PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE TRIPTOFANO

BIOTECNOLOGÍA PARA INGENIEROS

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

LABORATORIO DE INSTRUMENTACIÓN Y CONTROL

MEDELLÍN, ANTIOQUIA

2007

PERFIL PRODUCTO

1.1. Características generales del producto (1)

Estructura química del triptófano: El triptófano es un aminoácido aromático. Uno de los aspectos más relevantes de su biosíntesis es el mecanismo a través del cual los anillos aromáticos se forman a partir de precursores alifáticos. La parte aromática está unida al carbono a través de un carbono metilénico. El grupo R del triptófano tiene una estructura heterocíclica llamada indol.

Fórmula molecular: C11H12N2O2

Masa molecular: 204,23

Número CAS: 73-22-3

Nombre del producto: Triptófano

Nombre químico: Ácido 2 -Amino -3 indolilpropiónico

Número de registro CAS: 73-22-3

Sinónimos: L-Triptófano, TRP , aminoácido W

Familia química: Aminoácido

Composición: más del 98.0%

Densidad a granel: 0.35 - 0.45 kg/L

Aspecto y olor: Polvo blanco; inodoro; sabor levemente característico.

Solubilidad en agua 1.06 g/100 g de agua a 20°C

Porcentaje volátil: 0%

Índice de evaporación: Ninguno

• DECLARACIÓN DE RIESGOS PARA LA SALUD

Descripción de riesgo: Evitar el contacto con los ojos: leve irritante ocular. De lo contrario, no presenta otros riesgos.

• TRATAMIENTO DE EMERGENCIA

Ayuda de emergencia: Lavar los ojos con agua durante 15 minutos. Asegurar un enjuague completo.

• PROCEDIMIENTOS EN CASO DE DERRAME O ESCAPE

Pasos a seguir: Comunes, al igual que con los alimentos

Eliminación de residuos: Disolver o suspender en H20

• DATOS DE RIESGOS DE INCENDIO Y EXPLOSIÓN

• Punto de inflamación: Ninguno

• Temperatura de autoignición: N/A

• Limites inflamables en aire: No inflamable

• Medios de extinción: Agua

• Procedimientos especiales para combatir incendios: Debe utilizarse ropa protectora y protección respiratoria para protegerse de los gases de NOx.

• Riesgos inusuales de incendio y explosión: No constituye riesgo de incendio

• REACTIVIDAD QUÍMICA

Estabilidad: Altamente estable

Condiciones que deben evitarse: Ninguna

Productos de descomposición peligrosos: Cuando se calienta hasta descomponerlo, emitirá gases de NOx.

• PROTECCIÓN Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALES

Protección respiratoria: No es necesaria

Ventilación: Común

Equipo protector: No es necesario

• PRECAUCIONES ESPECIALES

Manipulación y almacenamiento: No se requiere ninguna precaución especial

Lugar de trabajo: Equipo protector: No es necesario.

• ETIQUETADO Y ENVÍO

Nombre de envío adecuado: L-Triptófano

• OTROS REQUISITOS REGULATORIOS

Ninguno

1.2. Aplicaciones (2)

Este aminoácido se está empezando a utilizar para la reducción del dolor. Las variedades de dolor que pueden responder son ciertos dolores de cabeza, dental y el dolor asociado con el cáncer. La base orgánica para este efecto del triptófano sobre el dolor se establece en los núcleos del rafe. Los núcleos magno, pálido, oscuro, dorsal y tegmental son las principales estructuras serotoninérgicas del cerebro, por tanto, depende de la serotonina y de su precursor el triptófano para su funcionamiento óptimo.

Desde hace muchos años se descubrió que el tiempo para conciliar el sueño se puede reducir en forma importante administrando en forma oral el triptófano. La reducción en la latencia para dormir es un hecho importante a dosis de un gramo de triptófano.

La depresión es una enfermedad muy común en nuestros días. El triptófano es especialmente efectivo en la depresión agitada. Los antidepresivos tales como la imipramina y la nortriptilina trabajan al inhibir la recaptación de monoaminas. Es decir, prolonga la vida de la serotonina, la dopamina, etc. Aún pequeñas dosis de triptófano pueden a veces elevar en forma importante los niveles de triptófano en sangre.

También se ha relacionado los niveles de triptófano con el suicidio ya que varios estudios han demostrado niveles bajos de serotonina en el líquido cefalorraquídeo en los pacientes suicidas. Para el tratamiento de la manía, hay autores que consideran que el triptófano es tan efectivo como el litio y aún más efectivo que la clorpromazina.

El triptófano puede estimular la aldosterona, la renina y el cortisol. Los pacientes con uremia necesitan más triptófano por la baja absorción. Los pacientes urémicos y los hipertensos se pueden beneficiar de los complementos de triptófano.

La administración de triptófano se ha asociado con una reducción del apetito en los pacientes deprimidos. Los complementos de triptófano pueden inhibir la gluconeogénesis, elevar el azúcar sanguíneo, aumentar el aporte de glucosa al cerebro y disminuir el apetito. Por eso, puede ser útil como terapia adjunta de la hipoglucemia.

1.3. Obtención vía química (3)

El proceso químico por el cual se obtiene este aminoácido desde el punto de vista industrial resulta antieconómico, pues si bien se logra obtener el producto final, el coste de fabricación es muy elevado.

Se obtiene de la reacción de caseína y pancreatina, realizándose ésta en un medio alcalino, preferentemente con carbonato sódico, a 37°C, con una duración aproximada de 12 días, durante los cuales se agita la mezcla con alguna periocidad. Una vez finalizada esta reacción se enfría la masa en cámara fría y se filtra. El liquido obtenido se acidifica y se hace reaccionar con sulfato mercúrico obteniéndose un precipitado que contiene triptófano.

1.4. Obtención vía biotecnológica (4)(5)(6)(7)

La obtención del triptófano a nivel biotecnológico, se puede realizar de diversas formas y/o con la utilización de variados microorganismos tales como:

• La fermentación de un gen derivado de la bacteria Escherichia coli.

• Producción por la transformación de un microorganismo perteneciente al genero Corynebacterium o Brevibacterium

• Fermentación de variedades mutantes tales como: Corynebacterium glutamicum

1.5. Usos y consumos en Colombia

• Usado en dietas para bajar de peso (8)

• Como alimento esencial para animales monogástricos ya que es necesario para la síntesis y retención de proteína corporal y como precursor de algunos metabolitos. (9)

• Usado para algunos trastornos relacionados con la ansiedad y el ánimo. (depresión, manía, psicosis, deficiencia renal, trastornos hormonales)

1.6. Proveedores a nivel mundial (10)

• Distribuido por: Ajinomoto Heartland LLC

Eddyville, Iowa 52553

(773) 380-7000 Chicago

• América Alimentos, S.A. de C.V.

Prolongación la calma No 154Col.Agrícola

45236 Zapopan, Jal Mex:

Tel: (+33) 3612-2510 -Fax: (+33) 3684-6720

• Productos Químicos Gonmisol, S.A.

Camino de la Vereda No 47-49

08930 San Adrián del Besós, Barcelona España

Tel: (+3493) 313-6118 -Fax: (+3493) 314-7427

• C.I DISAN calle 12ª No 68c-25 Bogotá, Cundinamarca Colombia.

• INMOBAL -NUTRER Rivadavia 1369 Col.B.A 1033 Buenos aires, Argentina

• Galena Química e Farmaceutica Rua pedro Stancato No860 Col. Campo dos Amarais. 13082050 Campinas, Sao Paulo. Brasil

2. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO (11)

Este procedimiento se realiza para producir triptófano. Más concretamente, ésta invención se refiere a un procedimiento de producción continua de triptófano utilizando una fuente de enzima inmovilizada.

Convencionalmente, el triptófano se fabrica normalmente mediante una reacción enzimática que utiliza una enzima tal como triptófano sintasa y triptofanasa. Se está centrando el interés en estos procedimientos que utilizan una fuente de enzima inmovilizada, ya que la separación de triptófano de la fuente de enzima inmovilizada y su purificación es sencilla.

Se puede tratar de prolongar la duración de la actividad de la fuente de enzima inmovilizada de dos maneras, mejorando la propia fuente de enzima inmovilizada y/o eligiendo las condiciones de reacción mas adecuadas. Hoy día se esta estudiando la mejora de la fuente de enzima inmovilizada.

Además, incluso aunque se mejore la fuente de enzima inmovilizada se trata de mejorar la duración de la actividad dependiendo en gran medida de la elección adecuada de las condiciones de reacción, aspecto que consume mucho tiempo.

Hasta ahora, no se ha conseguido prolongar la vida de la enzima inmovilizada, por lo tanto, el objeto de la presente es proporcionar un procedimiento para producir triptófano a partir de L-serina e indol, caracterizado porque se prolonga la duración de la actividad de la fuente de enzima inmovilizada mediante la elección de las condiciones de reacción adecuadas y porque permite aumentar la concentración del L-triptófano producido.

Los autores han descubierto que si se aumenta el número de moles de la L-serina en la mezcla de reacción para que esté en exceso sobre el número total de moles de indol y L-triptófano, se puede prolongar la vida de la fuente de enzima inmovilizada y se puede aumentar la concentración del L-triptófano producido.

El procedimiento permite prolongar la duración de la fuente enzimática inmovilizada cualquiera que sea la cantidad de L-triptófano acumulado, de manera que se puede producir L-triptófano continuamente a partir de indol y L-serina durante mucho tiempo. Además, el L-triptófano que es producido se puede obtener a mayor concentración que en los procedimientos convencionales.

Aquí el termino “fuente de enzima inmovilizada" representa triptófano sintasa inmovilizada, triptofanasa o un microorganismo inmovilizado que produzca por lo menos una de estas enzimas. Entre los microorganismos productores de triptófano sintasa conocidos, se incluyen Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19), Escherichia coli MT -10242 (FERM BP-20) y Neurospora crassa (ATCC14692). Entre los microorganismos productores de triptofanasa, se incluyen Proteus vulgaris (IFO 3167),Escherichia coli (IAM 1268), Aerobacter aerogenes (IFO 12019) y Klebsiella pneumoniae (ATCC 8724).

La reacción se puede efectuar por repetición de procedimientos discontinuos o haciendo fluir continuamente la mezcla de reacción utilizando un tanque reactor, o haciendo fluir continuamente la mezcla de reacción en un reactor de lecho fijo o de lecho fluidizado. También se puede utilizar una combinación de estos tipos de reactores.

2.1. Preparación de la materia prima

• Preparación de la fuente de enzima inmovilizada

Una bacteria productora de triptófano sintasa, Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19) se inoculo en 100 ml de un medio de cultivo que tenía la composición indicada en la Tabla 1, contenido en un matraz de 500 ml, y el medio de cultivo resultante se incubo durante 24 horas. Se inocularon 200 ml del cultivo (2 matraces) en 15 litros de un medio de cultivo que tenía la composición indicada en la Tabla 2, contenido en un fermentador de jarra de 30 litros, y el medio de cultivo resultante se incubo a 35°C, pH 6,8 (ajustado con amoniaco acuoso al 28%) durante 30 horas.

Tabla 1.

Composición medio de cultivo	cantidad
Extracto de carne Ehrlich	10g
Polipeptonada	10g
NaCl	5g

Disuelto en 1 litro de agua destilada (pH 6,8)

Tabla 2.

Composición medio de cultivo	cantidad
Glucosa	10g
(NH4)2SO4	1,5 g
MgSO4.7H2O	1 g
Polipeptona	0.5g
Extracto de levadura	0.5g
L-triptófano	0.15g

Disuelto en 1 litro de agua destilada (pH 6,8)

• Función de los componente en los medios de cultivo (12)

• Extracto de carne: Fuente de vitaminas y otros factores de crecimiento

• Polipeptonada: Fuente de aminoácidos, N, S, y P

• NaCl: Fuente de Na+

• Glucosa: Fuente de Carbono y fuente de energía

• (NH4)2SO4: Fuente de nitrógeno

• MgSO4 7H2O : Fuente de S y Mg++

• Extracto de levadura: Fuente de vitaminas y otros factores de crecimiento

Una vez terminado el cultivo, el medio se centrifugo para obtener 600 g, base húmeda, de células bacterianas. Las células bacterianas se introdujeron en un contenedor que se cerro herméticamente y se guardo en una cámara refrigerante a 4°C. Estas células se utilizaron para preparar la fuente de enzima inmovilizada.

Una parte de las células bacterianas húmedas obtenidas anteriormente, y una parte de solución salina fisiológica se mezclaron con agitación. Por otro lado, se mezclaron con agitación 7,76 partes en peso de agua destilada y 0,24 partes en peso de alginato de sodio (NSPLL fabricado por Kibun Food ChemifaCo. Ltd.) y el pH de la mezcla se ajustó a 8,5 con hidróxido de sodio.

Se mezclaron 2 partes de la suspensión de las células y 8 partes de la solución de alginato de sodio con agitación y la mezcla resultante se recogió con una jeringa y se agrego gota a gota a una solución gelante desde la punta de la aguja que tenía un diámetro interno de 0,5 a 0,8 mm.

La solución gelante era una solución acuosa de cloruro de calcio dihidratado 0,5M, cuyo pH se ajustó a 8,5 con solución de hidróxido de potasio 6N, mantenida a 10°C, y se utilizaron 10 partes de la misma.

Las partículas que se formaban al gotear la mezcla en la solución gelante maduraban agitando la solución durante 1 hora aproximadamente, y así se obtenía la fuente de enzima inmovilizada.

2.2. Microorganismos empleados

Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19)

2.3. Etapa de producción, condiciones operacionales y recuperación del producto

Reacción de síntesis de L-triptófano

Se prepararon cuatro soluciones A, B, C y D, que tenían la misma composición, a demás de la concentración de L-serina, que se indica en la Tabla 3, y los pH se ajustaron a 8,5. En reactores de vidrio de 500 ml, provistos de agitador, se pusieron 100 ml de cada solución y 50 ml de las células bacterianas inmovilizadas descritas antes. Los reactores se pusieron en baños de agua caliente para mantener la temperatura de cada reactor a 35°C.

En cada reactor, se inició la entrada continua de la misma solución que se había puesto al principio en cada uno de ellos, manteniendo una velocidad de flujo de 50 ml, al tiempo que se saca continuamente la mezcla de reacción de cada reactor a la misma velocidad de flujo.

Se tomaron alícuotas de la mezcla de reacción de cada reactor al cabo de un tiempo predeterminado, y se determinaron las concentraciones de L-triptófano, indol residual y L-serina residual mediante cromatografía de líquidos de alta eficacia. Se calculo el rendimiento del L-triptofano recién producido en el reactor con respecto al indol suministrado y el tiempo que transcurre hasta que este rendimiento se reduce al 50%, es decir, el periodo de semiduración de la actividad enzimática, que se representa en la Tabla 3 como duración de la enzima.

Tabla 3.

Concentración de componente (g/l)	Solución
		A	B	C	D
Indol	2.0	2.0	2.0	2.0
L-Triptófano	10.0	10.0	10.0	10.0
Cloruro de calcio dihidratado	1.5	1.5	1.5	1.5
Fosfato de piridoxal	0.01	0.01	0.01	0.01
L-serina	6.94	8.33	13.9	27.8
Relación molar de L-serina a total de Indol y L-Triptófano	1.0	1.2	2.0	4.0
Duración (horas)	180.0	625.0	892.0	1974.0

El anterior procedimiento es fiel para los previos análisis de laboratorio, para obtener producción mas elevada procedemos de la siguiente manera:

Aquí, el método de preparación de la fuente de enzima inmovilizada, la cantidad de la mezcla en el reactor y la cantidad de enzima inmovilizada utilizada fueron iguales que en el modelo de laboratorio. Sin embargo, aquí, se utilizaron 4 reactores conectados en serie a través de tuberías de modo que a cada reactor llega la mezcla del reactor precedente.

El primer reactor se alimentaba con la mezcla de reacción de la composición indicada en la Tabla 4, a un ritmo de 48 ml/hora, y a los cuatro reactores se agregaba la solución de indol en metanol con una concentración de 62,5 g/l, gota a gota, a un ritmo de 2 ml/hora. Además, al tercer reactor se agregaba continuamente L-serina en polvo a razón de 0,655 g/hora para efectuar la reacción de síntesis de L-triptofano. Con fines comparativos, se repitió el mismo procedimiento con la única excepción de que no se agrego L-serina a al tercer reactor. En este caso, aunque la reacción en el tercer reactor transcurrió en las condiciones definidas en el laboratorio, la cantidad de L-serina en el cuarto reactor estaba por debajo del límite inferior definido en este trabajo.

Tabla 4.

L-serina	11.7 g/l
Fosfato de piridoxal	0.01 g/l
Cloruro de calcio dihidratado	1.5 g/l
pH	8.5

La duración de la enzima en cada reactor se muestra en la Tabla 5 en ésta, también se indica la relación molar de L-serina a indol y la relación molar de L-serina a total de indol y L-triptofano en la entrada de cada reactor.

Si la reacción se efectúa utilizando el primer reactor solamente, incluso aunque haya L-serina en exceso, la cantidad de carga máxima de indol en la mezcla de reacción de alimentación es de 0,125 g/h, así que la producción máxima de L-triptofano en la mezcla de reacción es de 0,2179 g/h y su concentración es de 4,36 g/l. Estos resultados no son satisfactorios en un proceso industrial.

Como se muestra en este Ejemplo, si la reacción se efectúa continuamente en las condiciones definidas (es decir, se agrega L-serina adicional al tercer reactor), se puede prolongar mucho la vida de las células inmovilizadas. Por otra parte, si no se agrega la serina adicional al tercer reactor, la relación molar de L-serina a indol y L-triptofano está fuera del intervalo optimo de producción y no se puede prolongar satisfactoriamente la vida de las células inmovilizadas.

Este procedimiento se puede aplicar al procedimiento continuo industrial de producción de L-triptofano.

Se ha investigado a fondo y se ha descubierto sorprendentemente que, aunque el triptófano se descompone al calentarlo en acido acético, si el acido acético contiene agua, se mejora en gran medida la estabilidad del triptófano, estas investigaciones comprenden el paso de la recristalización del triptófano en acido acético con contenido de agua. (16)

La purificación del triptófano se puede realizar con una concentración alta, de manera que no son necesarias la condensación y la neutralización. Es decir, por este proceso se puede obtener triptófano con un alto grado de pureza de forma simple y económica con un alto rendimiento.

El triptófano sometido puede ser el triptófano bruto que se prepara por fermentación, reacción de encima o por síntesis química. El triptófano puede tener una configuración L o D o puede ser racémico. Se ha de tomar nota que si solo se somete un triptófano L y D al proceso, no se produce la racemizacion del triptófano.

Se recristaliza el triptófano bruto en acido acético que contiene agua. El contenido de agua en el acido acético puede ser del 1 - 95% en peso, de preferencia del 2 - 90% en peso, todavía de mayor preferencia del 10 - 80% en peso.

La cantidad del acido acético con agua, de preferencia, no ha de ser inferior a la parte equimolar del triptófano en términos de la cantidad de acido acético. Sin embargo, queremos señalar que si la cantidad del acido acético con agua es demasiada grande, el rendimiento puede quedar reducido. Así la cantidad del acido acético con agua, preferiblemente, ha de ser de 3 a 200 veces la del numero de moles del triptófano en términos del numero de moles del acido acético.

La temperatura aplicada en el paso de la recristalización puede ser cualquier temperatura mientras sea posible disolver el triptófano por completo en el acido acético con agua. Normalmente la temperatura preferida se mueve entre 40 y 115°C.

En caso necesario se puede añadir carbón activado o medios auxiliares al filtro de la solución calentada que contiene el triptófano disuelto, con el fin de adsorber las impurezas o para filtrar las substancias no solubles. El carbón activado solo se puede utilizar, en la purificación por recristalización. Como ejemplos preferidos de los medios auxiliares de filtración podemos nombrar el carbón activado, la diatomita, bentonita, alabastro acido y talco.

El paso de recristalización mismo se puede realizar de forma similar a los métodos convencionales, mediante el enfriamiento de la solución de triptófano en acido acético que contiene agua. Para obtener cristales de triptófano con efectividad, normalmente se enfría la solución de triptófano hasta 40 - 0°C, de preferencia 20 - 5°C.

Los cristales de triptófano obtenidos pueden recuperarse por filtración, lavarse con una solución acuosa de acido acético o agua fría y secarse de la forma convencional a presión atmosférica o reducida con el fin de obtener un triptófano altamente purificado. Queremos señalar que no es necesaria la neutralización con un álcali y que el acido acético puede recuperarse desde el filtrado por destilación o un método análogo.

Debido a la gran estabilidad del triptófano en el acido acético con contenido de agua, el triptófano no se descompone substancialmente de forma térmica durante el paso de recristalización.

Además, el triptófano tiene una gran solubilidad en el acido acético con contenido de agua.

3. DIGRAMA DEL PROCESO

4. MICROORGANISMO SELECCIONADO

Clasificación científica

Reino: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Gamma Proteobacteria Orden: Enterobacteriales Familia: Enterobacteriaceae Género: Escherichia Especie: E. coli

4.1. Clasificación

• PH : 4.3-9.5 (13)

• Temperatura de crecimiento (14)

Fig 1. Para E.coli, la tasa de crecimiento en función de la temperatura

• Requerimientos de oxígeno

Anaerobios facultativos. Crecen en ausencia y en presencia de oxígeno, pero crecen mejor con oxígeno. En ausencia, realizan la fermentación, y en presencia, la respiración aeróbia.

• Coloraciones especiales y pruebas bioquímicas (15)

Las pruebas bioquímicas no determinan cultivos mixtos son única y exclusivamente para microorganismos puros. Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. Nuestra bacteria pertenece al grupo en la tinción de Gram (-).

Prueba R - M (Rojo Metilo)

Es una determinación de pH de caldo de cultivo de glucosa, después de incubación por 2 a 4 días.

Se añade el indicador al cultivo incubado y se dice que la prueba es positiva cuando la acidez acumulada es suficiente para pasar el indicador al rojo, y negativo cuando el indicador permanece amarillo; un color rojo indica que el pH ha disminuido a 4,5 o menor.

Fundamentos de la producción de H2S:

La mayor parte de las proteínas tienen aminoácidos sulfurados. Algunos microorganismos tienen enzimas que desprenden el átomo de azufre de estos aminoácidos, el cual es luego reducido con hidrógeno (de los substratos), para formar ácido sulfhídrico, en este proceso los microorganismos cumplen con la actividad que puede catalogarse como fermentación proteica, que es la producción de ácido sulfhídrico.

E. Coli: no cambia color (-)

Hidrólisis del almidón:

Se inocularon las placa con Agar y almidón al microorganismo, estos fueron uno gram positivo y negativo.

El gram negativo Escherichia Coli y positivo el Bacillus Cereus, a ambos se le agregó una solución de lugor, estos se incubado a temperatura de 37 ºC,

La solución de Lugór se le agrega para observar la reacción de ambos microorganismos y la capacidad que estos microorganismos tienen para producir una enzima que hidrolice al almidón. La observación fue que el bacilo cereus fue resistente al colorante o sustancia y pudo hidrolizar al almidón formándose un halo transparente alrededor del almidón.

Mientras que el Escherichia Coli no reaccionó con la sustancia agregada (lugor) y por ser gram negativo, son susceptibles a este tipo de solución, por lo tanto no hidrolizó.

Hidrólisis de la Gelatina:

En este experimento se inocularon dos tupos de microorganismos. Escherichia Coli (gram -) y bacilo Cereus (gram +), después se colocaron a temperatura ambiente.

En los resultados a las 24 horas, el tubo que contenía la siembra de E. Coli no hidrolizó, el gel se mantuvo gelificado.

El que contenía la siembra de Bacilo cereus, si hidrolizó, dio positivo, la licuefacción se dio a perfección.

Producción de Hemolisinas:

Aquí se utilizó una placa de agar con sangre, allí se inoculo microorganismos.

Incubación por 24 horas

Los resultados obtenidos fueron que con Escherichia Coli no hubo presencia de hemolisina ni alfa ni beta, aquí el microorganismo no reaccionó y no produjo enzimas hemolisinas.

Hidrólisis de la Leche:

Después de inocular el microorganismo Escherichia Coli, lo incuban a 37 ºC, aquí se empleó una placa de agar con leche. Después de pasadas las 24 horas, se observó una transparencia alrededor del microorganismos o de la colonia que hidrolizan la caseína.

Una vez hidrolizada, la caseína se convierte en sus aminoácidos componentes, los cuales transmiten la luz en vez de reflejarla como la caseína coloidal, este último es caso del microorganismo negativo E. Coli que no hubo reacción de desclarificación con la proteína.

El cambio que se observó en la caja de agar leche es la clarificación del agua alrededor de las colonias que producen caseinosa.

La hidrólisis de la caseína no difiere de la de cualquier proteína típica, la molécula proteica se desarrolla en etapas produciendo una sucesión de moléculas de tamaño decreciente llamadas proteosas, peptonas, péptidos, hasta terminar en aminoácidos. libre, las cuales por su tamaño son ya cristaloides

Reacción de Nitratos:

En este tipo de análisis químicos, consta de 2 pruebas, donde la segunda dependía de la 1ª, es decir, si la 1ª prueba daba negativa no se realizaba el 2º, por no presencia de nitrito.

Escherichia Coli. Se dejó incubado a 37 ºC por 24 horas y después por una semana a temperatura ambiente.

En la 1er experiencia nos dio positivo de color rojo como respuesta, indicando que si hay nitrito en el medio en condiciones anaerobias, donde la molécula de nitrato desempeña la función del oxígeno como aceptar hidrógeno.

Este color se da solo en presencia de nitrito, ya que no reacciona con nitrato.

En la 2da experiencia se hizo igual que en la 1era experiencia, pero le agregamos amoniaco y reactivo de reessler, esta prueba nos dio positiva con un color amarillo pardo, este amoniaco es uno de los productos subsiguientes de la reducción del nitrito que alguno organismos producen después de prolongar la incubación.

La E-coli tiene relación directa con las sustancias y reactivos agregados a la mezcla o caldo nutritivo, reaccionan sin ningún problema a estas reacciones

Producción de H2S por los microorganismos

Aquí se inoculó escherichia coli en un tubo de ensayo con agar inclinado y la siembra se hizo con un aza tipo aguja.

Esta prueba en el tubo con E. Coli no cambio color, dio negativo, no reacciono con el azufre o no es capaz de producir ácido sulfhídrico en un medio de aminoácido que contenga azufre, y como el medio que se va a dar es con presencia de gas por el ácido sulfhídrico, el microorganismos no se desarrolla en medio de O2 en este caso.

Prueba de RM - VP

Se utiliza Escherichia coli, gram negativo, se le hizo la prueba de RM - VP.

RM:

aquí se emplearon dos tubos de ensayo al de RM se le agregaron 5 gotas de rojo metilo, la prueba dio positivo, se observó una coloración rojo, esto se debe a que el microorganismo E. Coli es un productor de ácido, y al agregarle este reactivo que no es mas que una determinación de pH de caldo de cultivo de glucosa, reacciona de manera positiva, ya que la acidez acumulada es suficiente para vivir el iniciador al rojo.

VP:

En este caso al tubo de ensayo con E. Coli se le agregó ð - naftol y KOH al 40 %, esta prueba dio negativo, la alta concentración del KOH (ácido potásico) neutraliza la acción del E.coli y no reacciona con el ð - naftol, ni con el caldo nutritivo.

Fermentación Bacteriana de Carbohidratos:

En este caso el término fermentación se refiere al término degradación anaeróbica de carbohidratos, ya que estos almacenan gran cantidad de energía, la capacidad de fermentar depende de las enzimas del microorganismos.

En este experimento observamos la fermentación de carbohidratos como: galactosa, en la cual se inoculó Escherichia Coli dando un resultado negativo en cuanto a presencia de gas y ácido, lo que nos indica que este microorganismos no posee las enzimas necesarias para fermentar este carbohidrato. La lactosa y xilosa, usada como otro carbohidrato, dio como resultado positivo en cuanto a fermentación, presencia de gas en el tubo y un cambio de pH (cambio de color), esto ocurrió en la mentosa y el manicol; esto no demuestra la capacidad del E. Coli para fermentar los carbohidratos. Esta capacidad de fermentar una sustancia dada es de gran utilidad para distinguir un microorganismo de otro.

Prueba: “Ureasa”

Principio:

La urea (H2N - CO - NH2) se escinde en 2NH3 + CO2

Método:

Medio con un 2% de urea y rojo fenol como indicador. La liberación de amonio eleva el pH, intenso color rojo rosado.

Utilización más frecuente:

Distinguir Klebsiella (+) de Escherichia (-) Distinguir Proteus (+) de Providencia (-)

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Disponible en www.lysine.com. Visitada el 3 de Diciembre de 2007.

Revista Medicina Universidad de la Salle. Bogotá, No. 9, mayo 2005, p. 83 - 87

Patente de invención 255952. Procedimiento de fabricación de L-triptofano. Laboratorios Hubber S.L

Patente de invención 2269788. Procedimiento para la producción de L-aminoácidos utilizando Escherichia: Livshits, Vitaliy Arkadyevich; Vitushkina Maria, Gusyatiner Mikhail Markovich. 01.04.2007

Patente de invención 52176/72. Procedimiento para la preparación de L-triptofano por fermentación: Kyowa Hakko Kogio Co, LTD. 16.11.1972

Patente de invención ES 2089846. Microorganismos para la producción de triptofano y procedimiento para su producción. Vich Gunter; Leinfelder Walfred Backman Keith. 01.10.1996

Patente de invención 25398. Procedimiento para la producción de triptofano. Kyowa Hakko Kogio Co LTD. 17.02.1983

Disponible en http://www.pegateya.com/club/index.php?Itemid=2&id=63&option=com_content&task=view. Visitada el 3 de diciembre de 2007

Disponible en http://www.etsia.upm.es/fedna/capitulos/00CAP2.pdf.Visitada el 3 de diciembre de 2007

Disponible en http://www.quiminet.com.mx/pr8/Triptofano+en+Pasta.htm. Visitada el de 3 de diciembre de 2007

Patente de invención ES 2010914. Procedimiento para la producción de L-triptofano. Ogawa, Shinji, Iguchi, Sella, Morita Satoshi, Kuwamoto Hideharu. 01.12.1989

Disponible en www.dict.uh.cu/Revistas/Bio2000/B00142k.doc. Visitada el 7 de diciembre de 2007.

Disponible en www.monografias.com/trabajos15/desarr-bacteriano/desarr- bacteriano.shtml - 39k -visitada el 5 de diciembre de 2007.

Disponible en http://www.danival.org/600%20microbio/8400extremofilos/extrem_200_temp1.html. Visitada el 5 de diciembre de 2007.

Disponible en http://www.monografias.com/trabajos15/microorganismos/microorganismos.shtml. Visitada el 8 de diciembre de 2007.

Patente de invención Es 2047765. Proceso para la purificación de triptofano. Kono Yoshitsugu; Itoh Hiroyuki; Taneda Ryoichi, Watanabe, Tsugio, 01.03.1994