Terapia génica en piel.

La piel es uno de los tejidos accesibles para la manipulación génica, en la cual se pueden introducir genes que produzcan proteínas terapéuticas de forma regulada.

La piel consta de dos tejidos: La epidermis y la dermis. La primera es la principal barrera de protección contra las agresiones del medio ambiente, por lo que su diferenciación celular es compleja y las células se organizan formando diferentes estratos. Cada una de ellas sufre un proceso de diferenciación y migra a la superficie hasta morir. La dermis, es más inerte y sus células se encuentran en una matriz formada por colágeno, a la que acceden capilares sanguíneos y terminaciones nerviosas. Finalmente, la piel contiene estructuras anexas, como los folículos pilosos que envuelven al pelo maduro. Es imprescindible que la piel se regenere rápidamente, si no es necesario recurrir a transplantes de piel.

En 1975, Howard Green y James Rehinwald cultivaron in vitro

queratinocitos, que se resistían a ser mantenidas en estas condiciones debido a su tendencia natural a diferenciarse y morir en cultivo. El hallazgo de la dispasa, capaz de desprender los queratinocitos adheridos entre sí en forma de una lámina continua de la superficie plástica de cultivo. Ahora las láminas podían ser transplantadas.

En 1980, Nicholas O´Connor y John Mulliken realizaron el primer el primer transplante de queratinocitos cultivados a un paciente con quemaduras.

En 1987, otra vez Green y sus colaboradores, trabajando con R. Mulligan del MIT, quien poseía experiencia en el desarrollo de vectores retro virales, uno de los agentes más usados para introducir genes terapéuticos en células, fueron capaces de generar queratinocitos que producían la hormona del crecimiento.

Pero en la práctica, el resultado fue frustrante. No obstante, este experimento demostró que las células epidérmicas eran capaces de llevar a cabo funciones de secreción. Ahora la meta era introducir eficazmente información genética en los queratinocitos y conseguir que se exprese de manera permanente. El problema radica en identificar las células madre. Además, han aparecido datos que indican que sólo entre el 1 % y el 10 % de los queratinocitos proliferarán y formarán colonias, y éstas ni siquiera son homogéneas.

Es posible aislar subtipos clonales, como por ejemplo, los holoclones, clones con un alto potencial de crecimiento, formados a partir de células madres epidérmicas. Otro subtipo clonal son las células transitorias, que provienen de holoclones. Son una población celular cuya misión es dividirse un cierto número de veces para finalmente desaparecer. Son incapaces de mantenerse por tiempo indefinido en un transplante.

Otros factores que condicionan la eficacia y duración de la terapia son la naturaleza del vector portador del gen terapéutico y las secuencias de DNA reguladoras de la "expresión" de dicho gen. Existen discrepancias entre los investigadores en este campo. Hay quienes atribuyen el problema a la in activación de las secuencias reguladores de la expresión del gen terapéutico en el organismo huésped, de forma que, aunque el gen persiste en el tejido transplantado, no es activo y la proteína deja de sintetizarse. Otros sostienen que el problema ese encuentra en los vectores retro virales, ineficientes a la hora de introducirse de células madre, y transducen fundamentalmente células amplificadoras transitorias, las cuales se pierden de la piel al diferenciarse terminalmente y descamar.

Posiblemente, ambas causas sumadas a una cierta ineficacia en las técnicas de cultivo de los queratinocitos y del transplante de éstos al animal huésped, contribuyan en cierta medida a la disminución gradual

de las proteínas codificadas por los genes terapéuticos transferidos. Con esto en mente, actualmente, se trabaja intentando diseñar nuevos vectores de transferencia de genes así como mejorando las condiciones para hacer diana en un alto porcentaje de células madre.

Ejemplos de potenciales aplicaciones de terapia génica a través de

queratinocitos epidérmicos son: Enfermedades hereditarias de la piel, úlceras crónicas, heridas extensas, enanismo, hemofilia, enfermedades víricas o enfermedades metabólicas. En próximos años , la piel será uno de los primeros y sistemas para corregir enfermedades mediante terapia génica.

Virus manipulados para transferir genes:

El primer ensayo clínico de terapia génica tuvo lugar en 1990, y ocho años después, 3000 pacientes han llevado en su organismo células genéticamente modificadas. Se han podido tratar una gran variedad de patologías, además, sin riesgos, pero todavía no hay ninguna prueba tangible de que la terapia génica haya conseguido tratar una enfermedad humana.

¿Cuáles son las razones?

La terapia génica abre nuevas perspectivas al tratamiento de enfermedades, pero uno de sus mayores problemas es la transferencia de genes a células. Los virus constituyen hoy el origen de los vectores de transferencia, pero están lejos de ser los instrumentos ideales porque su empleo plantea innumerables problemas, como por ejemplo, que han de ser sistemas seguros, eficaces, capaces de funcionar en células que no se dividan y garantizar la estabilidad de la expresión del gen. Además, su producción ha de ser fiable y rentable.

En efecto, el cuerpo humano ha aprendido a protegerse de la introducción de DNA extraño en su genoma, y sólo los virus han conseguido superar estas barreras.

De ahí la idea de los investigadores, de crear células de encapsidación que se reúnen para formar partículas víricas vacías. Los retro virus fueron los primeros virus empleados como vectores de transferencia. Presentan la enorme ventaja de poder integrar su material genético de manera permanente en el genoma de las células que infectan. Son los más empleados. Estos virus modificados presentan unos riesgos limitados.

El proceso se basa en tomar del paciente las células objetivo, cultivarlas y modificarlas genéticamente con el vector retro vírico antes de readministrarlas. la penetración en células se efectúa por reconocimiento entre una proteína presente en la envoltura vírica y un receptor celular.

En el citoplasma de la célula, el material genético vírico ha de penetrar hasta el núcleo de las células para integrarse en el cromosoma celular, lo cual, es posible sólo en el momento de la mitosis. Hoy, los vectores retro víricos sólo pueden ser utilizados por células que, por una parte, expresen a niveles altos el receptor MLV, y por otra, se dividan activamente durante la exposición del virus. Cuando el vector se administra por vía sanguínea, existe la posibilidad que durante su recorrido infecte las células que encuentra en su recorrido.

Este problema se ve acentuado por el hecho de que estos vectores no pueden producirse en concentraciones elevadas.

Una de las estrategias utilizadas ante este problema consiste en reemplazar la parte del virus responsable de la unión con el receptor. Se han conseguido de este modo una serie de receptores-objetivo. Pero en la práctica ha sido imposible ya que la adición del ligante o del anticuerpo hace imposible la fusión de las membranas.

Otra posibilidad consiste en insertar en la proteína de la envoltura vírica un ligante capaz de reconocer un compuesto de la matriz extra celular que envuelve la célula-objetivo.

Esta técnica, llamada "de anclaje", permite una unión natural. En este método pueden utilizarse dos proteínas: el colágeno y la fibronectina.

Otro obstáculo es la incapacidad de los retro virus MLV para transducir células que no se dividen. La solución se encuentra en los lentivirus (como el VIH), capaces de infectar células que no se dividen, sin embargo, es peligroso manipular este tipo de virus porque son siempre susceptibles de producir un virus patógeno.

Las investigaciones actuales se orientan hacia el empleo de sistemas híbridos que combinan una parte del genoma de VIH en un vector retro vírico, con una proteína de envoltura no VIH. Pero aunque es muy prometedor, todo está por hacer.

Admitamos que se ha resuelto el problema de la eficacia de la transferencia. Lo siguiente consiste en obtener una expresión a largo plazo. Cuando no son las propias células las que reconocen las secuencias reguladoras como extrañas y las inactivadas, es el sistema

inmunitario el que destruye la célula infectada. Todavía no se ha conseguido la expresión estable a largo plazo. Una vez vencido este obstáculo, habrá que obtener una expresión regulable del gen.

La insulina, por ejemplo, responde a señales fisiológicas. Por lo tanto, la idea es recurrir a secuencias que respondan a señales fisiológicas del cuerpo o a sustancias capaces de controlar el nivel de actividad del gen. Finalmente, la producción industrial de los vectores

ha de rentabilizarse y ofrecer todas las garantías.

El principal problema de los vectores retro víricos es que pueden reconstruirse por recombinación y formar otros retro virus con una recuperada capacidad de replicación (RCR).

Otras secuencias víricas pueden incorporarse a los RCR para producir un virus potencialmente patógeno. La otra dificultad deriva de la capacidad de un vector para integrarse en un gen supresor de tumor e inactivarlo. Sin embargo, la fabricación y los tests siguen siendo caros y complejos, y lo que se consigue producir son vectores inofensivos que reducen la eficacia de la transferencia del gen.

Para producir partículas víricas que no sean reconocidas y eliminadas, hay que utilizar células murinas modificadas o cepas de encapsidación no murinas. Esta solución plantea de nuevo el problema de la aparición de un RCR potencialmente patógeno por recombinación

entre el vector y los retro virus. A este respecto, la utilización de células humanas como células de encapsidación presenta menos riesgos. Los adenovirus, por ejemplo, permiten transferir secuencias muy amplias de DNA, y son capaces de infectar muchos tipos celulares diferentes y con una gran eficacia pueden infectar células que no se dividen y ser producidos en altas concentraciones. Pero también tienen deficiencias, como por ejemplo que los vectores de primera generación provocan fuertes reacciones inflamatorias e inmunitarias.

Obtener más y más genes víricos no siempre es una ventaja. Ciertas secuencias protegen de la vigilancia del sistema inmunitario a las células que expresan el vector.

Hay que contemplar soluciones intermedias, una de las cuales consiste en administrar al paciente tratamientos inmunodepresores que hagan posible la inyección repetida del vector. Otro virus de DNA empleado en ensayos clínicos es el AAV, un virus no patógeno muy corriente en el hombre, que ha de ser ayudado por un adenovirus o un virus del herpes. Es el único virus conocido en mamíferos que se integra específicamente en una región concreta del genoma de la célula.

Desafortunadamente, los vectores AAV transformados en vectores de transferencia parecen perder esta propiedad, pero son capaces de transducir eficazmente células. Punto fuerte de estos virus: su capacidad para infectar células que no se dividen. Pero también esta propiedad del virus original desaparece cuando es modificado. Por tanto, las ventajas de estos vectores no son explotables en clínica, pero siguen siendo unos candidatos prometedores. El virus Herpes simplex (HSV), puede transducir células del sistema nervioso, y se estudia sistemas híbridos en los que se utiliza un vector adenovírico para transportar un vector de tipo retro virus a una célula normalmente inaccesible a la transducción retro vírica.

Lo cierto es que, por el momento, no se disponen todavía de vectores derivados de virus con DNA seguros y que permitan la integración del gen-medicamento en el genoma de células humanas que no se dividen.

French Anderson, pionero en la terapia génica propuso tratar dos enfermedades genéticas graves: la alfa-talasemia, enfermedad fatal de la sangre, debida a un efecto del gen de la hemoglobina, y una deficiencia inmunitaria grave (SCID), resultado de la carencia de un gen esencial, el de un enzima llamada adenosina desaminasa. En cuanto al estudio, su autor propuso ensayar el método en fetos portadores de estas anomalías genéticas, cuyas madres hayan decidido abortar. Sólo después de la interrupción del embarazo, podrán los investigadores verificar la eficacia del tratamiento. Todavía se necesitarán de dos a tres años de trabajo en vectores y de ensayos para que estos proyectos sean técnicamente aceptables. Además, esta nueva terapia plantea un problema ético de difícil solución.

¿Transgénesis sin ayuda de los virus?

Hoy en día, más que desarrollar nuevos vectores, lo que se intenta es modificar del modo más sencillo posible los transportadores comerciales; las partículas que encierran el DNA han de asociarse a las células-objetivo, penetrar en su citoplasma y, finalmente, entregar su contenido en el núcleo celular.

El DNA es una molécula cargada negativamente. Los virus compactan fuertemente el DNA gracias a proteínas ricas en aminoácidos cargados positivamente: los histones. Esto hace que la mayor parte de los vectores de síntesis sean lípidos, péptidos o polímeros cargados positivamente, llamados catiónicos. Este exceso de cargas positivas permite a los transportadores interaccionar, mediante enlaces electrostáticos, con las cargas negativas que presenta la membrana celular.

La mayor parte de los equipos mezclan vector y ácido nucleico, formando un complejo que contiene, en general, varias moléculas de DNA. Únicamente una condensación controlada del DNA permitiría la formación de partículas que encerraran una sola molécula de DNA, lo

que facilitaría considerablemente su paso a los compartimentos vasculares, así como la penetración en las células y su núcleo.

¿Cómo lograr que los complejos transfectantes entren en las células? Ciertos virus interaccionan electroestática mente con la membrana de las células, lo que les permite la entrada.

In vitro, la etapa de penetración en la célula no plantea problemas, sin embrago, in vivo, su eficacia cae considerablemente. Así, después de una inyección por vía intravenosa, se constata que la transferencia de genes tiene lugar principalmente hacia las células del pulmón y del hígado. Por tanto, no pueden abandonar eficazmente el sistema vascular, y penetran en las primeras células que encuentran.

Para conducir el DNA hacia objetivos específicos se pueden transplantar al transportador de los ligantes, unas moléculas que serán reconocidas por los receptores presentes en el tipo celular elegido, (azúcares, pépticos, hormonas, etc.). Por ejemplo, proteínas azucaradas permiten la entrada dirigida hacia las células del hígado. Las células absorben el DNA por endocitosis, y es vertido a los lisosomas. Como estos últimos contienen enzimas que degradan el contenido, a los vectores sintéticos se les asocia unas moléculas, las fusiógenas, que les permiten evadirse. Los otros tipos de vectores se asocian a péptidos

fusiógenos. Éstos sólo actúan después de la entrada de la sustancia al citoplasma, cuando el medio se acidifica. También pueden utilizarse adenovirus para este fin, pero el complejo ya no sería del todo sintético.

Una vez en el citoplasma, todavía es necesario que el dna llegue al núcleo de la célula. Introduciéndolo en células en crecimiento, el DNA penetra en el núcleo durante la división celular, cuando se disloca la envoltura nuclear. En las células en reposo las moléculas

de menos de 9 NM entran por los poros de la membrana nuclear por transporte activo, para las demás, no hay un método eficaz por el momento.

Otro problema: si el vector ha de permanecer asociado al DNA hasta el interior del núcleo, hay que asegurarse de que su presencia no interfiera con la transcripción del gen introducido.

Para asegurar el mantenimiento del gen, se intenta introducirlo en el genoma, pero es difícil de conseguir al azar. Otra vía es que se replique con las divisiones celulares. Y una tercera posibilidad: introducir en la célula-objetivo minicromosomas artificiales que se repliquen de modo autónomo. Entonces, su expresión estaría controlada por la célula de forma natural. Ésta es una ventaja de los vectores sintéticos: casi no hay límite al tamaño del DNA transfectado.

Ante las dificultades de la técnica de transfección por vector sintético, se están desarrollando unos métodos alternativos que se agrupan bajo la denominación de técnicas físicas. Es el caso de la inyección del DNA sin vector. Esta técnica podría desembocar de manera imprevista en un nuevo modo de vacunación.

Hoy, el interés de los sistemas no víricos reside en la simplicidad de su preparación y su estabilidad y pureza. Con el tiempo, serán interesantes para la utilización local.