Tema 10: Bases de genética

Hay 5 tratados sobre genética; todos sirven, pero el más adecuado es el último: Genética, Griffiths y cols. (1995). Editorial Interamericana.

La genética hoy es muy relevante, porque aparece relacionada a todos los temas de biología. Es indispensable para el estudio de todo animal o planta. Vamos a centrarnos en el hombre. Se ha estudiado mucho a la «mosca de la fruta» (Drosophila), es sobre la especie que más estudios hay. En ella se encontró un modelo sencillo para estudiar: tiene pocos cromosomas y es una especie fácil de reproducir durante muchas generaciones.

La genética es necesaria para entender la herencia de caracteres. En un primer momento se consideró el estudio de la herencia. Pero la genética no se llama «genética» hasta los trabajos de G. Mendel. Él es el primero que nos viene a hablar de la existencia de «genes», de unos caracteres hereditarios. Cuando se conocen sus trabajos se entiende que la genética es el estudio de todo lo relacionado con los genes. Estos genes están en el núcleo.

La membrana que tiene el núcleo es diferente de la membrana celular o plasmática: no es una capa doble, son dos capas. Un poro sería como una puerta de discoteca, con un portero que sólo deja pasar a algunos. Los poros están formados por proteínas. Los canales iónicos permiten que los iones pasen, pero no otros elementos.

De ese material genético, desde Mendel, se sabe que lo importante es el gen. Gen: un trozo de cadena de la molécula de ADN; molécula blanquecina y ácida, formada básicamente por ácido desoxirribonucleico. Están codificadas en los genes las distintas características de las distintas especies. Genomio: es el conjunto de genes de un individuo. Estas cadenas formadas por ADN van a formar los cromosomas. El ADN es difícil de ver a microscopio electrónico, pero los cromosomas se pueden ver incluso al óptico. Eso indica que en ellos el ADN está empaquetado (con intervención de histonas). En cada célula vamos a encontrar unas docenas de cromosomas y unas docenas de miles de genes.

Cuando nos hablan de genes vienen a nuestra cabeza todos los avances actuales en Ingeniería Genética. Ésta trabaja en busca de resultados positivos (p. ej. creación de especies híbridas mejor adaptadas a las necesidades de la producción). También se está intentando aplicar a células somáticas para tratar enfermedades como el cáncer; o para tratar alteraciones génicas, como el síndrome de Down.

Pero la determinación génica no sólo depende de los genes, sino también del ambiente. El ambiente influye mucho en la manifestación de los genes con que cuenta el individuo. Los microambientes creados dentro de las células también van a ser considerados ambientes.

Anemia Falciforme

La hemoglobina es la proteína que lleva el oxígeno en los glóbulos rojos. La Anemia Falciforme es una pérdida de capacidad para transportar. Es consecuencia de la sustitución de un aminoácido por otro (glutámico por valina) en la cadena de la hemoglobina. Esto hace que los hematíes cambien de forma, y que aparezcan coágulos. Cuando estos coágulos van por vasos grandes no pasa nada, pero el problema es cuando van por un vaso más estrecho que el propio coágulo, entonces cortan la circulación. Estos cortes de flujo sanguíneo pueden producir fallos y lesiones en cualquier sistema corporal. Todo esto es consecuencia de un cambio en la información del ADN sobre la secuencia de aminoácidos de la hemoglobina.

¿Dos individuos podrían tener el mismo genotipo? ¿Y el mismo fenotipo? «NO», es la respuesta para las dos preguntas. Tenemos mutaciones espontáneas que se pueden producir en cualquier momento de nuestro desarrollo, así que ni los gemelos homocigóticos tienen exactamente la misma dotación génica. Para lo que sí pueden ser iguales dos individuos es para un gen concreto.

• Un mismo genotipo puede dar diferentes fenotipos.

• Un mismo fenotipo puede proceder de diferentes genotipos. Esto depende del ambiente. Incluso el mismo ambiente, según el gen, actúa de diferente manera.

El retículo endoplásmico es el que reconstruye la membrana nuclear después de la división celular. El retículo endoplásmico está conectado a su vez a la membrana celular.

Hay zonas de estrechamiento de la membrana nuclear, ahí están los poros. Los poros están constituidos por proteínas, que regulan la entrada y salida de moléculas.

¿Por qué tenemos que pensar entonces que el ADN es el transmisor de la información?

En el núcleo vemos zonas claras y zonas densas. En las densas el ADN está más espiralizado y condensado, asociado a proteínas; recibe el nombre de heterocromatina. En las claras está menos condensado y recibe el nombre de eucromatina. Esta eucromatina, que está menos espiralizada, es la que puede ser leída, la heterocromatina no.

El ADN se condensa en etapa de la división celular dando lugar a los cromosomas metafásicos.

Podemos marcar el material con que se va a sintetizar nuevo ADN para verlo de otro color. Se forman así los llamados 'cromosomas arlequín': el material marcado hace que tengan dos colores. Estos cromosomas con material marcado permiten ver el efecto de las drogas en el intercambio de ADN entre cromosomas.

Se pueden observar los cromosomas incluso al microscopio óptico. Si algún cromosoma está anómalo eso va a afectar a muchas características (no en vano muchos genes están afectados).

Experimentos importantes para la genética

Estos experimentos son de un diseño muy simple y muy claro. Lo importante en investigación son las ideas más que el dinero.

Primer experimento: Griffith (1928)

El primer experimento que vamos a ver es de los años 20. Este experimento lo realizó Griffith en 1928. Trabajaba en la sanidad inglesa, cuyo principal problema en aquella época era la neumonía (una muerte segura). Esta enfermedad es causada por bacterias. Una bacteria es un ser muy primitivo, unicelular, procariota (que no tiene núcleo y por lo tanto la información génica está en el citoplasma). Se sabía que unas bacterias causaban la enfermedad y que otras, sin cápsula, no hacían enfermar. Realizó las siguientes pruebas y obtuvo estos resultados:

1.Las bacterias con cápsula sí mataban al ratón

2.Las bacterias sin cápsula no mataban al ratón

3.Las bacterias con cápsula y matadas con calor no mataban al ratón

4.Las bacterias sin cápsula + las bacterias matadas con calor sí mataban al ratón

Ante el 4º caso miró en la sangre de los ratones muertos y vio bacterias encapsuladas y virulentas. Algo se había transmitido de unas a otras (un «principio transformante»). Creyó que ese principio transformante era algo que había en la bacteria.

Segundo experimento: Harshey y Chase (1952)

Ya se conocían los isótopos radiactivos. Los fagos son virus, ADN encapsulado. Un virus sólo puede reproducirse infectando a un ser o célula procariota o eucariota. Hay virus que tiene como información ADN y otros que tienen ARN.

Partían de los fagos (de bacteriófagos, "comedores de bacterias"). Cogieron fagos y los pusieron a reproducirse en un medio con fósforo radiactivo. Así, cuando hicieron su copia ésta quedó marcada. Otros fagos se pusieron un medio con isótopos de azufre. Su cápsula está formada por proteínas (que contienen S); y, cuando se reproduzcan, incorporan azufre radiactiva en dicha cápsula. Vemos que en los primeros fagos lo marcado es la información génica y en los segundos la cápsula.

Luego estos fagos se ponen en contacto con las bacterias. Se agita la unión para que las cápsulas de los virus se separen de la superficie de las bacterias. Se centrifuga para que cápsulas de virus vacías y bacterias infectadas, al tener distinta densidad, queden en distintas capas.

Se demostró que el ADN es el transmisor ya que, en el primer caso, eran las bacterias las que presentaban radiactividad y en el segundo eran las cápsulas vacías.

¿Cómo es el ADN?

Antes del modelo de Watson y Crick ya se sabía que el ADN estaba formado por módulos (nucleótidos) unidos entre sí. Los nucleótidos pentosa + ácido fosfórico (fosfato) + base nitrogenada. Esta información no era la única con la que contaban estos dos investigadores, sino que también obtenían información por difracción de rayos X: parecía ser una hélice. Además, se sabía que el número de T+C=A+G, y que el de T=A y el de C=G. A partir de todo esto ellos pudieron desentrañar la estructura del ADN. Eran las bases nitrogenadas las que enlazaban las dobles cadenas, que corrían paralelas. Los enlaces entre las bases eran muy débiles: de puente de hidrógeno. El enlace de hidrógeno tiene un 3% de la fuerza de uno covalente. Es fruto de la atracción entre H y O. Siempre se enlazaría adenina con timina y guanina con citosina. El enlace CG es más fuerte que el AT: el CG implica 3 enlaces de H y el AT sólo 2. En la hélice doble van sumándose las fuerzas de estos enlaces hasta que es necesaria una fuerza considerable para separar ambas cadenas.

Las cadenas son complementarias. Así, cuando se separan las cadenas, cada una va a servir como molde para que se forme la complementaria y se obtengan dos dobles cadenas iguales.

Este descubrimiento de Watson y Crick es del 53. A partir de entonces se empezó a desentrañar el funcionamiento. El código de información tiene que estar en lo que cambia: las bases nitrogenadas.

Introducción a la estructura molecular del ADN

El ADN es una macromolécula grande, compleja, formada por una secuencia de monómeros repetitivos. Todos los organismos contienen cadenas de ADN en sus células. La característica principal es su capacidad para la replicación. Están formados por:

• Grupos fosfato: fósforo unido a oxígeno.

• Anillos de azúcar (pentosas): cíclicos, pentagonales. Estas pentosas están basadas en el carbono. La ribosa aparece en el ARN, la desoxirribosa en el ADN. La diferencia es que en la ribosa hay un grupo hidroxilo (OH) que en la desoxirribosa es sólo un H.

• Bases nitrogenadas: purinas (adenina y guanina) y pirimidinas (citosina, timina y uracilo). ADN y ARN contienen purinas y pirimidinas, pero en el ARN en lugar de timina hay uracilo.

Lo que confiere al ADN la capacidad de codificar la información es la sucesión de bases a lo largo de la cadena. La cadena está constituida por la unión de bases complementarias. La información está en función de la secuencia de las bases.

La estructura de Watson y Crick se basó en cristalizar moléculas de ADN y pasar rayos X a través de ellas. Esto les llevó a creer que era una doble hélice. Propusieron que cada una de las dos hebras era complementaria a la otra. El esqueleto de cada hélice estaría formado por pentosas (desoxirribosas) unidas por enlaces fosfato. La unión de las bases sería lateral a los azúcares. Las dos cadenas, complementarias, estarían unidas por las bases mediante enlaces de puente de hidrógeno. Los enlaces sería AT (2 enlaces de hidrógeno) y CG (3 enlaces de hidrógeno, más fuerte).

Hoy, con microscopía electrónica, se pueden obtener imágenes tridimensionales de las moléculas de ADN.

Los organismos son capaces de replicar su ADN. Se propusieron varios modelos:

• Modelo conservativo: se conservaba la molécula de ADN original y se hacía una copia que era la molécula hija.

• Modelo dispersivo: se copiaban fragmentos de la molécula de ADN original. En cada una de las dos moléculas resultantes había trozos de la original y otros trozos nuevos.

• Modelo semiconservativo: en las moléculas de ADN hijas una hebra parental y la otra sintetizada (hija).

Watson y Crick eligieron éste último modelo como el más posible. Pero, ¿cómo se explica?

Experimento de Meselson y Stahl (1958)

Meselson y Stahl intentaron demostrar cuál era el modelo que explicaba la replicación del ADN. Llenaron un tubo de ensayo con cloruro de cesio (CsCl). El cloruro de cesio es una sal, y el cesio un elemento muy pesado. Hicieron que el tubo se centrifugara a altas velocidades. Esto produjo un gradiente, una distribución de moléculas a lo largo del tubo que van de menor concentración a mayor concentración.

Luego cultivaron bacterias (que tienen el ADN circular), rompieron su pared celular y extrajeron su ADN. Lo introdujeron en el extremo superior del tubo. Centrifugaron de nuevo. El gradiente del CsCl no iba a cambiar, pues se había establecido un equilibrio entre fuerzas antagónicas (centrífuga y de sedimentación), pero el ADN iba a bajar hasta detenerse en un punto en que su densidad coincidiera con la densidad del CsCl de esa porción del tubo.

Lo que hay que hacer es distinguir el ADN marcado radiactivamente del ADN no marcado. Para marcar introdujeron una fuente radiactiva, cloruro de amonio radiactivo (15*NH4Cl), en el cultivo. El ADN de las bacterias incorpora ese 15*N radiactivo a su estructura (a sus bases). El 14N normal tiene un peso atómico de 14, el 15*N radiactivo que añadieron al cultivo tiene peso atómico 15. Esta diferencia en peso podría producir 2 bandas distintas en el tubo. El ADN con 15*N forma una banda un poco más alejada (más al fondo). Cuanto más pesadas son las moléculas más se acercan al fondo del tubo.

Para llegar a la conclusión de que el modelo de replicación adecuado era el semiconservativo hicieron lo siguiente: incubaron bacterias con 15*NH4Cl (radiactivo). Observaron la banda que formaba el ADN marcado en el tubo (con luz ultravioleta, pues el ADN tiene la propiedad de absorberla). Luego pasaron algunas bacterias a un cultivo con 14N normal. A medida que las generaciones avanzan la banda del 15*N va desapareciendo, apareciendo bandas intermedias entre la del 15*N y la del 14N.

Interpretación: en un principio todas las bacterias tendrían en su ADN 15*N (radiactivo). En la primera generación, si suponemos que la replicación es del tipo semiconservativo, las dobles hélices contendrían una cadena parental (radiactiva: con 15*N) y otra sintetizada (no radiactiva: con 14N).

Experimento de Taylor (1958)

Venía a demostrar lo mismo que el anterior, pero de manera más sencilla. Taylor extrajo células vegetales de la raíz de una planta (judías). Las células vegetales las incubó in vitro. Les añadió timidina marcada con un isótopo de H radiactivo (3*H). El resultado es timidina tritiada (3*H-T) -radiactiva-. Ésta se añadió al medio de cultivo durante un tiempo para que las células la incorporaran. Pusieron una placa fotográfica sobre el medio de cultivo, que permitía observar lo que ocurría en los cromosomas. Vieron que en la metafase ambas cromátidas del cromosoma estaban marcadas. Cómo lograron esto: añadiendo colchicina (una sustancia vegetal), que puede impedir la generación del huso mitótico. Si impedimos la generación del huso, podemos detener la mitosis y observar los cromosomas metafásicos.

Pusieron algunas de estas células en otros cultivos con timidina normal. En la segunda división añadieron colchicina y observaron que una cromátida estaba marcada y otra no.

Interpretación: asumimos que una cromátida está formada por una sola doble hélice de ADN. Si asumimos la hipótesis semiconservativa, en la segunda generación una hebra estará marcada y la otra no. Esto fue lo que, en efecto, se observó.

Experimento de Cairns

Consiste en coger unas bacterias y ponerlas en un medio en el que las sustancias (la materia para construir las bases nitrogenadas) están marcadas. Cuando las bacterias vayan a duplicar su ADN tomarán ese material marcado. Cairns dejó que las bacterias se duplicaran una vez, luego otra, e hizo una autorradiografía.

¿En qué consiste la autorradiografía? El material marcado emite una radiación y puede velar, tras un tiempo, una emulsión fotográfica. Lo velado queda de color negro y lo demás transparente. Es una técnica compleja pero muy potente.

Cairns usó la autorradiografía tras la segunda replicación. Encontró que las cadenas de ADN de esa bacteria aparecía:

Cuando se volvieron a dividir aparecían:

Había que interpretar: tenemos una doble cadena en forma de anillo, con una hebra marcada y la otra no.

Cuando se estuvieran duplicando veríamos:

Habría un punto de inicio, donde se empiezan a copiar las cadenas. También habrá un punto final. Nosotros, que no tenemos un ADN en forma de anillo, tenemos muchos puntos de iniciación porque nuestras cadenas son mucho más largas. Organismos mucho más simples que nosotros, como son las levaduras, tienen ya 400 puntos de inicio.

A partir de entonces se buscó qué producía que el ADN se duplicara: se buscaban enzimas que funcionaran como catalizadores de este proceso. Arthur Kornberg descubrió las polimerasa de ADN. Ésta simplemente permitía que una cadena de ADN se duplicara. Es muy activa. Permite que se dé una polimerización (de ahí su nombre). La polimerasa I (o de ADN) tiene la propiedad de copiar en dirección única (5'→3').

Las cadenas de ADN son antiparalelas.

Y, aunque la polimerasa I permita copiar en una sola dirección, ¿cómo es que el proceso de copia avanza en las dos direcciones? Nunca se ha encontrado una enzima que lea en la otra dirección. En estas investigaciones, que buscaban una enzima que leyera en dirección contraria, se hallaron sin embargo otras polimerasas, y se descubrió que la polimerasa I servía también para eliminar errores. La polimerasa II era la que reparaba el error. Se descubrió otra polimerasa: la ligasa, que unía el trozo traído por la polimerasa II. También se descubrió una polimerasa que sirve para deshacer la cadena, abriéndola, pero sin dañarla: la helicasa.

Estas polimerasas actúan constantemente. Si son daños muy grandes ya no son capaces de repararlos (p. ej.: los producidos por radiaciones altas).

La polimerasa I hace que el ADN se replique en dirección 5'→3'. La llamada «cadena retrasada» se sabe como se forma gracias a Okazaki. Este japonés descubrió cómo se forman las cadenas retrasadas y que no se copiaban de continuo, sino en pequeños trozos, conocidos hoy como fragmentos de Okazaki.

Hay un cebador (el ARN cebador), sobre el que se coloca la polimerasa y va leyendo la cadena de ADN. Luego el ARN cebador se coloca en otro lado y lee otro fragmento, y así sucesivamente. Luego llega la ligasa y va uniendo esos fragmentos que se van duplicando.

Cuestiones:

1.- Si nosotros tenemos que la T constituye el 15% de las bases nitrogenadas ¿cuál será el porcentaje de citosina?

T=A=15%; T+A=30%

T+A+C+G=100%; 15%+15%+C+G=100%; C+G=70%

C=G ð C=35%

2.- Si tenemos ADN que presenta un 46% de enlaces CG ¿cuál es el porcentaje de cada base en esa cadena?

C=46/2=23%

G=C=23%

100-GC=AT; 100-46=AT; AT=54%

A=54/2=27%

T=A=27%

3.- ¿Puedo utilizar una técnica de desnaturalización para estimar los enlaces que existen de CG?

La energía que haya que aplicar será dependiente del número de enlaces. Puesto que el CG tiene 3 enlaces de H y el AT sólo 2, cuanto mayor sea el calor necesario para desnaturalizar, mayor número de enlaces CG habrá.

3

Generación 0

Generación 1

Generación 2

Generación 3

ADN No marcado

ADN Marcado

, y no como cabría esperar:

de ahí que veamos:

de ahí que veamos:

3'

5'

5'

3'

polimerasa I

polimerasa II

ligasa

5'

5'

3'

3'

Ligasa

ARN cebador

Polimerasa I