Cuantificación del contenido protéico y de agua

Biología. Cantidad de proteínas. Centrifugación diferencial. Método de Lowry. Espectrofotómetro. Reactivos

  • Enviado por: Fernando Galisteo Valle
  • Idioma: castellano
  • País: España España
  • 4 páginas
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PRÁCTICA 1

OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS PARA CUANTIFICACIÓN DE SU CONTENIO PROTEICO

Objetivo de la práctica: utilizando semillas y frutos, analizaremos el contenido de la proteína. Antes haremos un homogenado del material, una centrifugación diferencial para separar materiales.

El material utilizado será:

-semillas o frutos

-Homogeneizador de vidrio

- Tampón de homogeneización (Tris-Mes 50 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, DTT 5mM, PMSF 0,5 mM)

-Pipetas de vidrio.

-Pipetas de plástico de un solo uso

-Pipetas automáticas (para extraer pequeñas cantidades de una sustancia).

-Placas de Petri (donde depositaremos la muestra inicial).

-Tubos cónicos y eppendorf (donde depositaremos la sustancia final para que su composición sea analizada).

-Pinzas

-Centrifugadora de mesa

-balanza granatario y estufa de desecación

Descripción de los pasos efectuados:

1. Utilizando una naranja, pesamos por duplicado 5 gramos de esta sustancia. Una pesada va al horno de desecación (el cual va a extraer toda el agua de la muestra).

2. Los otros 5 gramos, los trituraremos y homogeneizaremos con el liquido homogeneizador de vidrio y el tampón homogeneizador.

3. una vez bien triturada la muestra de fruta, con el tampón introducido al máximo en el homogeneizador de vidrio extraeremos con pipetas de plástico de un solo uso. Los depositaremos en una probeta de plástico graduada. Enrasamos hasta llegar a la cantidad de 10 ml.

4. A continuación, utilizamos las pipetas de un solo uso para transportar estos 10 ml a una probeta de vidrio mar cada con la letra N.

5. Esta probeta se introducirá en la centrifugadora de mesa a 1800 revoluciones por minuto.

6. cuando extraemos la probeta tras ser centrifugada vemos una clara separación del material pesado en el fondo, y la disolución sin posos situada por encima.

7. Extraemos el máximo de líquido posible de la probeta de vidrio(N). La cantidad extraída es 9 ml.

8. Con la pipeta automática extraeremos 500 µl, y los depositaremos en el Eppendorf marcado con la letra N para analizarlo en el laboratorio.

A continuación hacemos un proceso similar al anterior con zumo comercial:

1. Extraemos 10 ml de zumo comercial a la probeta graduada.

2. Estos 10 ml se traspasan a la probeta de vidrio marcada con la letra C, y se llevan a la centrifugadora de mesa. Se centrifuga a 1800 revoluciones por minuto.

3. Al ser centrifugado el zumo comercial, vemos al igual que el zumo natural hay una clara separación entre los posos y el liquido. De los 10 ml iniciales, sacamos 8,5 de líquido. Y de estos, trasportamos con la pipeta automática 500 microlitros, que depositamos en el Eppendorf(C).

Las dos muestras del Eppendorf: C y N serán utilizadas en la próxima práctica para analizar la composición de los zumos.

PRÁCTICA 2

CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEINA TOTAL DE UNA MUESTRA

MÉTODO DE LOWRY

DETERMINACIÓN DE CONTENIDO DE AGUA

Objetivo de la práctica: En esta práctica vamos a determinar la cantidad de proteina existente en las muestras de zumo natural y comercial obtenidas en la práctica 1. Además se calculará el contenido proteico en relación al peso seco y fresco de la muestra.

El material utilizado será:

-Muestras de zumo natural y comercial de la práctica 1.

-Proteína de referencia o patrón: BSA (albúmina sérica bovina).

-Tubos para introducir en el espectrofotómetro (C1, C2,N1 Y N2)

-Agua bidestilada

-Agitador mecánico

-Espectrofotómetro: Aparato que nos dice en unidades de absorbancia la cantidad de luz que absorbe una sustancia contenida en los tubos de espectrofotómetro. Este aparato tiene un haz de luz de 700 nm.

-Reactivos:

-Reactivo A: NaOH 4g/L; NaCO3 20g/L; Tartrato NaK 1 g/L

-Reactivo B: CuSO4

-Reactivo C (A+B) en proporción 49:1

-Reactivo D: Es un reactivo comercial (Folin) disuelto en agua bidestilada.

Descripción de los pasos efectuados en la práctica:

1. Para obtener el reactivo C mezclamos reactivo A y B. Utilizamos 14 ml de A, para ello los extraemos del tubo con una propipeta y una pipeta de vidrio. Como la proporción es 49:1, estos 14 ml los unimos a 0,285 ml de B, extraídos con una pipeta automática.

2. A continuación introducimos en los tubos del espectrofotómetro 100 l de zumo natural en cada uno de los tubos (N1 y N2) y añadimos 200 l. Para ello utilizaremos la pipeta automática. También en cada uno de los tubos de espectrómetro con la inscripción C1 y C2 introduciremos 50l de zumo comercial, añadiéndole 250l de agua destilada. También realizaremos proceso con pipeta automática.

3. Introducimos en cada uno de los 4 botes del espectrómetro 3 ml de reactivo C. En nuestro caso hemos utilizado la pipeta automática. Lo removemos con el agitador mecánico, y lo dejamos reposar 10 minutos.

4. Al reactivo D le hemos añadido 1 ml agua destilada. Y una vez obtenemos esta mezcla introducimos 300l de dicho reactivo en los cuatro tubos de espectrofotómetro con una pipeta automática. Los agitamos, y los dejamos reposar 30 minutos a temperatura ambiente.

5. Realizamos una tabla de referencia con el nivel de absorbancia teórica de la proteína BSA. Esta es una proteína bastante purificada a partir de la cual hemos obtenido las pautas de absorbancia introduciendo muestras de esta proteína en el espectrómetro.

Proteína BSA (l)

H2O destilada (l)

Nivel de absorbancia

0

300

0.0

50

250

0.1

100

200

0.2

150

150

0.3

200

100

0.4

6. Llevamos a cabo el experimento práctico de medir el nivel de absorbancia de una cantidad conocida de proteína BSA. Para llegar a una conclusión más cercana a la real realizaremos el experimento dos veces y haremos su media.

Cantidad de BSA (g)

Nivel absorbancia (1)

Nivel absorbancia (2)

Media - valor inicial

0

0,018

0,019

0,023-0,023=0

50

0,276

0,283

0,2795-0,023=0,2565

100

0,486

0,470

0,478-0,023=0,455

150

0,634

0,636

0,635-0,023=0,612

200

0,770

0,722

0,746-0,023=0,723

A todos estos valores se les resta el valor de absorbancia inicial del agua (0,023) pues no nos interesa en nuestro estudio.

Cada uno de estos valores de absorbancia obtenidos se divide por el nivel de proteínas de cada paso:

Cantidad de BSA(g)

Absorbancia/BSA

Resultado

50

0,256/50

0,0051

100

0,455/100

0,0045

150

0,612/150

0,0040

200

0,723/200

0,0036

7. Haciendo una media de los valores finales, obtenemos la pendiente de la recta patrón. El valor obtenido es:

Media=0,0043

A los valores obtenidos en el espectrofotómetro los dividimos por la pendiente y obtenemos así la cantidad de proteínas BSA de la muestra dada en g.

VALORES OBTENIDOS EN EL ESPECTROFOTÓMETRO:

1ª muestra de zumo natural (N1): 0,712

2ª muestra de zumo natural (N2): 0,732

1ª muestra de zumo comercial (C1): 0,9

2ª muestra de zumo comercial (C2): 0,930

Hacemos la media de los valores de zumo natural y de los valores de zumo comercial:

Media de N1 y N2: 0,722

Media de C1 y C2: 0,915

Para saber la cantidad de proteínas contenidas en las muestras de zumo las dividiremos por la pendiente de la recta obtenida al valorar el nivel de absorbancia en una cantidad conocida de proteínas BSA. El valor por el que hay que dividir es 0,0043.

EL ZUMO COMERCIAL:

0,915/0,0043= 212,79 g de proteínas contenidas en 50 l de zumo comercial. Por cada l de zumo comercial encontramos 4,255 g de proteínas BSA.

EL ZUMO NATURAL:

0,722/0,0043=167,90 g de proteínas contenidas en 100 l de zumo natural. Por cada l de zumo natural encontramos 1,679 g de proteínas BSA.

Nos piden la cantidad de proteínas contenida en la muestra inicial de zumo de la práctica 1 tanto de comercial como artificial.

La muestra inicial de zumo comercial contenía 8,5 ml, por lo tanto obtenemos 3616,75 g de proteínas BSA.

La muestra inicial de zumo natural contenía 9 ml, por tanto tiene 1511,1 g de proteínas.

8. En la práctica 1 pesamos por partida doble 5 gramos de naranja natural. Una de las muestras fue introducida en la estufa de desecación. Una semana más tarde la muestra esta ya preparada, pues ha sido extraída el agua de su composición. El, peso final de la muestra es de 0,63 gramos.

PARÁMETROS

VALOR OBTENIDO

VALOR OBTENIDO

PRODUCTO NATURAL

PRODUCTO COMERCIAL

PESO FRESCO

5,1 g

PESO SECO

0,63 g

VOL. MUESTRA

9ml

8,5ml

Concentr. proteína

1,679µg/µl

4,255µg/µl

Concentr. Total(prot. por volumen)

1511,1µg

3616,75µg

PROTEÍNA/PESO FRESCO

0,071g/g PF

PRTEÍNA/PESO SECO

0,574g/g PS

Porcentaje de proteína del PF

7,1%

Porcentaje de proteína del PS

57,4%

Contenido en Agua

4,47g/g

Porcentaje de agua del PF

87,64%

-Conclusiones: El zumo de naranja comercial contiene aparentemente más proteínas que el zumo de naranja natural. Esta apariencia se podría deber a las sustancias que se han añadido para mantener el zumo en buen estado, o bien a la pérdida rápida de proteínas por evaporación u homogeneización del zumo natural en el proceso del laboratorio.