Lección 1. Los virus. Características generales.

Esquema del tema:

1. Desarrollo histórico de la virología.

La Virología es la materia que se ocupa del estudio de los virus. Es interesante su estudio en Farmacia por:

• Importancia clínica de estos seres. Son los causantes de numerosas enfermedades.

• Los virus son importantes herramientas en investigación. Utilizando virus se ha avanzado en la Biología Molecular, conocimiento de genes, de mecanismos de replicación, trascripción, ác. nucleicos, etc. Los genomas de los virus son muy usados en Ingeniería Genética como vectores para transferir genes de unos individuos a otros.

• Tienen importancia biológica. Todos los seres vivos del planeta tienen virus que los parasitan.

La virología como ciencia existía desde la antigüedad, aunque no se conocía el origen de las enfermedades infecciosas, sí que se conocían enfermedades como la Polio (poliomielitis), la rabia y la viruela. Hoy sabemos que estas enfermedades está ocasionadas por virus. También se intentaba controlar algunas de estas enfermedades de forma empírica.

Así, en China y algunos otros países, existía la costumbre de que las madres, para proteger a sus hijos de la viruela, inoculaban costras de enfermos de viruela. Esta práctica fue observada en Turquía por M. Montague (1721), quien la introdujo en Inglaterra y de esta forma muchas personas quedaban protegidos, pero otras seguían muriendo, por lo que esta práctica dejo de utilizarse.

En 1798, el médico inglés E. Jenner, observó que las personas en contacto con ganado vacuno, a veces resultaba infectados por una forma de viruela que era muy benigna (la persona no moría) y éstas personas luego no padecían la viruela humana. Entonces comenzó a inocular a las personas con material procedente de pústulas de vacas enfermas de viruela vacuna, inventando la VACUNACIÓN.

El descubrimiento de los virus se atribuye a dos científicos: Ivanowski (1892) y Beijerinck (1898). Estos científicos descubrieron los virus de forma independiente. Trabajaban con plantas de tabaco que tenían una enfermedad llamada mosaico (las hojas tienen zonas con diversos colores), e intentaban averiguar el origen. Hacían extractos con las plantas infectadas, los cuales se hacían pasar por unos filtros que retenían los microorganismos conocidos hasta entonces (bacterias, hongos, protozoos, etc), con la esperanza de que los agentes causantes del mosaico quedaran retenidos en el filtro. Pero se comprobó que el agente pasaba los filtros ya que al inocular el filtrado en plantas sanas, éstas enfermaban. Estos autores dedujeron que el mosaico del tabaco (VMT) estaba producido por un agente muy pequeño que atravesaban los filtros y los denominaron VIRUS FILTRABLES (que viene de veneno).

El descubrimiento de los virus filtrables en animales lo hicieron en 1898 los científicos Loeffler y Frosch, dando a conocer los virus de la glosopeda de las vacas. El descubrimiento de virus en el hombre, lo hizo Walter Reed en 1900, en personas infectadas con la fiebre amarilla. A partir de este hecho, se fueron descubriendo nuevos virus filtrables. En el año 1916, Twort, y en 1917, D'Herelle, descubrieron virus en bacterias.

Todavía no se sabía cómo eran esos seres, hasta que en 1935, Stanley cristaliza el virus del mosaico del tabaco (por una técnica que cristalizaba proteínas). Entonces dedujo que los virus filtrables estaban formados solo por proteínas. Pero dos años más tarde, en 1937, Bawder y Pirie, determinaron que además de proteínas tenían ác. nucleico, siendo en el caso del VMT el ARN.

En 1940, Delbruck descubrió cómo era el ciclo de multiplicación de los virus bacterianos. Se sabía que no podían crecer en medios de cultivo normales, pero sí que lo hacían en seres vivos. Entonces, al estudiar el ciclo, se vio que los virus necesitaban crecer dentro de las células. Más tarde se estudió en virus de células animales, haciendo cultivos de virus en células animales.

2. Características diferenciales de los virus.

En los comienzos de la virología, los virus se definían en términos negativos:

• No eran retenidos por filtros que retenían microorganismos conocidos.

• No eran visibles al microscopio óptico.

• No se podían cultivar en medios de cultivo tradicionales para bacterias.

Estas características, sin embargo, o no son del todo ciertas o no son exclusivas. Se han desarrollado filtros que son capaces de retener a virus (y sustancias más pequeñas). El tamaño de los virus es pequeño 25-300nm. Algunos se pueden ver al microscopio óptico (como el virus de la viruela). Hay virus que son más grandes que algunas bacterias, como el de la viruela, que es más grande que las clamidias. Los virus necesitan ser cultivados en células vivas. También existen microorganismos que también tienen que ser cultivados sobre células vivas.

Los virus, se definen por dos características fundamentales:

A. Organización.

Los virus no son seres celulares. Son diferentes de los organismos celulares, no tienen organización ni eucariota ni procariota. Las partículas virales constan de un genoma formado por DNA o RNA (nunca por ambos), una cubierta proteica llamada cápside y en ocasiones por una envoltura membranosa.

B. Ciclo de multiplicación.

Los virus sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas. No pueden sintetizar ATP ni proteínas, ya que no poseen las estructuras necesarias para esta síntesis. Entonces, los virus son parásitos intracelulares obligados. El ciclo de multiplicación se diferencia en dos etapas:

• Extracelular. Fuera de la célula hospedadora.

• Intracelular. Dentro de la célula hospedadora.

A la partícula viral en estado extracelular se la denomina normalmente virión. Un virión es una partícula viral completa, es decir, con ác. nucleico y cubierta protectora.

El término virus es más amplio que el de virión, ya que se aplica a todas las entidades virales presentes durante todo el ciclo de multiplicación (intra y extracelular).

Cuando los viriones (enteros o en parte) penetran en el interior de la célula hospedadora, comienza la fase intracelular y la multiplicación del virus. Normalmente el genoma queda libre de las cubiertas protectoras, y se usa la maquinaria metabólica de la célula hospedadora para sintetizar nuevos componentes de virus, que se ensamblan para formar partículas virales, que salen de la célula y que son capaces de infectar nuevas células.

En un virus, el genoma vírico es esencial. La función de las cubiertas del virión, es proteger al genoma fuera de la célula hospedadora y transportarlo de una célula a otra.

• Definición de VIRUS.

Son seres de organización muy sencilla, acelulares. La partícula vírica completa o virión está constituido por el genoma (que consta de DNA o RNA) y unas cubiertas protectoras. Estos seres son parásitos intracelulares obligados que utilizan la maquinaria de la célula hospedadora para sintetizar nuevos viriones que infectan otras células.

Según Darnell y Luria (1967), un virus se define como aquella entidad cuyo genoma son elementos de ác. nucleico que se replican en el interior de las células vivas, usando la maquinaria biosintética celular para sintetizar elementos especializados (partículas virales o viriones) que pueden transferir el genoma viral a otras células.

A la pregunta de si los virus son seres vivos, existen varias respuestas aceptadas, según la opinión de cada uno. En general se puede decir que tienen dos características fundamentales:

• Son capaces de llevar a cabo un metabolismo.

• Son capaces de replicarse o reproducirse (o multiplicarse).

Los virus, fuera de las células (viriones), no son capaces de llevar a cabo metabolismo ni multiplicarse. Pero dentro de la célula hospedadora, los virus pueden usar la maquinaria celular para multiplicarse. En muchas ocasiones se acepta que se comportan como seres vivos intracelulares.

Respecto al origen de los virus, existen varias teorías que intentan explicarlo:

• Se originaron a partir de unas células, posiblemente procariotas, que parasitaban otras células, y que fueron perdiendo estructuras hasta quedarse en forma de virus. Es poco probable porque son muy diferentes a las células procariotas y además no se han encontrado estructuras intermedias.

• Se originaron a partir de parte del genoma de células que se hizo autónomo (plásmidos, elementos transponibles). Pero queda por solventar cómo estas porciones de genoma adquirieron la cubierta proteica o cápside.

3. Componentes de las partículas víricas.

Todos los viriones están constituidos por material genético DNA o RNA (pero no ambos) y una cápside formada por proteínas. Al conjunto del genoma y de la cápside se le denomina núcleo cápside, que puede estar rodeada o no de una envoltura. Podemos diferenciar varios tipos de virus en función de su constitución: desnudos o con envoltura.

Los virus desnudos, según el tipo de cápside, se diferencian en 3 tipos:

• Icosaédricos. La cápside es un icosaedro.

• Helicoidales. La cápside es un cilindro hueco.

• Complejos. Tienen diferentes estructuras anejas a la cápside (cola,..).

Los virus con envoltura se diferenciar también en tres tipos:

• Icosaédricos.

• Helicoidales.

• Complejos.

A. Ácido nucleico.

Los virus son muy variables en cuanto a la naturaleza de su material genético. El material genético presente en el virión es RNA o DNA, pero nunca ambos a la vez.

Existen unos virus que pueden usar tanto RNA como DNA como material genético, pero en diferentes fases del ciclo de multiplicación. P. ej. retrovirus (los viriones tienen RNA, pero se replica el genoma a partir de una forma intermedia de DNA), hepatitis B (tiene DNA dentro del virión pero en la replicación del genoma se usa RNA como forma intermedia).

Tanto se trata de DNA como de RNA, el material genético del virus lleva la información necesaria para la replicación del virus y formación de nuevos viriones.

El tamaño del genoma de los virus es muy variable, los más pequeños tienen 3 ó 4 genes, mientras que los más complejos pueden tener varios cientos. En general, los virus son haploides, sólo tienen una sola copia del genoma, pero existen casos de retrovirus cuyo genoma está constituido por dos fragmentos de DNA iguales, lo que les hace diploides. Si existen varios fragmentos de material genético pero que son diferentes, son haploides.

1. DNA viral.

En algunos casos puede ser de cadena sencilla, monocatenario, aunque en la mayoría de los virus con

DNA, es de cadena doble.

• El DNA de cadena sencilla, puede ser:

De cadena lineal. Como los virus animales (p. ej. Parvovirus).

De cadena circular. Como X174 (virus de bacteria).

• El DNA de cadena doble puede ser:

De cadena lineal. Como los Herpesvirus.

De cadena circular. Como los Papovavirus.

En ocasiones, primero es lineal y luego se vuelve circular, como en el caso del virus  (lambda).

2. RNA viral.

La mayoría tiene una cadena sencilla de RNA. Sólo algunos tienen cadena doble. En la mayoría de los casos, es lineal, siendo muy pocos casos aislados los de cadena circular.

El RNA de cadena sencilla o doble tiene información para la síntesis de nuevos virus. Este concepto se descubrió por primera vez en el VMT. En los años `50, trabajando con este virus se descubrió que al purificar el RNA de cadena sencilla de este virus e introducirlo en células de plantas sanas, el virus se reproduce, creándose nuevos virus. Posteriormente se descubrió que en otros virus RNA, al purificar el RNA no se conseguía infectar otras células y producir nuevos virus. Estos experimentos llevaron a la división de los virus RNA de cadena sencilla en dos grupos:

• Virus RNA de cadena positiva (RNA +). Son aquellos en los que el RNA purificado es capaz de infectar a las células con producción de nuevos virus. Esto se debe a que el RNA del virus tiene la misma secuencia de bases que los RNAm, que por definición se consideran de cadena +. Entonces, el RNA puro, al penetrar en la célula, es capaz de unirse directamente a los ribosomas, actuando como mensajero y sintetizando ya proteínas víricas (enzimas y estructurales).

• Virus RNA de cadena negativa (RNA -). Son aquellos que por sí solos (al estar purificados) no son capaces de infectar nuevas células y producir nuevos virus. En estos virus el RNA del genoma, tiene una secuencia de bases complementarias con los RNAm. Entonces cuando entra en la célula hospedadora, el RNA tiene que entrar acompañado de una enzima vírica que a partir del genoma sintetice RNAm.

En los virus RNA, la mayoría de los casos, el genoma está formado por una única molécula de RNA, pero hay casos de virus en los que el genoma está formado por varias moléculas de RNA (virus con genoma fragmentado o segmentado). Esto puede darse tanto en virus de cadena sencilla (p. ej. virus de la gripe) o pueden ser varios fragmentos de RNA de cadena doble (p. ej. Reovirus), siendo los fragmentos diferentes (entonces haploides), a excepción de retrovirus como el del SIDA (diploide).

Algunos virus de plantas tienen genoma RNA segmentado, pero los diferentes fragmentos del genoma están incluidos en cápsides diferentes, denominándose entonces virus multiparticulados, ya que el virus está formado por varias partículas. Entonces, para infectar a una célula, tiene que ser infectada por varios de estos virus a la vez.

B. Cápside.

Es una estructura que rodea y protege al genoma vírico y está formado por unas proteínas codificadas por genes del virus. Estas proteínas que forman la cápside se denominan protómeros.

Las cápsides pueden ser de 3 tipos:

• Helicoidales. - Icosaédricas. - Complejas.

1. Helicoidales.

Son las más sencilla de todas. Están formadas por un sólo tipo de protómero que se va enrrollando, formando un tubo hueco. Las proteínas se enrrollan en forma de hélice. En el centro queda un espacio para que se sitúe el genoma del virus.

Estas cápsides, en el caso de virus desnudos, son rígidas (p. ej. VMT), mientras que en los que tienen envoltura, son flexibles y se pliegan en el interior de la envoltura.

2. Icosaédricas.

Estas cápsides tienen como estructura básica un cuerpo geométrico que es el icosaedro, que tiene 20 caras triangulares y 12 aristas. En virus sencillo, la cápside es un icosaedro como tal, pero en los más complejos, cada cara triangular se divide en otra serie de triángulos. Las proteínas de la cápside se agrupan para formar unas unidades estructurales llamadas capsómeros, que tienen forma de anillos. Los capsómeros son fundamentalmente de 2 tipos:

• Formados por 6 proteínas, 6 protómeros (hexonas o hexones). Se sitúan en caras y aristas del icosaedro.

• Formados por 5 proteínas, 6 protómeros (pentonas o pentones). Se localizan en los vértices del icosaedro.

3. Complejas.

Tienen varias estructuras: cabeza, cola y otras. Estas cápsides se estudiaran en cada caso de virus concreto.

C. Envoltura.

Es una capa membranosa que rodea la nucleocápside en diferentes virus, principalmente en virus animales (p. ej. en el de la gripe), aunque también existe en virus bacterianos, pero es menos frecuente. Esta envoltura tiene una estructura de membrana, con bicapa lipídica con proteínas:

• Los lípidos de la envoltura proceden de las membranas de la célula hospedadora, ya que la envoltura se origina de membranas celulares como membrana plasmática, membrana nuclear o membranas de vesículas, ...

• Las proteínas están codificadas por genes del virus. Estas proteínas durante la formación de la envoltura emigran a la membrana celular correspondiente donde se vaya a formar la envoltura y sustituyen a las proteínas de la célula hospedadora. Estas proteínas que forman parte de la envoltura, se diferencian en dos tipos:

• Glucoproteínas (o glucoproteínas). Tienen unidas azúcares. Están incluidos en envoltura, pero sobresalen de ella. Concretamente, la parte glucídica sobresale hacia el exterior. A veces forman una estructura en la superficie externa del virus, formando unas protuberancias que se ven al microscopio electrónico, denominadas espículas (aunque a veces de se denominan peplómeros).Las glucoproteínas tienen varias funciones:

• Sirven de unión a células hospedadoras. Algunos virus contienen glucoproteínas que les permite unirse a glóbulos rojos (pero no los infectan), entonces sirven para unir diferentes glóbulos rojos entre sí, formando agregados (aglutinan). Entonces se dice que llevan a cabo hemaglutinación. Esta capacidad se usa para realizar una prueba de detección de virus (ensayos de hemaglutinación).

• Alguna glucoproteínas tienen actividad enzimática. Un ejemplo es una glucoproteína del virus de la gripe (y otros) que tiene una actividad enzimática llamada neuraminidasa, ya que es capaz de romper azúcares derivados del ác. neuramínico (presente en la superficie de células hospedadoras). Esta enzima le sirve al virus para, por una parte, salir de las células que infecta, porque en las células hospedadoras estos azúcares forman una maraña que impiden salir a los virus. Por otra parte, esta actividad también sirve al virus para penetrar en las células y para penetrar en las mucosas. Existen medicamentos que inhiben la neuraminidasa.

Las glucoproteínas son los principales antígenos de los virus que tiene envoltura, ya que están localizadas en la superficie del virus, y son las primeras estructuras que localiza el sistema inmune, Entonces, tienen importancia clínica, existiendo algunas pruebas de detección de virus que se basan en reacciones Antígeno-Anticuerpo.

• Proteínas matriz. Están insertadas en la bicapa lipídica pero no suelen sobresalir al exterior. A veces se localizan debajo de la bicapa lipídica formando una especie de capa llamada matriz. Esta proteína confiere cierta estabilidad y rigidez a la envoltura (si no, sería muy flexible).

D. Otros componentes de los viriones.

Existen virus que en su interior contienen enzimas que están codificadas por el genoma del virus. Estas enzimas son importantes en el ciclo de multiplicación del virus, y suelen acompañar al genoma porque normalmente intervienen en su replicación. P. ej.:

• En virus RNA de cadena sencilla -, y virus RNA de cadena doble tienen acompañando al genoma una RNA polimerasa dependiente de RNA, que sintetiza RNA tomando RNA como molde.

• En retrovirus, en el ciclo de multiplicación, a partir del RNA que forma su genoma, se forma DNA. Este proceso lo lleva a cabo una enzima que está dentro del virión, llamada DNA polimerasa dependiente de RNA (también llamada transciptasa inversa).

• Los Arenavirus llevan en su interior ribosomas de la cél. hosp., pero no se sabe si tienen función.

4. Generalidades sobre la multiplicación de virus.

Los virus deben multiplicarse dentro de células vivas. En su ciclo de multiplicación hay varias etapas:

• Unión del virión a la célula hospedadora.

• Entrada o penetración al interior de la célula hospedadora. Según el tipo de virus, entrará en virión entero, el genoma o parte (lo importante es que entre el genoma).

• Síntesis de componentes virales. El genoma del virus, suele quedar libre dentro de la célula hospedadora y usando la maquinaria biosintética de la célula se sintetizan ác. nucleicos y proteínas (enzimas, estructurales, ...).

• Ensamblaje de los componentes de los virus para formar nuevas partículas víricas (proceso también llamado maduración).

• Liberación de los nuevos virus de la célula hospedadora, que ya pueden infectar otras células. Pueden producirse con o sin rotura de la célula, dependiendo de los virus.

La duración del ciclo de multiplicación es variable. En bacterias pueden durar hasta 20-25 minutos (los más rápidos). En virus que afectan a animales, normalmente son ciclos más largos, durando 5-50 horas. Durante el ciclo de un virus se diferencian varios períodos de tiempo:

• Período de eclipse. Durante este periodo de tiempo, no se observan virus dentro de la célula. En este período se están sintetizando los diferentes componentes virales. El período de eclipse dura desde que se inicia la infección hasta que se sintetiza la primera partícula de virus.

• Período de acumulación intracelular. Una vez que se ha sintetizado la primera partícula, antes de que se liberen los virus. Es el tiempo en el cual se acumulan virus dentro de la célula hospedadora. Este período finaliza cuando se comienzan a liberar virus de las células.

También se habla del período de latencia, que es el tiempo que transcurre desde la infección de una célula por un virus y la liberación de virus al medio. Por lo tanto, el período de latencia puede considerarse como la suma del período de eclipse y el período de acumulación intracelular.

5. Introducción a la taxonomía de virus.

La taxonomía de virus está poco desarrollada. Los virus se dividen según el tipo de hospedador en:

- Virus de animales. - Virus de plantas. - Virus de bacterias. - Virus de hongos.

En los comienzos de la virología, los científicos que estudiaban cada grupo, no se ponían de acuerdo. En 1966, se creó el Comité Internacional para la Taxonomía de Virus. Este organismo intenta establecer una clasificación uniforme para todos los virus. El último informe se emitió en 1995 por Murphy & Co. Este comité ha creado una serie de grupos de virus. Para ello se ha basado en unos caracteres de los virus:

• Características morfológicas y estructurales. Forma del virión, simetría de la cápside (icosaédrica, helicoidal, compleja), presencia o no de envoltura, tamaño del virión.

• Características del ác. nucleico (o genoma). Tipo de ác. nucleico (DNA o RNA), cadena sencilla/doble. Los de RNA de cadena sencilla, polaridad + ó -, nº de fragmentos.

• Características referentes a la multiplicación. Mecanismo de entrada del virus en la célula, localización de la multiplicación/replicación dentro de la célula, peculiaridades en transcripción y traducción de proteínas, mecanismo de salida (liberación) del virus.

• Características de proteínas víricas. Número de proteínas que forman el virus (estructurales y enzimas), presencia de enzimas especiales (como la transcriptasa inversa).

• Propiedades clínicas y biológicas. Tipo de hospedador (animal, planta, bacteria u hongo), tipo de enfermedad que produce, modo de transmisión de la enfermedad.

• Otras características. Propiedades inmunológicas (reacción antígeno-anticuerpo).

Estos caracteres diferencian a los virus en grupos: Orden, Familia, Subfamilia, Género y Especie. El grado de Orden está en desarrollo. Hasta 1995 sólo había uno. Se están desarrollando según el ác. nucleico.

Para nombrar estos grupos, en virus, de Orden, Familia, Subfamilia y Género, deben escribirse en cursiva o subrayados, y con la primera letra mayúscula. La Especie no se escribe ni en cursiva ni subrayado.

Cada grupo tiene una determinada terminación (sufijo):

• Orden: -virales

• Familia: -viridae (Herpesviridae).

• Subfamilia: -virinae (Alphaherpesvirinae).

• Género: -virus (Simplexvirus).

• Especie: no tienen una forma determinada. Normalmente se suelen denominar en animales y plantas por el nombre de la enfermedad que producen (p. ej. virus herpes humano tipo 2), y los que infectan a bacterias con nombres alfanuméricos ( , X174, T4).

nota: A veces se puede referir a los grupos, de manera informal, sin subrayar y sin poner en cursiva. Es muy frecuente referirse a las familias terminando en -virus (p.ej. herpesvirus, poxvirus). La desventaja es que puede llevar a equívocos por no poder diferenciar entre familia y género.

Lección 2. Métodos de estudio de virus.

Esquema del tema:

1. Cultivo de virus.

2. Métodos de detección y cuantificación de virus.

• Métodos fisicoquímicos:

• Observación de virus al microscopio electrónico.

• Ensayos de hemaglutinación.

• Estudios de infectividad.

• Métodos inmunológicos para el estudio de virus.

• Detección de ác. nucleicos de virus.

1. Cultivos de virus.

Los virus se han de cultivar sobre células adecuadas. Depende del virus del que tratemos (si son de plantas, bacterias, animales,...). Los más fáciles de cultivar son los virus de bacterias. Se cultivan sobre cultivos de bacterias en medio líquido o sólido.

Los virus animales, se pueden cultivar de diferentes formas:

• En animales enteros. Así se hacía en el comienzo de la virología. En la actualidad se usa poco.

• En huevos embrionados de gallina. En huevos fecundados después de 6-8 días a partir de la puesta. También pueden ser de otras aves. Los virus se inyectan en el interior del huevo con una jeringa y dependiendo del tipo de virus se deben inyectar en una región determinada.

• En cultivos de células animales. Es la forma más usada. Pueden ser de 3 tipos fundamentalmente:

• cultivos primarios.

Es aquel que se obtiene directamente a partir de un tejido animal. Para obtener un cultivo de este tipo, se parte de un tejido aislado, que se deposita en recipientes adecuados, que pueden ser placas petri, botellas tumbadas, erlenmeyer, etc. Luego se añade un medio de cultivo adecuado, normalmente líquido. Estos medios de cultivo son muy ricos, conteniendo vitaminas, aminoácidos, sales, suero, p. ej. uno muy usado es el medio EAGLE.

Las células comienzan a dividirse en el fondo del recipiente, cubriendo este fondo, formando normalmente una monocapa de células. Los cultivos primarios se mantienen cambiando el medio de cultivo 2 ó 3 veces por semana, pero al cabo de varias semanas, los cultivos terminan muriendo.

En ocasiones, tomando unas pocas células de un cultivo primario, y depositándolas en otro recipiente, comienzan a dividirse y se obtienen lo que se denomina una cepa celular.

• Cepa celular.

Estas cepas celulares sirven para producir más cultivos. Se pueden subcultivar (cultivar varias veces). Entonces, una cepa celular es un cultivo de células animales obtenido a partir de un cultivo primario y cuyas células pueden ser subcultivadas varias veces. Las cepas celulares con el tiempo degeneran, no pudiendo volver a subcultivarse.

Se pueden obtener cultivos primarios y cepas celulares a partir de diferentes tejidos. Para virus humanos, se suelen usar tejidos de hombre, pero también de monos (africanos) y también de embriones (de monos y humanos).

Pero hay células de cepas celulares que sufren una alteración y comienzan a desarrollarse de forma indefinida, formando entonces una línea celular.

• Líneas celular.

Es un cultivo de células inmortales, en el sentido de que se pueden subcultivar indefinidamente. Las líneas celulares se pueden obtener a partir de cepas celulares, pero también, muy frecuentemente, a partir de célular tumorales, p. ej. dos líneas muy usadas son:

• Células HeLa. Iniciales procedentes de una mujer que tuvo cáncer de cuello de útero.

• Células CaCo. Procedentes de un cáncer de colon.

Una vez que se ha establecido a), b) o c), se inoculan sobre este cultivo celular los virus, siendo, entonces, diferentes que el cultivo de virus de bacterias.. En virus animales, primero se realiza el cultivo celular y luego se inoculan los virus. En ocasiones los virus animales se pueden cultivar en cultivos de órganos, en medio líquido.

Los virus de planteas se pueden cultivar sobre plantas enteras, cultivos de tejidos de plantas, cultivos de células aisladas y cultivos de protoplastos.

2. Métodos de detección y cuantificación de virus.

Se basan en considerar a los virus con diferentes propiedades:

• Métodos fisicoquímicos.

Se basan en detectar a los virus al microscopio electrónico, como cuerpos físicos que son, o bien, se basan en una propiedad química que tienen algunos de estos virus, que es la capacidad de aglutinar glóbulos rojos (ensayos de hemaglutinación).

a.1. Observación de virus al microscopio óptico. Se pueden aplicar numerosas técnicas de microscopía electrónica para observar virus. Pero en los análisis de rutina, para detectar y cuantificar virus sólo se emplean los métodos más sencillos. Los más complejos (inclusión en resinas, cortes), sólo se usan en investigación.

• Tinción negativa. Consiste en mezclar una suspensión donde suponemos que están los virus, con una sal densa a los electrones, p. ej. acetato de uracilo, fosfotungstato potásico (ác. fosfotungstico). Esta mezcla se deposita en una rejilla de microscopía electrónica y se observa al microscopio electrónico de transmisión. Con esta técnica, los virus no se tiñen en realidad, sino que lo que se tiñe es el medio. Esta es la más usada porque es la más sencilla.

• Sombreado. Consiste en depositar a los virus sobre una rejilla y hacer incidir sobre la misma un metal, normalmente platino, con un cierto ángulo, respecto a la rejilla. El platino, cubre a los virus, pero queda en un lado una sombra de color claro (el platino queda oscuro). Entonces al observar la rejilla, se verán los virus oscuros y la sombra clara. Entonces se observa una imagen de aspecto tridimensional.

Mediante estas dos técnicas, se puede demostrar la presencia de virus en una muestra, pero también se pueden contar, por un procedimientos especial.

El método que se utiliza para la cuantificación de virus consiste en mezclar la solución de virus que se quiere cuantificar, con unas bolas de látex. La mezcla se somete a tinción negativa o sombreado, y se cuentan en el microscopio las partículas víricas y las bolas que se observan en un campo de visión, se anota y para conocer la concentración de virus en la disolución original, se aplica una fórmula:

P. ej. Si hemos contado 300 partículas de virus y 30 bolas siendo:

a.2. Ensayo de hemaglutinación. Se basan en la capacidad que tienen diferentes virus de unirse a glóbulos rojos, incluso aunque no los infecten. Un virus es capaz de unir entre sí a 2 glóbulos rojos. Pero si hay bastantes virus en una muestra, se forman unos agregados de virus y glóbulos rojos que sedimentan con facilidad, y se produce la aglutinación de glóbulos rojos o hemaglutinación.

Si en una muestra no hay virus, o incluso si hay pocos, no se formarán estos agregados. En una muestra, si no hay virus o hay pocos, no se produce hemaglutinación, se formarán dímeros.

En una hemaglutinación se pueden detectar virus y cuantificarlos (virus hemaglutinantes). Tenemos una muestra que queremos saber si existen virus que aglutinen glóbulos rojos. En la muestra ¿Dónde hay virus? Se añaden los glóbulos rojos y se dejan incubar. Si no hay virus o hay muy pocos, los glóbulos rojos también acaban sedimentando, pero quedan en el fondo del tubo formando un sedimento pequeño en el fondo del tubo en el centro y bien delimitado.

Si existen virus y se produce hemaglutinación, los agregados precipitan por todo el fondo del tubo y se observa, visto desde arriba, un precipitado muy fino en todo el fondo del tubo (no rueda).

Para cuantificar los virus, se realiza un ensayo en unas placas de plástico que contienen pocillos. Se realizan diluciones de la muestra en los pocillos a la mitad cada vez: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, ...

A todos los pocillos se le añade igual cantidad de glóbulos rojos. Se espera un tiempo y se observa si existe o no, hemaglutinación. Entonces se calcula la denominada dilución libre, que es la última dilución de la solución de virus en la que se observa hemaglutinación, es decir, que en la siguiente dilución no hay hemaglutinación. En fotocopia 1/128.

Los resultados se suelen expresar en título del ensayo de hemaglutinación. Se suele definir como la inversa de la dilución límite. El título de nuestro ejemplo sería 128. A mayor título indica que teníamos más virus en la solución original porque hemos tenido que diluir más hasta que no existe hemaglutinación. Un título de 256, tendría más virus que en la mezcla de nuestro ejemplo.

Los métodos fisicoquímicos de cuantificación tienen una serie de inconvenientes:

• Mediante microscopía electrónica, se cuentan tanto virus con capacidad de infectar células como virus que tengan algún defecto, y no puedan infectar células o incluso cápsides vacías.

• Mediante el ensayo de hemaglutinación, también se pueden detectar virus que no sean infectivos y además hay virus en los que las espículas s sueltan del virus y se pueden contar en la hemaglutinación.

• Estudios de infectividad.

Hay otros métodos que se pueden aplicar como los estudios de infectividad. Estos estudios de infectividad nos permiten cuantificar las partículas de virus que son capaces de causar una infección. Estos métodos son varios:

b.1. Método de formación de placas.

b.1.1. Para virus bacterianos. Nos permite cuantificar los virus presentes en una solución que infectan a una determinada cepa bacteriana. Para realizar este ensayo se parte de un tubo en que tenemos la suspensión de virus, otro tubo que contiene las bacterias hospedadoras de dicho virus y otro tubo que contiene agar fundido a unos 45-50º. En el agar se deposita una muestra de los dos tubos anteriores (virus y bacterias), se agita para mezclar y se añade todo el contenido del tubo de agar con virus y bacterias a una placa petri que ya contenía un medio de cultivo sólido, y se deja enfriar para que solidifique el agar que acabamos de añadir (tenemos 2 capas en la placa). Las bacterias y los virus quedan extendidos, por tanto, en toda la superficie y las bacterias comienzan a multiplicarse, formando un césped por la placa. Pero a su vez, cada virus infecta a la bacteria que tenga más próxima, se multiplica en ella, salen nuevos virus que infectan a las bacterias vecinas y así, en la zona donde había un virus, se forman unas áreas de bacterias muertas (por los virus) que se denomina calva o placa de lisis, y por lo tanto, el recuento del número de calvas o placas de lisis, nos da idea del número de virus infecciosos que teníamos en la muestra original, aunque no es un método del todo exacto.

Los resultados de este ensayo se expresan como unidades formadoras de calas o placas de lisis (ufp). Es conveniente contar las placas de cultivo que contienen entre 30 y 300 calvas, pero a veces, como no sabemos cuántas calvas nos van a salir, lo que conviene es realizar una serie de diluciones de la muestra original que contenía a los virus: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, ... y de cada dilución se toma un inóculo. P. ej. de 0,1 mL y se realiza lo que acabamos de ver; luego se cuentan las calvas de las placas y se aplica la fórmula:

b.1.2. Para virus animales. En este caso se parte de muestras o diluciones de virus y de placas petri que contienen cultivos de células animales; se elimina el medio líquido, a continuación se añaden los virus (un inóculo de la solución de virus sobre la placa) (0,1 mL, 0,2 mL) se deja un tiempo para que los virus se unan a las células y después de esperar a que esto suceda, y se añade un medio solidificado (capa fina) de agar o gelatina, se incuba un tiempo, dependiendo del virus puede ser de días o semanas, y se observa la aparición de calvas (porque los virus infectan a las células animales, a la más próxima, los virus se multiplican, salen de las células, infectan a las vecinas y se forman esas placas). Algunas de éstas placas no se pueden diferenciar directamente. Entonces, para observarlas, hay que añadir una serie de colorantes de cultivo. Se pueden realizar 2 tipos de tinción en células animales:

• Colorante rojo neutro. Tiñen células vivas, aparecerá teñido el resto, no las placas de lisis o calvas.

• Colorantes que tiñen células muertas como el Azul Tripán, en este caso, las placas aparecerán de color azul.

Hay casos en que los virus no matan a las células y se pueden detectar de otras formas. Ej.: virus cancerígenos que transforman a las células y hacen que proliferan de forma anormal y en éste caso lo que se hace es que observan en la placa de cultivo unos cúmulos o grumos de células que se pueden contar (virus tumorígenos).

b.2. Método de producción de lesiones en hojas de plantas.

Para cuantificar virus que infectan a plantas. Una muestra con virus se extiende sobre la superficie de hojas de plantas y se espera un tiempo hasta que aparecen lesiones en las hojas de las plantas y se realiza un recuento de las lesiones, que aparecen. Es un método muy sencillo.

b.3. Métodos de determinación de la dosis letal 50 (DL50) y de la dosis infectiva 50 (DI50).

A partir de una muestra se realizan disoluciones decimales 10-1, 10-2, 10-3, ... A partir de cada dilución, se toman alícuotas con las que se infecta a organismos prueba, que pueden ser plantas, animales, huevos de gallina (se requieren muchos organismos prueba). Se espera un tiempo y se cuentan los organismos que han resultado infectados o muertos por el virus para cada dilución y se calcula el %. Ej.: para 0,1-100%, para 0,2-90%, etc. Con estos datos se realiza una curva (fotocopia) y en esta curva, en el eje de abcisas (x) se pone la dilución 10-5, 10-6, 10-7, etc, y en el eje de ordenadas (y) se pone el % de individuos, o bien infectados, o bien muertos, por cada dilución de virus. Si la solución está poco diluida todos o la mayoría de los organismos prueba estarán infectadas; y en diluciones muy altas, poco o ninguno de los organismos prueba estarán infectados.

Se calcula la dilución (una vez hecha la gráfica), que produce que el 50% de los organismos prueba están infectados y esa es la DI50. Si hemos tenido como criterio la muerte de los organismos prueba, se determina la dilución que produce la muerte del 50% de los organismos prueba y entonces tenemos la DL50 (en el ej. 10-6).

• Métodos inmunológicos para el estudio de un virus.

Los virus cuando se introducen en el organismo actúan como Ag e inducen la formación de Ac específicos. Las pruebas inmunológicas de detección de virus se basan en reacciones Ag-Ac. Se puede abordar el diagnóstico viral de 2 formas mediante estas pruebas:

• Identificar un virus o Ag vírico desconocido, haciéndolos reaccionar con Ac conocidos.

• Detectar Ac frente a un virus en el suero del paciente. Para ello se hace reaccionar el suero problema con virus o Ag víricos conocidos.

Hay numerosos métodos inmunológicos para el diagnóstico vírico. De éstos, unos ensayos muy usados, son los ensayos inmunoenzimáticos o test de ELISA, que se utilizan tanto para identificar Ag víricos como sueros problema.

Vamos a ver 3 de estos métodos:

• Inmunotransferencia de proteínas (inmunobloting). Se usa como confirmación de prueba de ELISA.

• Test de neutralización (de infectividad).

• Test de inhibición de la hemaglutinación

c.1. Test de inmunotransferencia de proteínas.

Se basa en hacer reaccionar Ag y Ac sobre un papel y los Ag proteínas separadas por electroforesis. Partimos de una muestra con proteínas que se aplica a un gel de poliacrilamida. A continuación se somete el gel a electroforesis en un campo eléctrico, quedando las proteínas separadas en bandas. A continuación las proteínas se transfieren a un papel o membrana de nitrocelulosa, en unos aparatos especiales para ello. Cuando la proteína está en papel de nitrocelulosa, se añaden en papel (o membrana), un suero con Ac. Si los Ac reconocen algunas bandas de proteínas en gel, se unirá a ella. A continuación se lava porque si no existe unión Ag-Ac, se eliminan los Ac. Luego se añade a la membrana Ac secundarios (que es aquel que reconoce a otro Ac como Ag).

P. ej. Si el Ac primario es suero humano (proteínas) entonces el Ac secundario se podría obtener inyectando los Ac humanos en un animal como un conejo. Entonces el conejo reconoce como Ag a los Ac del hombre y formará antianticuerpos o Ac secundarios.

Estos Ac secundarios se unirán a los Ac primarios si están presentes y se realiza un lavado porque si no existe unión, se eliminan. Los Ac secundarios tienen que ir marcados de alguna forma, p. ej. Una enzima, con un compuesto radioactivo (lo normal es una enzima, ya que el uso de compuestos radioactivos es más problemático).

A continuación se añade el sustrato de la enzima que origina un producto coloreado. Entonces se detecta en el papel la aparición de unas bandas coloreadas.

Esto se puede aplicar para detectar Ag víricos en una muestra problema (p. ej. Para detectar virus del SIDA en una muestra). Entonces se rompen las células, las proteínas se someten a electroforesis y se sigue todo el proceso..

También se puede hacer lo contrario, intentar determinar si en un suero hay Ac frente a un virus determinado. P. ej.: si en el suero de un paciente hay Ac para el virus del SIDA. En este caso se parte de proteínas conocida del virus, se realiza todo el proceso anterior.

En el caso del SIDA, ya se venden unas membranas de nitrocelulosa con proteínas del virus ya separadas donde se realiza la prueba. Ver fotocopias.

c.2. Técnica de neutralización de la infectividad.

Estos ensayos se fundamentan en que si mezclamos un virus con Ac y éstos se unen al virus, disminuye la capacidad de los virus de infectar células.

Entonces mezclamos virus con Ac; si existe unión específica virus -Ac y añadimos todo esto a un sistema indicador (p. ej. Un organismo prueba, como plantas, embriones de pollo, cultivo de células, animales), entonces disminuimos la capacidad de los virus de infectar a éstos organismos prueba.

Si no existe unión específica (unión Virus-Ac) y se añade a un sistema indicador, entonces no queda afectada la capacidad de los virus de infectar al sistema indicador. Este método se puede realizar de dos formas:

• Se puede intentar identificar un aislado vírico desconocido. P. ej. Si hemos aislado un virus y se trata del virus de la gripe, entonces lo que se hace es mezclar el virus desconocido con Ac. Conocidos, se añade al sistema indicador y se observan los resultados. Si se disminuye la capacidad infecciosa de los virus, respecto a un control (en el que no están los Ac) entonces hemos identificado al virus problema.

• Por otro lado se puede intentar identificar o detectar en el suero de un paciente la presencia de Ac frente a un virus determinado. En este caso se hace reaccionar el suero problema con virus conocido (p. ej. De la gripe) y se realiza el proceso. Entonces se disminuye la capacidad infectiva, entonces se identifica.

c.2. Inhibición de hemaglutinación.

Se basa en que si hacemos reaccionar virus con Ac y se produce una unión de los virus con los Ac y se produce una unión de los virus con los Ac. Si añadimos a continuación glóbulos rojos, se produce una disminución de la capacidad de los virus de aglutinar glóbulos rojos. Si no existe unión, disminuye la capacidad de producir hemaglutinación.

Estos ensayos se realizan sólo para virus que son capaces de llevar a cabo la hemaglutinación. Sólo se usan para determinar la presencia de Ac frente a un virus en el suero de un paciente (no se usa la otra posibilidad).

• Detección de ácidos nucleicos.

Mediante estos métodos se intenta detectar secuencias de genoma de virus en una muestra. Éstos métodos se suelen usar como confirmación de los métodos inmunológicos. También se usan en casos especiales como, p. ej., estudios del cáncer para investigar la presencia de genoma de virus en células tumorígenas (p. ej. Verrugas, hepatitis).

También se usan para detectar virus en recién nacidos. En el caso del VIH, es difícil aislar los virus y los Ac, pueden proceder de la madre, entonces se detecta el ácido nucleico.

Las pruebas de detección de ácidos nucleicos se basan en técnicas de hibridación de ác. nucleicos. Estas técnicas se fundamentan en el hecho de que cadenas sencillas de ác. nucleico, que sean complementarias entre sí, tienden a formar un híbrido si se ponen juntas. Esta hibridación puede ser entre hebras: DNA-DNA, RNA-DNA, DNA-RNA.

Con estas pruebas se intenta detectar en la muestra la presencia del genoma de un determinado virus (una secuencia), usando unas secuencias de ác. nucleicos conocidos por nosotros, y que sean complementarias con secuencias del genoma del virus.

Para realizar esta prueba, en primer lugar hay que generar moléculas de ác. nucleico de cadena sencilla en la muestra, si el genoma que estamos buscando en de cadena doble, es decir, hay que intentar separar las cadenas (si es doble) del virus por un tratamiento especial.

Una vez que tenemos las cadenas sencillas, se adiciona la secuencia conocida por nosotros (secuencia sonda), que hibridará con la secuencia del virus, si ésta está presente en la muestra. Para detectar que se ha producido esta hibridación, la secuencia sonda tiene que ir marcada de alguna forma: con un compuesto radioactivo, fluorescente o una enzima (que es lo más frecuente).

A continuación, se valora si se ha producido la unión, con un contador de centelleo (radiactividad), o con un contador de fluorescencia o bien añadiendo el sustrato de la enzima y viendo si ha aparecido el producto. Con estas reacciones se puede intentar buscar en la muestra genomas de virus tanto de RNA o DNA, siendo la sonda RNA o DNA. La sensibilidad de estos método aumentan notablemente si el genoma que estamos buscando es ampliado previamente por la aplicación de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

Lección 3. Virus bacterianos. Características y reproducción.

Esquema del tema:

• Clasificación de los virus bacterianos

• Multiplicación de los bacteriófagos.

• Ciclo lítico

• Ciclo lisogénico.

• Clasificación de los virus bacterianos.

A los virus bacterianos se les suele llamar bacteriófagos o fagos. Parasitan tanto a bacterias y arqueas. La mayoría de los virus bacterianos tiene DNA como genoma. Este DNA normalmente es de cadena doble (aunque también hay de cadena sencilla). Sólo existe unos pocos virus con RNA que pueden ser tanto de cadena sencilla como doble.

La mayoría de los fagos, son virus desnudos (sin envoltura), aunque algunos sí la poseen. Las familias de virus que infectan a bacterias se recogen en el siguiente cuadro:

• Multiplicación de los bacteriófagos.

Existe gran diversidad de estrategias de multiplicación de los fagos, pero un esquema general podría ser este:

Ahora vamos a centrarnos en dos tipos de ciclos de multiplicación, que son los más conocidos:

A. Ciclo lítico. Tomamos como ejemplo a los virus llamados Tpar (T2, T4, T6) que pertenecen a la familia Myoviridae, que son virus desnudos, con DNA de cadena doble y parásitos de E. Coli. Muchos virus bacterianos tienen un ciclo de multiplicación al que se denomina lítico porque los virus se multiplican en el interior de la bacteria ay salen de la misma matando o lisando a la célula. A éste tipo de virus con este ciclo, se les denomina virus virulentos. Vamos a tomar como ejemplo al virus T4 como característico del ciclo lítico.