Microscopía

Óptica. Electrónica. Microscopio óptico, electrónico, de contraste de fase. Técnica histológica, citoquímica, inmunocitoquímica. Cultivo celular. Autorradiografía

  • Enviado por: Itsuki
  • Idioma: castellano
  • País: Argentina Argentina
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  • 'Microscopía'

    • Sistema óptico

      • OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

      • OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.

      • CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

      • DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

      • FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

    • Sistema mecánico

      • SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

      • PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

      • CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.

      • REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.

      • TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

    2 . El microscopio electrónico consta principalmente de una alta columna cilíndrica hueca donde se confina el rayo de electrones, y de una consola con un panel de botones giratorios que controlan electrónicamente las operaciones efectuadas dentro de la columna. La parte superior de la columna contiene el cátodo, in filamento de tungsteno que cuando se calienta actúa como fuente de electrones. Los electrones se desprenden del filamento caliente y se aceleran para formar un delgado haz mediante la aplicación de un voltaje entre el cátodo y el ánodo. Antes de la operación se extrae el aire de la culunma para producir un vacío donde se desplazarán los electrones.

    Las lentes de un microscopio electrónico son electroimanes potentes localizados en la pared de la columna al vacío. La fuerza de los imanes esta controlada por la corriente suministrada, que es determinada por la posición de los diferentes botones de la consola entre la fuente de electrones y la muestra se colocan lentes condensadores que se encargan de enfocar el rayo de electrones sobre la muestra. La propia muestra se sostiene sobre una pequeña rejilla de metal delgado, el cual se introduce en la parte media de la columna del microscopio de modo que la rejilla se mantenga perpendicular al haz de electrones.

    La distancia focal de las lentes se puede modificar cambiando la corriente suministrada, una lente objetivo puede recorrer toda la gama de amplificaciones sin necesidad de cambiar lentes.

    La imagen es resultado de los electrones que pasan a través de la muestra enfocado sobre una pantalla localizada en la parte inferior de la columna. Los electrones que golpean la pantalla excitan un recubrimiento de cristales fluorescentes que emiten su propia luz visible percibida por el ojo como una imagen de la muestra.

    Microscopio electrónico de barrido: se pueden obtener imágenes topográficas tridimensionales de los materiales sujetos al estudio. Se emplea un haz de electrones que actúa sobre la superficie del material: allí los electrones excitan a las moléculas de la muestra, las cuales emiten un delgado haz de electrones secundarios que adquieren un movimiento semejante al observado en los tubos de rayos catódicos, estos electrones son desviados hacia un tubo foto multiplicador, generando imágenes en una pantalla de televisión, esta se recubre con un metal pesado que se evapora en una cámara de vacío. Además se hace rotar la muestra para que el metal se deposite uniformemente en toda la superficie.

    Microscopio electrónico de transmisión: es un instrumento que permite conocer la ultraestructura de las células y de la matriz extracelular, ya que posee un poder de resolución mayor que el microscopio óptico. Utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo electro estático o electro magnético y de la misma forma que un rayo de luz es refractado al atravesar una lente. Si se coloca un filamento en el interior de un tubo de vacío y luego se calienta, el filamento emite electrones que pueden ser acelerados por medio de un potencial eléctrico. El haz de electrones tiende a seguir una trayectoria rectilínea y presenta propiedades similares a la de la luz. Manifiesta un carácter vibratorio y corpuscular, pero la longitud de onda es menor para los electrones. El filamento que emite la corriente de electrones actúa como fuente termolónica. Por una bobina electromagnética que cumple las funciones del condensador del microscopio óptico, los electrones se concentran en el plano donde se coloca el material. Una segunda bovina funciona como una lente objetivo, lo que da una imagen agranda del objeto en observación. Esta imagen es recibida por una tercera lente electromagnética, aumenta la imagen que proviene del objetivo. La imagen final se observa sobre una pantalla fluorescente o en ana placa fotográfica.

    microscopio óptico

    microscopio electrónico

    Fuente de luz común.

    Haz de electrones.

    Se pueden observar células y tejidos vivos y muertos.

    Solo se pueden observar células muertas.

    Con frecuencia las muestras se someten a técnicas de tinción con colorantes.

    Las muestras se tratan con sales metálicas.

    El material biológico tiene un grosor entre 1 y 10 um. se corta con micrótomo.

    Las muestras se cortan en secciones ultra finas de 50 a 100 um. de espesor utilizando ultramicrótomo.

    Los rallos de luz atraviesan la muestra.

    M electrónico de transmisión: los electrones atraviesan la muestra.

    ME de barrido: los electrones chocan con la muestra y rebotan.

    Poder de resolución: 0,2um.

    PR: 0,2 - 0.5 um.

    PR: 10 um.

    Brinda información topográfica y da una imagen muy reducida.

    Proporciona información de la ultraestructura celular.

    Da una imagen topográfica y tridimensional del objeto.

    3 . Microscopio de contraste de fase: sirve para ver células y tejidos vivos al estado transparente, es decir, que no tienen técnicas de tinción. Su función se basa entre los diferentes índices de refracción que sufre la luz al atravesar un tejido biológico, esos cambios en el índice de refracción se denominan cambios de fases.

    Las diferentes longitudes de onda son interpretadas en un microscopio por un censor de índice de refracción y produce las diferentes longitudes de onda en rayos, en diferentes longitudes grises.

    Microscopio de interferencia: similar al de contraste de fase con la diferencia que tiene mayor sensibilidad para detectar los índices de refracción, por lo tanto se obtiene una imagen a color.

    Un tipo especial de microscopio de interferencia es el llamado microscopio de Nomarski, en el cual un rayo de luz único atraviesa el material y el objetivo y luego se dividen en dos rayos que se interfieren entre sí por medio de un prisma birrefringente. También se utilizan filtros que actúan como polarizadores y analizadores y un prisma compensador ubicado en el condensador. La imagen resultante presenta un relieve característico.

    Este microscopio es particularmente útil para el estudio de las células vivas durante la mitosis.

    4 . Técnica histológica:

    Se denomina al conjugo de operaciones y procedimientos a los que se somete una muestra organizada, con el objetivo de facilitar la observación de las piezas al microscopio permitiendo de esa manera observar estructuras no visibles al ojo humano.

    Pasos de la técnica histológica:

    Obtención del material: se puede obtener a partir de:

    Biopsias: es un fragmento del tejido llamado bloque, se obtiene por biopsias quirúrgicas.

    Necropsias: es la extracción del material de cadáveres.

    Obtención a partir de animales de laboratorios.

    Estudio experimentales de animales y vegetales.

    Material obtenido a partir del cultivo celular.

    Frotis o extendidos.

    Para la obtención de la muestra es necesario actuar con precaución para no destruir o dañar el tejido.

    Fijación: una vez obtenido el material, se debe colocar en una sustancia llamada fijador, por medio de la fijación se detiene el metabolismo celular y se conservan las estructuras. Para l su futuro tratamiento evitándose la degeneración post mortem.

    Debemos diferenciar dos conceptos:

    Autólisis: proceso destrucción de los tejidos por sus propias enzimas lisosomales.

    Putrefacción: proceso de destrucción de los tejidos asociados a la acción de microorganismos, como bacterias.

    La fijación contribuye a endurecer las células para que resistan mejor los pasos de la técnica y aumenta la afinidad de las estructuras celulares por los colorantes.

    Un fijador debe tener:

    Buen poder de penetración.

    Actuar con rapidez.

    Debe endurecer y conservar lo mas fielmente las estructuras celulares.

    Inclusión en parafina: la parafina es un producto residual del petróleo y constituye una base o sostén sólido para el tejido. Una vez que se retira la muestra del fijador, se la lava y se la deshidrata, para ello se utiliza alcohol en forma creciente de 70º-90º-100º en cada baño la pieza estará de tres a doce horas.

    Una vez finalizada la deshidratación se impregna la muestra con un solvente, ya que la muestra esta embebida en alcohol y la parafina es invisible en el mismo. Se trabaja con xilol, toluol y benceno que eliminan el alcohol y la muestra adquiere una transparencia característica, este proceso se llama “aclaración” y las sustancias empleadas se llaman aclarantes.

    Luego se produce una inclusión definitiva en una solución que contiene partes iguales de parafina liquida y liquido intermediario (xilol, toluol y benceno) y se lo deja una hora en la estufa. Luego se introduce en otro recipiente que contiene parafina liquida solamente y se lo deja en la estufa cuatro horas.

    Confección de taco: se coloca el trozo de tejido con parafina en un molde especial de metal llamada barra de leuckart, orientándolo convenientemente para el posterior corte.

    Obtención de cortes: los cortes deben ser delgados, se utilizan instrumentos llamados micrótomos. Hay varios tipos, el micrótomo tipo minot es el más utilizado en la técnica histológica, pues da cortes sencillos en forma de cinta con espesores de dos a veinte micras.

    Una vez realizado el corte se recogen con ayuda de un pincel y se lo introduce en una caja de petri que contiene agua a 45º. En un porta objetos se coloca albúmina de mayer, se coloca el corte del tejido y se lleva a la estufa durante 15 o 20 minutos. Luego se realiza la desparafinización con xilol, toluol hasta que el material se vuelva transparente, como los cortes están deshidratados se los vuelve a hidratar ya que se van a utilizar colorantes en una solución acuosa. Se vuelven a emplear alcoholes en graduación decreciente 96º-90º-70º y agua durante un minuto cada una.

    Coloración: proceso por el cual un cuerpo toma color por la acción de una sustancia colorante.

    Clasificación de colorantes:

    Pueden ser: -Naturales: -animales: carmín.

    -vegetales: hematoxilina, azafrán.

    -Artificiales: -ácidos: eosina, son colorantes citoplasmáticos

    -básicos: azul de metileno, son colorantes nucleares.

    -neutros: eosinato de azul de metileno, tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.

    La coloración puede ser:

    Ortocromática: cuando los tejidos toman el mismo color al de la solución empleada.

    Metacromática: cuando los tejidos toman un color diferente el del color empleado.

    La técnica de coloración más empleada es la de hematoxilina-eosina.

    Montaje: para proteger el preparado y evitar su deterioro se lo cubre con un cubre objetos de vidrio, colocando previamente bálsamo de canadá.

    Basofilia: tejidos que reaccionan con colorantes básicos, por ejemplo cromatina y los nucleolos.

    Asidofilia: tejidos que reaccionan con colorantes ácidos, por ejemplo filamentos citoplasmáticos.

    Clasificación de fijadores:

    -químicos: -simples: constituidos por una solo sustancia química. Formol al 40%, conocido también como formalina y se emplea al 10%, 25% diluido en agua.

    Para fijar extendidos desangre y de líquidos de punción.

    -compuestos: liquido de flemming que es un excelente fijador para la célula. Liquido de bouin que permite fijar piezas de hasta 1cm de grosor.

    -físicos: -color seco: se unas en bacteorología.

    -color húmedo: se usa para fijar invertebrados.

    -frió: es un buen fijador, pues cuando deja de actuar, se reinician los procesos pos mortem.

    -desecación: en extendidos de sangre. Líquidos de punción.

    5 . Técnicas citoquímicas:

    Método de feulgen: es especifica para detectar la presencia de ADN, algunos hidratos de carbono y lípidos.

    Se realiza una hidrólisis suave con cloruro de hidrógeno, lo que separa las purinas de la desoxirribosa. Luego se coloca el reactivo de schiff que reacciona con dos grupos aldehídos, revelándose la presencia de cromatina.

    El reactivo de schiff, se utiliza para detectar el ácido desoxirribonucleico, algunos hidratos de carbono y lípidos.

    Para detectar ADN por medio de la reacción de feulgen, los cortes de tejido fijado se someten a una hidrólisis ácida débil y luego se tratan con el reactivo de schiff. Esa hidrólisis es suficiente para extraer el ARN, pero no el ADN. La hidrólisis ácida entre las purinas del ADN al nivel de la unión de la desoxirribosa - purina por lo que se liberan los grupos aldehídos de la desoxirribosa. Los grupos aldehídos libres reaccionan con el reactivo de schiff.

    Reacción de PAS: se basa en la oxidación de los grupos glicólicos 1-2 de los polisacáridos mediante el ácido periódico, lo cual produce la liberación de los grupos aldehídos que entonces dan positiva la reacción de schiff.

    6 . Cultivo celular:

    Para estudiar el comportamiento, crecimiento, reproducción y metabolismo de las células se recurre al método de cultivo en laboratorio. El cultivo de células consiste en la extracción de células de su medio que luego se colocan en un recipiente de vidrio esterilizado, la caja de petri contiene un medio de cultivo, que son nutrientes, que van a facilitar el crecimiento o cultivo de células.

    El cultivo implica la extracción de pequeños trozos de tejido vivo bajo rigurosas condiciones de esterilidad, por lo que se les coloca en un medio apropiado de cultivo a 37ºC manteniendo a loas células en condiciones de humedad y oxigenación. Para evitar la contaminación de los cultivos, este procedimiento se realiza dentro de cámaras de flujo laminar con ultravioleta que solo se conectan en el momento de trabajar porque es nocivo para la salud.

    7 . Técnica inmunocitoquimica:

    Se basa en propiedades antigénicas de los componentes celulares, por eso se utilizan anticuerpos para su detección. Los anticuerpos están compuestos por cuarto péptidos que les dan a las moléculas la forma de una Y, con dos sitios de fijación para el antígeno. Una vez formado el complejo antígeno-anticuerpo, puede ser revelada por medio de marcadores especiales con ayuda del microscopio óptico, electrónico o de fluorescencia.

    - métodos directos: consiste en tomar un animal e inyectarle un antígeno, el cuerpo genera anticuerpos y luego se extrae sangre del animal, en el suero se marcan los anticuerpos con marocromo (colorante fluorescente) y se une el antígeno para encastrarlo o seguirlo. Los anticuerpos pueden conjurase con colores fluorescentes, que permiten la detección del complejo mediante el microscopio de fluorescencia.

    - método indirecto: se realizan todos los pasos del método directo, pero a los anticuerpo primarios no se los marca, e toma otro animal y e coloca el antígeno que genera anticuerpos y estos si son marcados. Se le extrae sangre asta llegar al suero y se marcan los anticuerpos del otro animal (secundarios). Se toma el tejido del primer animal y se le colocan los anticuerpos del segundo.

    Otra técnica inmunocitoquimica indirecta que requiere la ayuda del microscopio electrónico se basa en la aplicación de partículas de oro coloidal, las cuales son muy opacas a los electrones.

    8 . Autorradiografía:

    Esta técnica se utiliza para localizar radiactividad emitida por isótopos que se hayan depositados en diferente tejidos, los cuales pueden demostrarse por su capacidad de interactuar con los cristales de bromuro de plata de las emulsiones fotográficas. En una radioautografía la sustancia en estudio es incorporada a la célula y localizada mediante una emulsión fotográfica. El corte tisular se pone en contactó con la emulsión fotográfica durante un breve tiempo, la radioautografía se revela como una fotografía común. Superponiendo la imagen fotográfica con las células procesadas para ser examinadas con el microscopio, puede obtenerse una idea precisa acerca de la localización del radioisótopo. De las técnicas radioautográficas la más utilizada es la que emplea emulsiones liquidas. El radioisótopo más usado es el tritio.

    Biología

    Guía de Estudio y Trabajo Practico Nº 1 y 2

  • Microscopio óptico: esquema, partes y funciones.

  • Microscopio electrónico de trasmisión y barrido: componentes, características. Diferencias con microscopio óptico.

  • Microscopio de contraste de fase y de Nomarski. Fundamento de su funcionamiento.

  • Técnica histológica: conceptos, etapas y características.

  • Técnicas citoquímicas: feulgen y PAS.

  • Cultivo celular.

  • Técnicas inmunocitoquímicas.

  • Autorradiografía.