TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA CELULAR.

DESCUBRIMIENTO DE LA CÉLULA.

* Siglo XVII.

Podríamos decir que Robert Hooke fue el descubridor de la célula observando el corcho de un tapón por un microscopio fabricado por él mismo, observó una red con una seria de celdas y les acuñó el nombre de "célula" , les llamó así por que le pareció que eran similares a las celdas de los monjes de los monasterios.

Un contemporáneo suyo, fue Anton van Leeuwenhoek, un sastre irlandés que se ganaba la vida vendiendo topa y botones, tenía nociones de óptica y construyó unos microscopios de gran calidad, era autodidacta, se construyó unas lentes ópticas de gran calidad y poca aberración cromática.

Se echó al ojo cualquier muestra , sus descripciones fueron acertadísimas , descubrió a las bacterias, espermatozoides, hematies...describió los "animáculos" que se movían en una gota de agua.

Construyó microscopios para observar las telas y de ahí se pasó a estudiar toda una seria de muestras.

* 1830

No fue hasta 1830 que se generalizó a la "célula" como la unidad básica de la vida.

El primero en comentar este hecho fue Matthias Schleiden, un abogado que observó que toda planta esta constituida por células.

El segundo fue Theodor Schwann, que se encontró con Schleiden y compartiendo información descubrió que las plantas estaban formadas igual que los animales, por células.

• Las plantas están constituidas por células y el embrión deriva de una única célula.

• Las células de plantas y animales son similares en estructura y proponen los 2 primeros principios de la teoría celular.

Schwann propuso los siguientes principios:

1º Todos los organismo están formados por una o más células.

2º La célula es la unidad básica y funcional (estructural) de la vida.

* 1855

El 3º principio lo propuso Rudolf Virchow:

3º la célula procede de la división de una célula preexistente.

INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA CÉLULA.

• PROPIEDADES DE LA CÉLULA.

* Son estructuras muy complejas y organizadas que requieren gasto de energía para su mantenimiento.(fotocopias).

* Las células poseen un programa genético.

* Las células se dividen generando más células.

* Adquieren y usan energía por reacciones enzimáticas por el metabolismo celular.

* Las células llevan a cabo gran cantidad de reacciones químicas (metabolismo).

* Las células desempeñan actividades mecánicas (proteínas motoras).

* Son capaces de responder a estímulos.

* Las células se autoregulan.

• NIVELES DE ORGANIZACIÓN CELULAR.

Todas las células no son iguales, existen básicamente dos tipos muy distintos; Procariotas y Eucariotas.

Los eucariotas tienen un sistema interno de endomembranas que forman la membrana nuclear y los orgánulos intracelulares.

El objeto de estudio de la biología celular es la célula eucariota, (los procariotas son objeto de estudio de la Microbiología).

Todas las células eucariotas son parecidas están formadas por componentes similares, todas poseen lípidos, proteínas, tienen una estructura similar por que todas derivan de un precursor común que por un lado dio lugar a las bacterias verdaderas y por otro a un antecesor de Eukarya y Archaeas. (árbol filogenético, fig 1-5).

* Componentes principales de la célula eucariota.

Imagen de célula por microscopio electrónico de transmisión es una célula animal del epitelio donde se diferencian el núcleo , el material genético, nucleolo (formado por ARN-ribosómico), RER, REL, mitocondrias, aparato de Golgi, lisosomas, membranas lipídica...

No todas las células de los organismos pluricelulares son iguales.

* Forman tejidos: Los tejidos son agrupaciones de células con una misma función y estructura.Por ejemplo: las células del epitelio están formadas por un mismo tipo de células con la misma función y estructura, se relacionan entre si por desmosomas.

Tienen un anclaje físico y un anclaje químico (producen sustancias que afectan a las vecinas) con las células que les rodean.

* Las células se especializan (diferenciación celular) en los organismos pluricelulares, por ejemplo en los animales las células se especializan y adquieren una estructura particular que va a realizar un función concreta a partir de una única célula del embrión, que sufre división y forma distintas partes del organismo, como tejido muscular, tejido esquelético, tejido conectivo......

• NIVEL DE ORGANIZACIÓN CELULAR Y MOLECULAR.

Nota:

En esta asignatura al estudiar el nivel celular es imposible separarlo del nivel molecular, van unidos, por encimas de estos dos niveles nos podemos referir a los tejidos pero nada más.

Generalmente se trabaja a nivel del microscopio electrónico y dentro de este vamos a trabajar a nivel molecular, que a máximo aumento podemos observar estructuras de las moléculas aunque debemos recurrir a otro tipo de técnicas como la difracción de Rayos X...

Ejemplo: Vellosidad intestinal,

* MO: En una imagen de microscopio óptico se observa a nivel de tejidos (nivel tisular). Vemos la estructura.

* ME: Con el microscopio electrónico podemos observar a nivel celular, vemos la ultraestructura de la muestra.

Observamos las células piramidales con núcleos en posición central y sus nucleolos, las mitocondrias...

Al subir el aumento podemos observar mitocondrias con doble membrana, la matriz... nos movemos a nivel de la ultraestructura de la célula, observamos los ribosomas adosados al RER, en posición apical posee microvellosidades.

A mayor aumento podemos llegar a observar los filamentos de actina, es decir observar a nivel molecular, observamos la actina, formada por polímero de actina F.

* Si queremos observar la estructura de ese filamento debemos recurrir a técnicas bioquímicas como la difracción de rayos X, donde se podría observar la estructura del filamento de actina.

De forma parecida podemos observar la mitocondria (transparencia) a mayor aumento llegamos a poder observar el nivel molecular y observar las crestas mitocondriales donde hay ancladas unas moléculas en forma de peón llamadas ATPasas mitocondriales.

El ácido fosfotúnstico lo podemos usar para observar la tinción negativa, nos pone de manifiesto los contornos de las moléculas.

El microscopio electrónico tiene una resolución bastante buena.

• TAMAÑO DE LAS CÉLULAS Y COMPONENTES CELULARES.

Cuadro donde tenemos representado distintos tamaños en metros.

m-------ml--------m--------nm--------A

1-----10(-3)----10(-6)----10(-9)---10(-10)

Nivel celular:

• Podemos observar cosas con el ojo humano, la resolución del ojo humano en se 0,1 ml, es la capacidad de discernir dos puntos muy próximos.

Los puntos situados a menos 100 m o 0,1 ml los visualizamos como un solo punto, aunque realmente haya 2 puntos.

Con un ojo humanos podríamos ver una célula como las neuronas de las jirafas, dado que su longitud es mucho mayor que 0,1 ml, el huevo de una avestruz...

La mayoría de las células están por debajo de la resolución del ojo humano.

• La ameba (protozoo unicelular) mide menos de 100 m, una célula humana mide 10 m necesitamos observarlos con el microscopio óptico.

Las células eucariotas miden de 10-20 m

La células humanas miden unos 10 m y su núcleo está sobre 2- 3 m.

Las bacterias miden 1 m, aunque existen cianobacterias que miden más de 0,1 m y se puede observar con el ojo humano.

• El ribosoma de eucariotas están por debajo de la resolución del microscopio óptico (100 nm) no se pueden observar con este microscopio.

El poro nuclear tiene un diámetro similar al ribosoma y por tanto tampoco se pueden observar con este microscopio.

En estas situaciones debemos recurrir al microscopio electrónico.

Nivel molecular:

Se confunden el nivel celular con el molecular pues por ejemplo los ribosomas son un complejo proteico, al igual que la membrana plasmática (5 nm de espesor ) y pertenecen al nivel molecular, todo esto no se observa con el microscopio electrónico pues su resolución es de 1 A.

Nota:

Ojo humano: > 100m

Microscopio óptico: 100m - 100nm

Microscopio electrónico: 100nm - 1 A.

FUNDAMENTOS ÓPTICOS DE LA MICROSCOPÍA.

• MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO.

Imagen de microscopio óptico de campo claro (transparencias).

Lo que se ve es la muestra teñida sobre un fondo claro, observamos la luz transmitida por la muestra.

Microscopio de campo oscuro: observamos lo contrario.

AUMENTOS:

Se amplia la imagen con dos lentes: objetivo y ocular.

Los aumentos se calculan multiplicando los aumentos de las lentes ocular y objetivo, por tanto el mayor aumento de un microscopio óptico es de 1000.

PODER DE RESOLUCIÓN:

El aumento de un microscopio no tienen nada que ver con la resolución de este.

La resolución de un microscopio es la capacidad de diferenciar dos puntos próximos, determina la calidad del microscopio y es la inversa del límite de resolución,

LÍMITE DE RESOLUCIÓN:

El límite de resolución (D) es la distancia mínima entre dos puntos distinguibles.

A mayor poder de resolución mejor microscopio.

A menor límite de resolución mejor microscopio.

Para el ojo humano el límite de resolución es de 0,1 ml por que nos indica la distancia mínima a la que dos puntos son reconocidos como dos puntos distintos.

Se calcula por la fórmula:

D= (0,61).

(Nsin)

 -> longitud de onda de la luz incidente, a mayor , mayor límite de resolución, peor microscopio, lo importante de un microscopio óptico es la .

 = "Apertura angular" es la mitad del ángulo del cono de luz que entra en el objetivo procedente de la muestra.

N = " índice de refracción" del medio entre el objetivo y la muestra.

Nsin = "apertura numérica" depende de la calidad de la lente objetivo, nos indica la bondad de esa lente así a mayor apertura ,menor límite de resolución y mejor microscopio.

La luz transmitida por la muestra forma un cono cuyo ángulo es de 2:

D=1 cuando =90º este es el valor teórico máximo que es imposible de alcanzar.

El mayor ángulo que se consigue es de 70º, es el que recoge mayor información de la muestra.

Cuanto mejor sea la lente mayor cantidad de rayo van a coger y mejores son las lentes.

Se pierden 20º de luz a cada lado.

Índice de refracción:

Mide la curvatura de la luz sobre ese medio.

Se usa aceite de inmersión que consigue una mayor resolución.

El aire tiene un índice de refracción de 1.

Al aumentar el índice de refracción, aumenta la curvatura de la luz que incide sobre la muestra y entra mayor cantidad de rayos en la lente y por tanto aumenta la resolución del microscopio.

La calidad de la lente y el medio de inmersión influyen en la resolución del microscopio.

El máximo poder de resolución que se puede alcanzar con microscopio óptico:

=450nm (máximo del visible).

N=1,5=indice de refracción. D= 0,61 * 450 = 194

=70º (objetivo que recoge 140º). 1,5sen70

Microscopio electrónico de transmisión:

Lo que hacemos es incidir sobre la muestra un haz de electrones con una  asociada de 0,005 nm, muy inferior a la del visible, de manera que al ser un límite de resolución tan pequeño llegamos a un D=0,1 nm=1 A.

DIFERENCIA ENTRE LÍMITE DE RESOLUCIÓN Y AUMENTO:

Tenemos un microscopio con un determinado límite de resolución que permite que observemos un núcleo en el que se aprecian unos puntos que son los cromosomas.

Otro microscopio con límite de resolución menor y con mayor poder de resolución. El límite está por debajo del nivel de observación de los cromosomas por tanto podemos observar los cromosomas con los centrómeros y las cromátidas.

Cogemos otro microscopio con el mismo límite de resolución pero con mayor aumento , aumentamos la imagen al doble, observamos la misma imagen pero más grande, no nos da más información sobre la muestra, si tuviéramos menor límite de resolución observaríamos más estructuras del cromosoma.

Los microscopios ópticos poseen menos poder de resolución pero son adecuados según el estudio que queramos realizar.

Fotocopias: fotos de visiones de MO y ME.

MO: vemos la organización de la mucosa intestinal; el epitelio simple cilíndrico, observamos a nivel tisular, no lo podríamos observar con el ME pues veríamos directamente las células.

ME transmisión : observamos la ultraestructura de las células. Observamos las uniones ocludens, orgánulos...

ME barrido: da información sobre la superficie de las células.

MO de fluorescencia: da información sobre la localización de las moléculas en la célula. La membrana lateral y basal aparecen teñidas de verde por que existe una proteína marcada con un fluorocromo de color verde de esta manera se localiza una determinada molécula en un tejido o célula. Es una información complementaria a la que nos da el MO normal.

Tinción o contraste: las muestras biológicas deben colorearse o tratarse con metales pesados para aumentar el contraste. Se basan en las propiedades físico-químicas de la muestra.

• MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES.

Lo que observamos el la luz transmitida a través de la muestra.

La muestra no necesita procesamiento al contrario que en el MO de campo claro. Por tanto podemos trabajar con muestras vivas, sin manipular.

El contrate de fase se consigue por la diferencia de emisión de la luz entre las distintas partes de la muestra, por distinta intensidad de luz.

El MO de contrate de fase es similar al de campo claro (fotocopias).

Posee un componente entre la lente objetivo y la ocular llamado anillo de fase que aprovecha las propiedades de difracción y refracción de la muestra.

La luz que no atraviesa la muestra estará en una fase concreta y la que atraviesa la muestra en otra distinta pues posee índice de refracción distinto.

La fase se retrasa con respecto a la luz que no atraviesa la muestra, pero son diferencias tan pequeñas que no se detectan por el ojo humano, por eso se coloca un anillo que convierte esas pequeñas diferencias o retrasos en grandes diferencias de intensidad de luz para que nuestro ojo sea capaz de percibirlas.

La muestra se observa brillante, por que la aumenta la intensidad de los rayos de luz, aparecen emitiendo más luz.

La ventaja en que se observan las muestras vivas.

La desventaja es que pequeñas diferencias de difracción no consigue obtener contraste suficiente en la distintas partes de la célula, por lo cual no se puede observar su contenido.

Por todo esto se denomina MO de contrate de fase, consigue el contraste por la diferencia de fase que llevan los rayos que se transmiten por la muestra.

Refracción: cambio en la velocidad de la luz al entrar en un medio de distinto índice de refracción. Lo que detecta el microscopio es la diferencia de FASE.

Difracción: es el proceso por el cual la luz encuentra un punto opaco que no puede atravesar y sale despedida en todas direcciones.

Los contrastes se consiguen por cambios de intensidad de la luz, debido a un retraso de la luz debido a la baja velocidad de los rayos.

• MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.

Localización de moléculas en la célula.

Se basa en la fluorescencia, capacidad de los fluorocromos de emitir luz cuando son iluminados con una determinada luz de una determinada  llamada " de excitación", emiten luz en una  distinta llamada " de emisión".

"Excitación" "fluorocromo" "emisión"

Existen flurocromos que tienen una excitación y emisión particular por lo que podemos trabajar con distintos tipos:

Color verde(emisión) FITC (tiocianato de fluoresteina).

Color rojo TRITC (tiocianato de tiorodomina)

Color azul DAPI marca ADN.

Problema del DAPI: Excitación es en UVA.

Se incide luz sobre un espejo docroico, incide sobre la muestra y emite luz que vuelve a pasar por el espejo e incide en el ojo.

Se le llama de epifluorescencia por que la luz incide por encima de la muestra a través del objetivo y recoge la luz que emite el fluorocromo.

El espejo dicroico dependiendo de la  que le llega la refracta o la deja pasar.

emisión> excitación pues existe pérdida de energía.

Fotografía; microfilamento de actina teñidos con fluorocromos.

Hay muchas posibilidades de marcar las proteínas con fluorocromos, normalmente se usan anticuerpos marcados con los fluorocromos.

• ME DE BARRIDO CONFOCAL:

Es parecido al de fluorescencia.

Sirve para detectar fluorescencia, tiene más ventajas, mejora la calidad de la imagen por que permite visualizar la fluorescencia presente en un único plano del foco.

Foto: ovocito en división, fluresteina.

1º MO fluorescencia es una imagen no nítida.

2º ME barrido confocal. la definición de la imagen es mejor, podemos observar los husos cromáticos.

MF: en células en suspensión en el medio están flotando son redondas y cuando se observan , vemos la fluorescencia que emiten todos los planos en volumen, tenemos superpuesta toda la fluorescencia de la célula. Tenemos que observarla célula en cultivo para verla más nítida.

MBC selecciona el plano que queremos, únicamente vemos fluorocromo de ese plano, podemos recorrer la célula de un lado a otro, plano por plano. Generalmente lo hace en profundidad.

La fuente de luz en el MBC es un láser muy intenso y concentrado que ilumina un punto en cada imagen, se va desplazando por un determinado plano de foco que hemos seleccionado previamente, al final vemos el sumatorio de todos esos puntos (igual que ocurre con la televisón).

Las aplicaciones son las mismas que con el MF, se usa para la localización de moléculas en células con el uso de los fluorocromos.

Definición, calidad de imagen y resolución mucho mejor que con el MF.

MBC es ideal para estudios de colocalización de moléculas, estudios de si dos moléculas aparecen en la célula en igual posición.

A veces no hace falta fijar la muestra, se puede trabajar con células vivas. Que además evitan los procesamientos y la inclusión destruyen los anticuerpos y no podríamos ver nada. Además permite trabajar a muy elevada resolución en MO pues es de alta resolución óptica.

• ME DE TRANSMISIÓN:

Es igual que el MO, se diferencian en que en vez de luz usa un haz de electrones que se aceleran por diferencias de potencial en una columna del microscopio.

Tiene lentes electromagnéticas, además el ocular se proyecta en una pantalla y no se llama lente ocular.

El haz de electrones corre a través de la columna en vacio, y lo que observamos es la luz transmitida.

Donde hay baja cantidad de metales pesados atraviesa la muestra y se observa oscuro y donde hay muchos metales pesados no atraviesa la muestra y se observa claro (electrodensas).

También se llama de alto voltaje.

• ME BARRIDO:

El haz de electrones barre la muestra y observamos los electrones que dispersa la muestra.

Se suele hacer un sombreado con oro y dependiendo de la superficie se dispersa de distinta forma, se recoge en detectores por encima de la muestra. (se detectan los electrones dispersados).

Poder de resolución: MET>MEB

TÉCNICAS ESPECÍFICAS PARA ESTUDIO DE MUESTRAS EN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN.

Se dan en citología.

Imagen en MET-> se ve el núcleo.

Imagen de MEB-> superficie de bacteriófago infectando a una célula.

Imagen de MEB-> insecto.

Son técnicas relacionadas que sirven para lo mismo: tinción negativa y sombreado metálico. Se usan para estudiar detalles topológicos de las moléculas, (nivel molecular).

Tinción negativa:

Imagen con tinción negativa del virus del mosaico de tabaco (fotocopias).

Se realiza con un metal pesado llamado ácido fosfotunstico se introduce en los recovecos de la muestra y queda rodeada por el ácido.

La muestra la vemos poco electrodensa, lo que vemos es el negativo de esa molécula. Las partículas virales, están rodeadas por el ácido y se ven claras , se observa el cilindro central por que el ácido se introduce por los extremos y se tiñe todo el interior.

El sombreado metálico:

Cubrimos la muestra con una capa de metal que tiene elementos pesados que dispersan los electrones. Se podría confundir con el MEB pero el MET posee mayor poder de resolución y podemos observar más detalles.

El sombreado se hace igual que en barrido.

Se usa campana de vacío con un alambre metálico de oro o platino. Se pone incandescente y emite átomos (metal) que se deposita sobre la muestra.

La posición de filamento metálico no es encima de la muestra, se desplaza a un lado, inciden sobre la muestra en un ángulo determinado distinto a 90º, normalmente es de 70º aunque se puede variar. Esto da lugar a sombras pues se acumula una mayor concentración de metal pesado a un lado de la muestra que ha otro. Así conseguimos contratar unas zonas con otras, donde hay más metal atraviesa menos los electrones, aparece como más oscura, es mas electrodenso.

Las zonas de sombra son zonas donde hay menos cantidad de metal y es menos electrodenso.

Observamos la topografía de la muestra por las sombras que crea el metal.

Replica :

La réplica del metal se hace sobre muestras con sombreado.

La muestra se puede eliminar y observar solo la sombra o topografía.

Criofractura:

Es la ruptura de la muestra por frío. Trabajamos con muestras congeladas (fijación por congelación) la congelación se puede hacer por ejemplo con nitrógeno líquido, se encuentra a -196 ºC , de esta forma el agua de las células no forma cristales que romperían su estructura.

Se introducen en campanas, y con una cuchilla se golpea, no corta la sección, al estar frío se rompe por el plano de fractura.

Por ejemplo; Se suele realizar para separar las dos monocapas de la membrana lipídica.

Las dos monocapas se separan, las proteínas quedan en uno u otro lado de la monocapa.

Sombrado:

Se aplica un sombrado metálico (la criofractura siempre va seguida de sombreado metálico) con un ángulo concreto de incidencia.

Réplica:

Una vez obtenida la réplica se deposita una capa de carbono cuya función es la de darle consistencia y poder eliminar la muestra y no interfiere para nada por que no es electronodenso.

Existe un electrodo de carbono que tiene un ángulo de incidencia de 90º y nos recubre toda la muestra por igual.

Eliminamos la muestra descongelándola para poder estudiar su topografía en el microscopio, así nos aseguramos de que no desaparece la muestra o se destruye.

Foto-> poro nucleares , los podemos estudiar con esta técnica.

Autoradiografía:

Permite localizar moléculas en células por radioactividad, ahora se usa menos. Se usan más las técnicas con anticuerpos aunque a veces se usan por que no podemos usar anticuerpos.

Incubamos la muestra con un isótopo radiactivo y luego se prepara para observarlo en un porta.

Los cortes ultrafinos se sumergen en una emulsión sensible a la radiación, (emulsión con glicerina) en una habitación oscura, precipita la plata de esa emulsión sobre las zonas donde estaba la radiactividad, precipita como plata metálica que posee alto Pm y nos dispersa los electrones.

Foto-> puntos negros son zonas donde ha precipitado la plata y por tanto donde hay radiactividad, el compuesto radiactivo era (+35)PSO4 aparece en el Golgi. (modificación postraducciónal de proteínas = sulfatación de proteínas).

Foto -> cromosoma politénico con UTP-tritio (H +3).

Aparece una zona altamente densa del cromosoma es la zona para la síntesis de ARN son zonas de transcripción activa de genes donde la cromatina está menos compacta.

Se hacen experimentos con isótopos radiactivos de "caza y pulso".

Preguntas de clase:

¿por qué se usa más el MBC que el MF para colocalización de moléculas?.

Se usa más el Microscopio de barrido confocal para estudios de colocalización de moléculas por que posee más resolución que el microscopio de fluorescencia y por la capacidad del microscopio electrónico de barrido confocal de observar dos moléculas en un solo plano del volumen de la muestra.

Anti-actina (verde)=FITC

Anti-tubulina (rojo)= TRITC

La célula tiene un volumen y hay moléculas marcadas en distintos planos, con el MF se transforman en una imagen bidimensional donde se superponen la autofluorescencia de cada plano por tanto si hay moléculas en distinto plano que se superponen se observan de color amarillo y da la impresión se que colocalizan y están en el mismo punto de la célula, por tanto es un error.

Amarillo = actina (verde) + tubulina (rojo)

Con el MBC observamos plano por plano y entonces vemos las distintas secciones de forma individual.

Actina.

Tubulina.

Observamos que en realidad no colocalizan, están en planos distintos pues se observan en distintas secciones.

¿qué experimento harías para observar la proliferación de las células de la piel?

AUTORADIOGRAFÍA:

Experimento para observar la tasa de renovación de la piel por autoradiografía.

Marcamos el ADN de las células que se dividen con un nucleótido marcado radiactivamente. Las células en división estarán marcadas al incorporar ese nucleótido.

dUTP (32) no existe como tal en la naturaleza.

Si incorporamos dCCP (32) puede formar dTTP (32)

También se usa d CTP (32) que se puede obtener de distintas casas comerciales.

Unicamente las células en división van a incorporar el nucleótido y van a emitir radiactividad.

Experimento:

Ponemos dUTP (32) en ratón, lo pinchamos en la zona por debajo de la piel durante un tiempo determinado pues si lo dejamos de forma permanente se marcarían todas las células del tejido y se puede observar la radiactividad en distintas zonas.

Es un experimento de "pulso y caza" ya que ponemos el nucleótido durante un tiempo determinado (pulso), dependiendo del proceso (de la cinética de la reacción que tenga lugar) va a ser mayor o menor, por ejemplo en marcaje de ADN con 30´ es suficiente para que se incorpore en el ADN, tras ese período se retira el nucleótido marcado y se sustituye por nucleótidos no marcados. Se toman muestras a distintos tiempos (caza) . (Se suelta el nucleótido y se va a por su captura).

Lo que ocurre es que la radiactividad va ascendiendo por los distintos estratos de la piel; 1º lo vemos en el estrato germinativo y al final vemos como llega al estrato espinoso conforme se va perdiendo la radiactividad de los estratos basales, las ultimas células pierden ya el núcleo y por tanto la radiactividad.

MARCAJE CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES.

Marcaje sin usar radiactividad , se usa también moléculas no radiactivas.

Con estas técnicas la persona que manipula la muestra no corre riesgos, se usan anticuerpos fluorescentes.

Marcamos el ADN para saber que células se dividen.

El nucleótido que debemos incorporar a la célula es un nucleótido modificado, es el bromo desoxiuridina (Br-dUTP) es el antígeno. Existen anticuerpos comerciales específicos contra Br-dUTP .

Las células incorporan Br-dU , usamos los anticuerpos que reconoce Br-dU y que además llevan incorporado la fluorescencia.

La preparación la observamos con MF o MBC ( con MBC no necesitaríamos hacer cortes de la muestra).

Este también es un experimento de "pulso y caza".

Si marcamos moléculas y queremos tener una mayor resolución usamos el MET y marcamos los anticuerpos con metales pesados (oro).

Con las técnicas de anticuerpos podemos trabajar en MO y ME.

TEMA 2: TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS PARA MO Y ME.

HISTOQUÍMICA:

"Conjunto de técnicas que permiten la identificación , localización y cuantificación de una sustancia en un tejido o en una célula".

Las técnicas histoquímicas son un conjunto de técnicas usadas para la localización de moléculas, dependiendo del nivel donde estemos trabajando se llamarán histo-químicas (tejidos) o citoquímicas (célula) aunque ambos términos se usan como sinónimos.

Estas técnicas se usan tanto en MO como en ME. Son por ejemplo el PAS (histoquímica de glúcidos), Sudan III (histoquímica de grasas)...

Existen distintas técnicas para la localización de los distintos componentes en la célula.

Antes del uso de los anticuerpos, estas técnicas eran las únicas que podían servir para detectar estos componentes, ahora se usan técnicas inmunohistoquímicas o inmunocitoquímicas que son más potentes.

Existe otro grupo de técnicas que son las pruebas para localizar reacciones químicas que se llaman técnicas de histoquímica de enzimas o histoquímica enzimática.

HISTOQUÍMICA DE GLÚCIDOS.

Reacción del ácido periódico de Schiff. (PAS).

Revela la presencia de polisacáridos (glucógeno, almidón y celulosa) y glucosaminoglicanos neutros (mucinas).

Utiliza el reactivo de Schiff (fucsina básica decolorada con ácido sulfuroso).

El reactivo de Schiff reacciona con aldehidos libres del tejido formando una estructura compleja, se oxida y pasa a ser de color rosa, por tanto donde tenga lugar esa reacción se verá de color rosa debido a la fucsina.

Aldehidos libres hay pocos en el interior de la célula y los polisacáridos no tienen aldehidos libres, nosotros a través de una reacción previa generamos los aldehidos libres en los polisacáridos.

El ácido periódico reacciona con los grupos alcoholes de carbonos adyacentes (grupos glicoles) de los polisacaridos y forma los aldehidos.

Si aplicamos la fucsina, reaccionará con estos aldehidos libres dando el color rosa.

Esta técnica se usa por ejemplo para observar las células caliciformes del intestino (mucinas).

Este tipo de reacciones histoquímicas necesita de un control para asegurar que esa reacción es específica y que de verdad ponemos de manifiesto lo que queremos.

El control por ejemplo es la utilización de amilasa (degrada los polisacáridos) de manera que si al tratar la muestra con amilasa y realizar esta técnica nos sale la reacción negativa ( no se tiñe) es que realmente la fucsina tiñe a los polisacáridos, si por el contrario la técnica sale positiva quiere decir que la fucsina tiñe algo que no son los polisacáridos pues estos ya no están en la muestra (han sido degradados con la amilasa).

Azul alcián.

Pone de manifiesto polisacáridos como glucoamoniglicanos ácidos (proteoglicanos o mucinas ácidas), estos aparecen mucho en el hueso, en la matriz del tejido conjuntivo y conectivo.

Dependiendo del pH podremos identificar unos GAG u otros, es decir, podemos identificar los polisacáridos solamente cuando el pH al que se hace la reacción está por debajo del punto isoeléctrico del polisacárido en cuestión, de manera que nosotros vamos aumentando el pH, cuando este alcanza el punto isoeléctrico de un GAG determinado cambia el color en la zona donde esté ese GAG.

Cada glucosaminaglicano posee distinta acidez de manera que al cambiar el pH podemos poner de manifiesto unos polisacáridos u otros.

Podemos ver si hay varios GAG y podemos saber cuantos hay.

A pH=7 todos se tiñen por que todos son ácidos a ese pH.

Trabajando a distinto pH podemos diferenciarlos pues se tiñen dependiendo de su punto isoeléctrico.

HISTOQUÍMICA DE GRASAS.

Sudán y tetraóxido de osmio.

Pone de manifiesto grasas al disolverse en ellas.

El tetraóxido de osmio es también un buen fijador para ME aunque también se puede hacer con él estudios de MO. Posee un color oscuro (muy negro).

En estas técnicas lo importante es el procesamiento de la muestra o tejido.

HISTOQUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Reacción de Feulgen:

Es la más usada, nos pone de manifiesto el ADN.

También usa el reactivo de Schiffque pone de manifiesto aldehidos libres.

Tenemos que realizar un control por ejemplo tratar la muestra con ADNasa, de manera que se destruye el ADN de la célula y la reacción da negativo.

Generamos los aldehidos libres en la ribosa del ADN . el aldehido no está libre por que reacciona con la base nitrogenada por un nitrógeno a través de un enlace N-glicosílico.

Tratamos el tejido con ClH a 95º que libera las purinas del ADN pues rompe el enlace N-glicosílico y conseguimos el aldehido libre en la ribosa. Este aldehido es el que reacciona con la leucofucsina dando color púrpura donde haya ADN.

El Feulgen se diferencia del PAS en la 1ª reacción, pues en el Feulgen generamos los aldehidos libres por hidrólisis ácida de las purinas de la ribosa.

El ARN no se tiñe con esta técnica por que con la hidrólisis ácida se degrada completamente el ARN, es más lábil.

Tinción verde de metilo-pironina.

Son colorantes catiónicos que ponen de manifiesto el ADN (verde de metilo) y el ARN (pironina=rojo). Usamos 2 colorantes distintos.

Ponemos de manifiesto el núcleo de la célula que se observa de color verde y el nucleolo que se observa rojo por la pironina.

Núcleo

nucleolo

La composición del nucleolo es ARN-ribosómico.

También informa sobre el estado de proliferación de la célula por que existe una correlación muy buena entre número de nucleolos y la actividad proliferativa de la célula. Por tanto a mayor división celular ,mayor numero de nucleolos.

Por ejemplo en las células tumorales aparecen de 2-5 nucleolos.

El nucleolo es una estructura transitoria de la célula, pone de manifiesto la síntesis de ribosomas en la célula. Una célula con una alta tasa de división necesita un mayor número de proteínas y por tanto necesita un mayor número ribosomas.

Esta técnica nos permite saber más sobre el nucleolo.

El control lo realizaríamos con ADNasa y/o ARNasa.

HISTOQUÍMICA DE ENZIMAS.

Ponen de manifiesto una actividad enzimática en un tejido o célula. También se llaman "citoquímica de enzimas".

Se usan para MO y ME.

El fundamento es similar al de las técnicas bioquímicas para determinar una actividad enzimática concreta. Con esta técnica podemos localizar en la célula donde se da esa reacción enzimática.

Debemos preservar la actividad del enzima, es decir que el procesamiento no debe ser el clásico (inclusión en parafina) pues destruye la actividad enzimática aunque esto depende del enzima pues algunos resisten a esos procesamientos.

• Las técnicas que podemos usar para determinar la actividad de enzimas lábiles es por ejemplo la congelación (método físico) que sirve para fijar y también sirve de medio de inclusión para cortar la muestra en un criostato, así se preserva la actividad del enzima.

• Debemos trabajar en condiciones fisico-químicas de osmolaridad, temperatura y pH adecuadas, debemos tener un control de estas variables.

-Las condiciones de osmolaridad y temperatura dependen de la especie en la que estemos trabajando.

-El pH dependen del enzima con la que trabajemos no de la especie en cuestión.

• El producto de la reacción del enzima debe ser insoluble, es lo que lo diferencia de los fundamentos de determinación de la actividad enzimática que debe ser soluble para poder medir la absorvancia. Debe ser insoluble por que debemos verlos donde esté la actividad enzimática (donde precipita) si no se dispersaría en el medio y no veríamos nada.

• Debe tener color para poder verlo en el MO o debe ser electronodenso (disperse los electrones) para poder verlo en el ME.

El tetróxido de osmio es electronodenso, también el acetato de uranilo, citrato de plomo...dependiendo de la reacción debemos usar uno u otro. Debe llevar metal pesado que son los electronodensos.

Foto=sección de nefrona a distintos niveles, lo que aparece de negro es la fosfatasa ácida (lisosomas) se observan las células donde están, no se aprecian los compartimentos donde están.

INMUNOCITOQUÍMICA.

Nota:

Inmunoglobina G:

2 cadenas pesadas H y 2 cadenas ligeras L

región Fc= propiedades biológicas (activación del complemento, opsonización...)

región Fab= unión de anticuerpos.

Anticuerpos son divalentes, poseen dos regiones de unión a antígenos que son iguales.

Cada linfocito solo produce un tipo de cadena pesada y un tipo de cadena ligera.

Se basan en la detección y localización de una molécula (antígeno) en un tejido o célula mediante el uso de un anticuerpo

Han desplazado a las técnicas anteriores y son los más usados en la actualidad.

Tienen una limitación y es la de disponer de anticuerpos específicos contra la molécula que queremos detectar o poner de manifiesto. Si disponemos del anticuerpo son muy sensibles, rápidas...

Comparten el mismo fundamento que las técnicas bioquímicas de ELISA/RIA y Western. Aunque las técnicas de inmunocitoquímica sirven para localizar moléculas y el resto para cuantificar (ELISA/RIA y Western).

La histoquímica de enzimas se aplican sólo a reacciones enzimáticas en cambio la inmunocitoquímica pone de manifiesto cualquier molécula de la célula, incluso moléculas de bajo Pm (actenos-> moléculas de bajo Pm pero que son incapaces de generar por si solos anticuerpos contra ellos).

Lo importante de estas técnicas es que preservemos la estructura del ag para que el ac pueda reaccionar, es decir que no perdamos el ag en el procesamiento de la muestra. Para evitar esto hacemos varias pruebas empíricas con distintos procesamientos hasta ver cual es la más adecuada.

Otra posibilidad es realizar la reacción ag-ac antes de procesamiento.

Tradicional; la reacción ag-ac se realiza después del procesamiento, se realiza poniendo los cortes sobre el porta y adicionando el ac, luego se observa la reacción.

Reacción ag-ac se realiza antes de la fijación cuando el ag es lábil. Por ejemplo en células aisladas hacemos la reacción sobre las células vivas y se procesan (fijación, dehidratación, inclusión y corte).

Estas técnicas se usan para ME y MO.

Para MO existen varias técnicas alternativas, para ME solo hay una técnica.

Inmunocitoquímica para MO.

Las más usadas son fluorescencia, PAP (peroxidasa antiperoxidasa) y sistema Biotina-avidina/estreptavidina

Técnicas de fluorescencia:

También se llaman técnicas de inmunofluorescencia.

Detecta reacciones ag-ac con fluorescencia usando el microscopio de fluorescencia o microscopio de barrido confocal.

Por ejemplo tenemos una sección en un porta, sobre ella adicionamos un ac para las moléculas que queramos poner de manifiesto y ese ac va conjugado con un fluorocromo (FITC y TRICT).

DIRECTA: usamos un sólo anticuerpo que lleva unido el fluorocromo y con especificidad del ag.

Por ejemplo: localización de los filamentos de actina en fibroblastos de ratón. Necesitamos anticuerpos anti-actina hechos en otro animal por ejemplo en conejo.

Fluorocromo

(TRICT)

Anti-[actina de ratón]

Actina de ratón

INDIRECTA: usamos dos anticuerpos; el primero reconoce al ag que queremos localizar y el segundo unido al fluorocromo y que reconoce al primero. Generalmente es la que más se usa. Tenemos:

• un 1º ac que es anti-[actina de ratón] hecho por ejemplo en conejo.

• un 2º ac que es anti-[Ig G de conejo] hecho por ejemplo en cabra.

fluorocromo

anti-[Ig G conejo] anti-[actina de ratón]

actina de ratón

Se usa más por que del 1º anticuerpo que se usa para detectar el ag en el tejido hay muchos, pues dependiendo del tipo de ag y de la especie del ag, el anticuerpo debe tener especificidad diferente. El 1º anticuerpo se pueden generar en el laboratorio basta con inyectar el ag en un conejo o en una cabra (en una especie distinta a la especie de la que proviene el ag). Para la técnicas directas se marca este 1º anticuerpo con el fluorocromo, esto es más caro y más laborioso que el método indirecto que le basta con comprar un tipo de anticuerpo marcado con fluorocromo contra una determinada especie, y asi los 1º anticuerpos no tendremos que marcarlos. Podemos usar los 2º anticuerpos para distintos experimentos.

Ejemplo: para detectar 10 moléculas diferentes en la técnica indirecta necesitamos 10 anticuerpos primarios específicos contra cada una de las 10 moléculas (1ac/molécula), pero solo necesitamos un anticuerpo marcado con fluorocromo para hacer la reacción inmunocitoquímica.

Con la técnica directa necesitaríamos marcar los 10 anticuerpos primarios.

DOBLE: podemos hacer una técnica inmunocitoquímica doble. Usamos dos anticuerpos primarios , puede ser directa si los anticuerpos están marcados con fluorocromo (cada anticuerpo con un fluorocromo diferente) o indirecta si usamos anticuerpos secundarios, se suele usar cuando no tenemos el 1º ac marcado con fluorocromo. Resulta más fácil hacer la doble indirecta por no tener que marcarlos anticuerpos primarios.

DOBLE DIRECTA

Fluorocromo fluorocromo

Anti-[actina] anti-[tubulina]

Actina de ratón tubulina de ratón

DOBLE INDIRECTA

Fluorocromo fluorocromo

(TRICT) (FITC)

Anti-[Ig G] anti-[Ig G]

Anti-[actina] anti-[tubulina]

Actina tubulina

Inmunofluorescencia:

Directa: 1 ac

Simple: ponemos de manifiesto 1 ag.

Doble: ponemos de manifiesto 2 ag. (colocalización- MBC)

Indirecta: 2 ac.

Simple: 1 ag.

Doble: 2 ag.

Problema:

Si los anticuerpos primarios se han hecho en la misma especie animal por ejemplo en el conejo, sus regiones Fc son iguales, los 2º anticuerpos no distinguirían entre ellos y los marcarían por igual.

Por ejemplo:

Tenemos dos anticuerpos primarios; anti-actina de ratón y anti-tubulina de ratón ambas hechas en conejo.

Tenemos un segundo anticuerpo; anti-Ig G de conejo marcado con dos fluorocromos distintos pero que se unirá a los 1º anticuerpos por región Fc que es igual en ambos anticuerpos (antiactina y antitubulina), pues ambos anticuerpos están hechos en la misma especie.

Solución:

Los anticuerpos primarios los hacemos en dos especies diferentes para que sus regiones Fc sean diferentes, por ejemplo, antiactina hecha en conejo y antitubulina hecha en cabra.

En este caso los segundos anticuerpos tienen que ser anti-[Ig G de conejo]-TRICT y anti-[Ig G de cabra]-FICT.

Cuando observamos la muestra por el microscopio:

Verde = FICT = Tubulina.

Rojo = TRICT = Actina.

si los 1º anticuerpos son de la misma especie y no tenemos otros anticuerpos, realizamos:

• 1ª reacción ag (actina) - ac anti-actina.

• 2º reacción 2º anticuerpo marcado contra anti-actina.

• 3ª reacción ag (tubulina)- ac anti-tubulina.

• 4ª reacción 2º ac marcado contra anti_tubulina.

Esto posee el problema de que cuando echamos el 2º anticuerpo contra la tubulina se establece un equilibrio con el 2º anticuerpo de la actina, pues la reacción ag-ac no es covalente.

La solución es hacer que la reacción anti-[actina]----anti-[IgG] sea permanente usando un fijador. A esto se le llama "bloquear".

Para MO usamos como fijador al paraformaldehido

Para ME usamos como fijador al glutaraldehido .

La primera reacción se trata con vapores de paraformaldehido, el paraformaldehido es sólido, se mete en una cámara y se sube la temperatura, emite vapores y fija la reacción ag-ac.

En la segunda reacción echamos el 1º anticuerpo anti-tubulina y luego el 2º anticuerpo anti-IgG. Esto se puede hacer siempre que el 2º anticuerpo de la segunda reacción sea estable y soporte este procesamiento, también depende del antígeno.

Si no sale lo probamos al revés, hacemos primero las reacciónes de la tubulina y luego las de la actina y si sigue sin salir recurrimos a hacer los anticuerpos en especies distintas.

• 1ª reacción ag (actina de ratón) - ac anti-actina. lavamos

• 2ª reacción 2º anticuerpo marcado contra anti-actina. Lavamos.

• 3ª fijamos con vapores del paraformaldehido. Lavamos.

• 4ª reacción ag (tubulina)- ac anti-tubulina. Lavamos.

• 5ª reacción 2º ac marcado contra anti_tubulina. Lavamos.

CONTROLES DE PREADSORCIÓN.

Se usan para saber si la reacción ag-ac es específica

Si se usan anticuerpos comerciales a la dilución que aconseja la casa comercial no suele haber problema.

Si el anticuerpo está preparado por nosotros debemos saber la dosis a la que está el anticuerpo en la dilución, pues el anticuerpo debe estar a una concentración apropiada ya que :

Si la concentración es demasiado baja; no se da la reacción, hay pocos anticuerpos y no observamos nada.

Si la concentración es demasiado altas se producen reacciones inespecíficas, el anticuerpo se pega a sitios del tejido de forma inespecífica.

Debemos hacer varias diluciones y ver cual es la apropiada.

La concentración óptima es la concentración a la que se satura el sistema. Por más que aumentemos la concentración, no se da más reacción específica.

Reacción

ag-ac específica.

opt [Ag]

Debemos determinar la concentración de unión específica óptima que depende del anticuerpo y del antígeno.

Podemos hacer un control para saber si esa reacción es específica y si lo que observamos es debido únicamente a la reacción específica:

Mezclamos el anticuerpo primario con el antígeno soluble. Cogemos el anticuerpo anti-actina lo incubamos con actina soluble de forma que los sitios de unión específica quedan bloqueados. Puede que:

Al mezclar anti-actina=[actina soluble] con el tejido o muestra, no obtenemos la reacción anti-actina=[actina tejido] por que posee los sitios de unión bloqueados con la actina soluble. Da reacción negativa.

no reacción.

actina soluble

actina del tejido

Al mezclar anti-actina=[actina soluble] con el tejido o muestra, la reacción da positivo, por tanto la reacción no es especifica, estamos trabajando con altas concentraciones de anticuerpo y se unen a otras proteínas de forma inespecífica o que el anticuerpo tiene afinidad por otros antígenos que no son actina.

"Reactividad cruzada"

La reactividad cruzada es ver si un anticuerpo contra una determinada especie reacciona con un antígeno de otra especie distinta.

Ejemplo:

Tenemos un anticuerpo anti-[actina de ratón] hecho en conejo y queremos ver si ese anticuerpo nos sirve también para detectar la actina de la ameba.

Para usar ese anticuerpo tenemos que saber si esa molécula (actina) está conservada durante la evolución o no. Si está muy conservada lo normal es que el anticuerpo reaccione con ella, pues estará conservada la zona que reconoce del antígeno el anticuerpo.

Es aconsejable hacer un control para ver si la anti-[actina de ratón] funciona de forma específica con la actina de la ameba. Por ejemplo:

1ª reacción anti-[actina de ratón] con actina de ratón y la incubamos en la ameba.

Reacción positiva= la unión es inespecífica. Es decir que el anticuerpo estando bloqueado con la actina del ratón ha reaccionado con algo en la célula.

Reacción negativa= no detecta la actina en la ameba por estar bloqueado con la actina del ratón. No se une a nada más de la célula.

En general :

1º se comprueba si ese anticuerpo hace reacción con algún antígeno en la célula: ponemos anticuerpo anti-[actina de ratón] en la ameba, si la reacción es positiva puede que sea específica o que reaccione con otro antígeno de la célula.

2º se comprueba si es específica o no, es decir, si conlo que reacciona de verdad es con la actina de la ameba para ello hacemos el control .

Peroxidasa antiperoxidasa (PAP).

Es una técnica indirecta.

1º adicionamos al tejido el anticuerpo anti-[actina] que se pega al antígeno (actina).

2º adicionamos segundo anticuerpo anti-[Ig G de conejo] contra el primario anti-[actina].

El anticuerpo 2º es el GAR= "goat anti-rabbit"= "anti-conejo de cabra". Se pone en exceso.

3º se adiciona el complejo PAP que está formado por dos moléculas de anticuerpo antiperoxidasa hechas en conejo y tres moléculas de peroxidasa.

Está basado en la propiedad divalente de los anticuerpos, se usa un anticuerpo como puente entre el anticuerpo 1º y el 3º.

GAR PAP

Anti-[actina de ratón]

En esta técnica colocamos una enzima en el lugar donde ocurre la reacción.

La actividad peroxidasa se pone de manifiesto usando diaminobenudina (DAB) y H202 .

La peroxidasa oxida al DAB con el H202.

La DAB oxidada es de color marrón oscuro-negro y además es insoluble en agua, precipita sobre la zona donde ha ocurrido la reacción ag-ac.

También se puede usar el 4-cloronaftol que de igual forma se oxida con el H202 por la peroxidasa.

4cloronaftol + H202 producto oxidado azul insoluble.

La DAB se usa generalmente por que también es insoluble en alcohol y esto es útil durante el procesamiento, en la deshidratación y montaje no desaparecen y se puede montar con bálsamo con el que resiste más tiempo la preparación. Tiene el inconveniente de que es tóxico.

El cloronaftol es soluble en alcohol, no se puede deshidratar y entonces montamos con glicerina que no se puede conservar durante mucho tiempo.

La ventaja del PAP frente a inmunofluorescencia es que es más sensible, el PAP detecta antígenos en menor concentración en la célula, que son incapaces de ser detectados con inmunofluorescencia.

Es más sensible el PAP por que la sensibilidad se amplia usando una enzima ya que mientras que el enzima esté activo está generando moléculas de color, además por cada anticuerpo que lleva unido el tejido tiene 3 enzimas, por tanto da tres veces más de color.

Se pone 3 enzimas por que es el único complejo que se puede formar entre 3 peroxidasas y 2 anticuerpos debido a los impedimentos estéricos entre el nº de enzimas y de anticuerpos, da lugar a un complejo molecular formado por 5 moléculas (3 enzimas -2 anticuerpos).

El anticuerpo secundario debe estar en exceso por que favorece que la interacción sea con una sola valencia y que la segunda valencia quede libre para unir el PAP.

Ag + ac ag-ac