Tecnicas de Estudio de las Celulas.

Cuando hablamos de técnicas de estudio de las células estamos hablando de la citología y la forma en que estudiamos esto.

Dentro de estas técnicas existen 3 que son las más importantes y que tienen mayor importancia en este estudio de las células, haciéndose indispensables para cualquier tipo de estudio hoy en día. Estas 3 técnicas de estudio son las siguientes:

1. Microscopia:

- Microscopia óptica.

- Microscopia electrónica.

2. Fraccionamiento Celular o División Celular.

3. Citoquímica.

Microscopia:

Consiste en el uso básicamente de microscopios, estos son de 2 tipos, los ópticos (microscopia óptica) y los electrónicos (microscopia electrónica). La microscopia como tal consiste en el aumento del objeto a observar, dado que el ojo humano tiene un poder de resolución de 0,1 mm (100 m), y las células tienen tamaños inferiores.

Definiciones de conceptos y características de sus formas de uso:

Microscopio:

Un microscopio es cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos, estos son usados para cualquier tipo de cosas que deseemos ver mas detalladamente, que nuestros ojos no sean capaz de observar con detencion o que simplemente no podamos ver. Existen 2 tipos de microscopios condiferentes funciones, ademas de tener diferente formas de empleo:

1. Microscopio Optico (microscopia optica):

Este es el microscopio mas usado, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.

El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto que es examinado. Las lentes de los microscopios están puestas de forma que el objeto que se desee examinar se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes.

El equipamiento adicional de un microscopio optico consta de un armazón con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra.

Los especímenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través de la muestra.

La fotomicrografía, que consiste en fotografiar objetos a través de un microscopio, utiliza una cámara montada por encima del ocular del microscopio. La cámara suele carecer de objetivo, ya que el microscopio actúa como tal.

Petrografía de una roca

La luz polarizada permite analizar esta muestra de roca lunar recogida por la misión Apolo 11. Los diferentes colores representan diferentes composiciones minerales.

Los microscopios que se utilizan en entornos científicos cuentan con varias mejoras que permiten un estudio integral del espécimen. Dado que la imagen de la muestra está ampliada muchas veces e invertida, es difícil moverla de forma manual. Por ello los soportes de los microscopios científicos de alta potencia están montados en una plataforma que puede moverse con tornillos micrométricos. Algunos microscopios cuentan con soportes giratorios. Todos los microscopios de investigación cuentan con tres o más objetivos montados en un cabezal móvil que permite variar la potencia de aumento.

Microscopios ópticos especiales:

Hay diversos microscopios ópticos para funciones especiales. Uno de ellos es el microscopio estereoscópico, que no es sino un par de microscopios de baja potencia colocados de forma que convergen en el espécimen. Estos instrumentos producen una imagen tridimensional.

- El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda más cortas de la luz ultravioleta. Además, dado que la radiación ultravioleta es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia en fotografía o con un escáner electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigación científica.

- El microscopio petrográfico se utiliza para identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales de las rocas ígneas y las rocas metamórficas. Cuenta con un prisma de Nicol u otro tipo de dispositivo para polarizar la luz que pasa a través del espécimen examinado. Otro prisma Nicol o analizador determina la polarización de la luz que ha pasado a través del espécimen. El microscopio tiene un soporte giratorio que indica el cambio de polarización acusado por el espécimen.

- El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.

- El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.

- Entre los microscopios avanzados se encuentran el microscopio de campo cercano, con el que pueden verse detalles algo menores a la longitud de onda de la luz. Se hace pasar un haz de luz a través de un orificio diminuto y se proyecta a través del espécimen a una distancia equivalente a la mitad del diámetro del orificio, formando una imagen completa.

2. Microscopio electrónico (microscopia electrónica):

La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 ángstroms (1 ángstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5 ángstroms.

Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos. Disponen de un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. Se utilizan lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones. El sistema de vacío es una parte relevante del microscopio electrónico. Los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. Por último, todos los microscopios electrónicos cuentan con un sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones.

Tipos de Microscopios Electronicos:

Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos:

- El microscopio electrónico de transmisión (TEM): Dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.

- El microscopio electrónico de barrido (SEM): Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o más. Este tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.

Microscopio electrónico de barrido.

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El microscopio electrónico de barrido está situado a la izquierda del operador, y las imágenes computerizadas de la muestra se ven en la pantalla de la derecha. Aunque un microscopio electrónico de transmisión puede resolver objetos más pequeños que uno de barrido, este último genera imágenes más útiles para conocer la estructura tridimensional de objetos minúsculos.

- Microscopio electrónico de barrido y transmisión (STEM): Combina los elementos de un SEM y un TEM, y puede mostrar los átomos individuales de un objeto. El microanalizador de sonda de electrones, un microscopio electrónico que cuenta con un analizador de espectro de rayos X, puede analizar los rayos X de alta energía que produce el objeto al ser bombardeado con electrones. Dado que la identidad de los diferentes átomos y moléculas de un material se puede conocer utilizando sus emisiones de rayos X, los analizadores de sonda de electrones no sólo proporcionan una imagen ampliada de la muestra, como hace un microscopio electrónico, sino que suministra también información sobre la composición química del material.

Fraccionamiento Celular:

Consiste en la rotura de las células mediante un proceso osmótico, ultrasonidos, lisis enzimática ó de manera mecánica, y posteriormente una centrifugación que concentrará en diversas fases a los distintos orgánulos según su tamaño, con lo que se obtendrán separadamente, permitiendo más fácilmente su estudio. Tambien se le denmina a esto DIVICION CELULAR.

La división Celular:

La división celular es el proceso por el cual el material celular se divide entre dos nuevas células hijas. En los organismos unicelulares esto aumenta el número de individuos de la población. En las plantas y organismos multicelulares es el procedimiento en virtud del cual crece el organismo, partiendo de una sola célula, y también son reemplazados y reparados los tejidos estropeados.

Las células en división pasan a través de una secuencia regular de crecimiento y división, conocida como ciclo celular. El ciclo consiste en una fase G1, durante la cual las moléculas y estructuras citoplasmáticas aumentan; una fase S durante la cual los cromosomas se duplican; una fase G2, durante la cual comienza la condensación de los cromosomas y el ensamblaje de las estructuras especiales requeridas para la mitosis y la citocinesis; la mitosis, durante la cual los cromosomas duplicados son distribuidos entre dos núcleos hijos; y la citocinesis, durante la cual el citoplasma se divide, separando a la célula materna en dos células hijas. Las tres primeras fases del ciclo celular se conocen, colectivamente como interfase. La regulación del ciclo celular ocurre tardíamente en la fase G1, y puede implicar la interacción de diversos factores.

Las fases de la mitosis son convencionalmente cuatro: Profase, metafase, anafase y telofase. De ellas la profase es la más larga. Si una división mitótica ocurre en diez minutos, por lo menos 6 minutos se tarda la célula en Profase. En la Profase los centríolos se separan. Entre los pares de centríolos, formándose a medida que estos se separan, están los microtúbulos que se transforman en las fibras polares del huso. Para el final de la Profase los cromosomas están completamente condensados y no están separados del citoplasma.

Durante la metafase temprana, los pares de cromátidas se mueven dentro del huso, aparentemente conducidos por las fibras del huso, como si fueran atraídos por un polo y luego por el otro. Finalmente los pares de cromátidas se disponen en el plano medial de la célula. Esto señala el final de la metafase.

Al comienzo de la anafase, la etapa más rápida de la mitosis, los centrómeros se separan simultáneamente en todos los pares de cromátidas. Luego se separan las cromátidas de cada par y cada cromátida se transforma en un cromosoma separado, siendo ambas cromátidas atraídas, aparentemente hacia polos opuestos por las fibras del cinetocoro.

Al iniciarse la telofase, los cromosomas alcanzan los polos opuestos y el huso comienza a dispersarse. Luego se forman sendas envolturas nucleares que se vuelven a formar alrededor de los dos conjuntos de cromosomas, que una vez más se vuelven difusos. En cada núcleo reaparecen los nucleólos.

Citoquímica:

Mediante las reacciones coloreadas, las enzimáticas ó de inmunofluorescencia se averigua la composición bioquímica de las estructuras celulares, su localización y su funcionamiento.

Las Reacciones Enzimáticas:

- son específicas y controladas

- dependen de factores como: temperatura, pH y la presencia de sales

- son difíciles de ver a simple vista

Inminofluorescencia:

La inmunofluorescencia es una técnica de laboratorio y su exactitud puede variar dependiendo del anticuerpo específico que se está investigando y del laboratorio que la esté aplicando. Se corta una porción congelada del hígado de un ratón (u otras substancias) y se coloca en una laminilla portaobjeto de un microscopio, luego una pequeña cantidad de suero sanguíneo de la persona (parte líquida de la sangre que contiene los anticuerpos) se coloca sobre la sustancia y se lava. Un medio de contraste (fluoresceína) que se ha enlazado químicamente a los anticuerpos anti-humanos del conejo se aplica y se lava. Finalmente el anticuerpo del conejo enlazado a la fluoresceína y algunos anticuerpos humanos se enlazan, permitiendo que los grupos de medios de contraste sean visibles bajo el microscopio (prueba positiva).

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