EXTRACCIÓN DE ADN HUMANO.

OBJETIVOS:

• Aislar ADN cromosómico de sangre periférica total de humano

• Analizar sobre la importancia del conocimiento de la molécula de la vida en la medicina del futuro.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS:

Todas las células, a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen ADN en sus núcleos celulares. También podemos encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequeña; por este motivo no representa una fuente conveniente de extracción, aislamiento y purificación, para ser empleado en diferentes estudios de carácter genético, biológico. y/o bioquímico. Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolécula en pequeños fragmentos.

Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja actividad de DNAasa.

El tejido linfoide, y en este caso el timo y el bazo representan materiales biológicos que son utilizados con mucha frecuencia como fuente de cantidades considerables de ADN para diferentes estudios.

Después de extraído el ADN suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción, aislamiento y purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la célula de la cual proviene. El estrés o tensión mecánica o físico química, que

acompañan los procesos de purificación de las moléculas de ADN deben ser evitadas al máximo y las nucleasas inhibidas.

Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extracción y purificación del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la acción de las enzimas que digieren estas moléculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea posible y en frío.

Las nucleoproteínas, son proteínas que aparecen asociadas con los ácidos nucleicos de las células eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica pero solubles en soluciones de alta fuerza iónica; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extracción inicial.

MATERIALES Y REACTIVOS :

PROCEDIMIENTO:

(Para la ejecución de ésta práctica cada estudiante debe traer tapabocas, gorro quirúrgico y un par de guantes desechables).

Extracción de ADN Humano:

1. Tomar una muestra de 3 a 5ml de sangre en un tubo vacuntainer con EDTA.

2. Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Separar la capa de glóbulos blancos que se encuentra en medio del plasma y los glóbulos rojos.

3. Pasarlas a otro tubo de ensayo y agregar 10ml de agua destilada, tapar el tubo e invertirlo tres veces.

4. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm descartar el sobrenadante.

5. Al sedimento (pequeño botón blanco), se le agregan 10ml de tritón X100 al 1%. Tapar el tubo y agitar suavemente de manera constante durante unos minutos hasta resuspender perfectamente el sedimento.

6.Centrifugar 10 minutos a 5000rpm, descartar el sobrenadante.

7. Al sedimento se le agregan 5ml de SDS al 1% (agitar suavemente y resuspender el botón). Pasar el contenido a un tubo de ensayo con tapa y agitar suavemente durante unos minutos más.

8. Agregar 5ml de NaCl 0,1M agitar y dejar reposar por unos minutos.

9. Agregar 10ml de etano frío. Agitar muy suavemente y observar como se precipitan los filamentos de ADN

10. Colectar el ADN con una punta para micropipeta de 10µl a 100µl (punta amarilla) y llevarlo a un tubo que contenga 4ml de amortiguador salino.

11.En caso de que no se pueda colectar el ADN con la punta, se procede a centrifugar 5 minutos a 3000 rpm, se descarta el sobrenadante y al sedimento se le agregan 4ml de amortiguador.