INVERTASA DE LEVADURA

En esta práctica vamos a ver la acción de la invertasa y calcularemos entre otras cosas la velocidad de la reacción que cataliza. La actividad enzimática se pone de manifiesto incubando el sustrato juntamente con la enzima y posteriormente paramos la reacción y medimos coloriméticamente la reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico que es lo que nos va a determinar la velocidad de la reacción. Se basa en que la sacarosa no contiene átomo de carbono anomérico libre y por lo tanto no es un azúcar reductor.

La enzima invertasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa a glucosa y fructosa, frecuentemente a esta reacción se denomina “inversión”. La invertasa se puede conseguir de células de levadura que se rompen por auto lisis, centrifugando y tomando el sobrenadante.

Materiales: levadura de panadería, espectrofotómetro, baño termostatizado y centrífuga de mesa.

Reactivos:

- Bicarbonato sódico 0,1M

• Tampón acetato sódico 0,025M, pH:4,5

• Ácido 3,5-dinitrosalicílico

• Reactivo Biuret

• Disolución patrón de albúmina sérica bovina

• Disolución de glucosa 0,0025M- fructosa 0,0025M (azúcar invertido)

• Disolución de sacarosa 0,25M

3-MÉTODO EXPERIMENTAL: REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA

3.1.Obtención del extracto libre de células:

Disgregamos 25 g de levadura en un mortero. Lo colocamos en un erlenmeyer y añadimos 50 ml de NaHCO3 0,1M. Agitamos y tapamos con algodón para meterlo en en una estufa seca a 40 ºC durante 24h. Así conseguimos que las celulas de levadura se lisen y posteriormente centrifugamos la mezcla a 4000 rpm durante 15 min.

Se recoge el sobrenadante (invertasa) y se guarda en un refrigerador. El volumen del sobrenadante fue de : 45 ml.

3.2.Preparación de la curva patrón de azúcar invertido.

Preparamos la siguiente serie de tubos de ensayo:

El tubo nº 0 es el blanco y contiene sólo 2ml de agua (sin azucar invertido) y con los 2 ml del ácido.

El color aparecerá al calentar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 4 min. Posteriormente diluimos hasta 10 ml con agua destilada y leemos la absorbancia a 450nm frente al tubo blanco. Con estos datos construimos la curva patrón.

3.3. Determinación de la dilución óptima para el ensayo enzimático.

Del sobrenadante se preparan distintas diluciones para saber saber cual es la concentración adecuada para realizar el ensayo. Se preparan las siguientes diluciones:

1:10, 1;50, 1:100, 1:150 , 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:500

De estas diluciones se toma 1 ml. Admás se preparan dos tubos adicionales con 1ml de agua destilada y otro con 1ml de sobrenadante original. Añadimos a todos los tubos 1ml de tampón acetato 0,025 M pH 4,5 y dejamos 5 min a temperatura ambiente. Añadimos posteriormente de manera secuencial desde el tubo 0 1ml de sacarosa 0,25M, agitamos y dejamos a temperatura ambiente durante 15 min. Se añade 2 ml de ácido 3,5-dinitrosalicílico en el mismo orden en que se añadió la sacarosa. Metemos los tubos en agua hirviendo durante 4min de esta manera aparecerá el color. Enfriamos y diluimos hasta 10ml con agua destilada. Leemos la absorbancia de cada tubo a 540nm frente al tubo blanco (tubo nº 0). La absorbancia cercana a las 0,4 unidades será la dilución adecuada.

Según estos resultados nuestra dilución óptima y con la que trabajaremos a partir de ahora es 1:250 ya que es el valor más próximo a 400.

3.4. Variación de la concentración del sustrato.

Para esto preparamos los siguientes tubos:

A cada tubo se añade 1ml de tampón acetato y 1ml de la dilución ezimática óptima, mezclamos bien y dejamos reposar durante 15 min a temperatura ambiente. A los 15 min se para la reacción añadiendo 2ml de ácido 3,5-dinitrosalicílico (tambien en orden comenzando por el uno como con la dilución enzimática que contiene invertasa). El color aparece al hervir los tubos durante 4min. Enfriamos y diluimos hasta 10ml con agua destilada. Medimos la absorbancia a 540 nm como blanco el tubo 1. Los resultados aparecen en la tabla superior en cursiva.

Yendo a la curva patrón de azucar invertido con la absorbancia que nos ha dado calculamos la concentración de sacarosa. Con estos resultados hallamos la velocidad de la reacción y realizamos las gráficas.

3.5. Determinación de la concentración proteica por el método de Biuret.

Primero se construye una curva patrón de protenina utilizando una dilución de albúmina de concentración conocida (10mg/ml) y se mide la absorbancia a 550nm frente al tubo nº 0 (blanco). Para ello antes se debe de añadir a cada tubo 4ml de reactivo de Biuret, mezclar agitándolo y dejar durante 30 min a temperatura ambiente. Nota: este ensayo se hace por duplicado.

Así conocemos la concentración de la protenina. Y para conocer la cantidad de proteína por ml, realizamos esta serie de tubos (y procedemos de igual manera que anteriormente (4ml de biuret, agitar, 30 min.... midiendo la absorbancia a la misma longitud de onda).

Así de la curva patrón de proteína se calcula la concentración de proteína de la disolución enzimática adecuada.