima del experimento anterior.

• Tener cuidado con el cianuro de potasio KCN

• Preparar los 6 tubos según el siguiente protocolo.

• Agregue la enzima al final, agite los tubos con frecuencia y observar cambios de color inicial y final dentro del plazo de 15 minutos.

OBSERVACIONES

Experimento N° 1:

• Se ocupa el tampón de un pH casi neutro igual a 7,4 para mantener la conformación funcional tanto de la enzima como de las mitocondrias.

• Luego de 10 minutos de colocar la enzima en los tubos:

1 Azul intenso

2 Verde oscuro

3 Azul verdoso

4 Verde muy pálido

5 Decolorado

Experimento N° 2:

• Colores iniciales luego de 10 minutos a 37° C en baño termorregulador en los tubos:

1 Violeta oscuro

2 Café oscuro

3 Ocre

4 Violeta pálido

5 Violeta claro

• Luego de 15 minutos de haberlos sacados del baño termorregulador (25 minutos después) los colores son los siguientes en los mismos tubos:

1 Morado

2 Café

3 Ocre

4 Violeta oscuro

5 Plomo lila

6 Violeta claro

CONCLUSIÓN

1. Se ve el color azul por el azul de metileno oxidado ya que no hay enzima

2. Color verde oscuro por la mezcla entre el azul del AM y la enzima, puesto que no hay sustrato y la decoloración se detiene por la vaselina que impide la entrada de oxígeno al tubo

3. El color azul verdoso en este tubo se mantiene pues el tubo tiene malonato de Na que es un inhibidor de la reacción ocurriendo esta lentamente.

4. Color verde pálido casi sin color por la reducción del AM que es incoloro cuando se oxida y como no hay inhibidor la reacción es positiva.

5. Este tubo contiene una solución decolorada pero al agitarlo se colorea nuevamente puesto que no tiene vaselina que aísle el oxígeno del AM reducido, por lo tanto se oxida y se vuelve a colorear.

BIBLIOGRAFIA

• Bioquímica

Autores: Horton, Moran, Ochs, Rawn y Scrimgeour

Editorial “Prentice-Hall Hispanoamérica S.A.”

Mexico 1993

UNIVERSIDAD DE VIÑA DEL MAR

INGENIERÍA EN MEDIO AMBIENTE Y RR.NN

LABORATORIO N° 6

“CADENA RESPIRATORIA”