VI. TÉCNICA INMUNOHISTOQUIMICA

Conjunto de técnicas que hacen uso de anticuerpos. Los anticuerpos están formados por dos cadenas pesadas y dos ligeras, que se agrupan en una molécula en forma de Y, con dos sitios de unión para antígeno

Existen varios tipos de anticuerpos, de los cuales los IgG son los más abundantes en suero y los que más utilidad tienen en técnicas de laboratorio.

Antígeno es la molécula a la cual se une el anticuerpo. Son de muy distinta naturaleza. Fundamentalmente los Ac reconocen proteínas, pero también se sintetizan Ac contra carbohidratos, lípidos, ac. nucleicos, compuestos orgánicos sintéticos, etc.  La región de la molécula a la cual se une el anticuerpo se denomina epítopo.  Los epítopos pueden estar formados por regiones contiguas o no en la secuencia de aminoácidos de una proteína.

La unión antígeno-anticuerpo es una unión reversible y de alta afinidad. La producción de anticuerpos consiste básicamente en:

b) Inyección de este a un animal y

c) Obtención del suero del suero del animal.

Preparación del antígeno: los antígenos deben tener un tamaño mínimo (3000-5000 dalton), aunque moléculas más pequeñas (haptenos) pueden acoplarse a otras mayores (carriers).

Las proteínas han de purificarse antes de inyectarse al animal.    Se pueden preparar anticuerpos contra péptidos sintéticos, usándolos como haptenos.

Es muy común preparar los antígenos mediante el uso de vectores de sobrexpresión en E. coli. Ello permite además la inclusión de “sequence tags” (marcas de secuencia) que facilitan la purificación.

PASOS PARA UN ENSAYO DE INMUNOHISTOQUIMICA:

INYECCIÓN AL ANIMAL :

Elección del animal : conejos (policlonales), ratones o ratas (monoclonales), hamsters (antígeno limitante), gallinas (antígenos muy conservados), etc.

El antígeno se inyecta normalmente mezclado con adyuvante, el cual:

- Protege el antígeno de ser catabolizado rápidamente

- Produce una estimulación de la respuesta inmunitaria inespecíficamente.

Se administran varias inyecciones al animal, separadas por varias semanas. General- se ponen 3 inyecciones xa q la cantidad de Ac fabricada contra nuestra enz sea mayor. Una inyección cada 4 semanas. La memoria inmunológica hace q en la 2º inyección se fabriquen más Ac, así sucesiva- hasta un pto en el q desciende, a la 10º semana se desangra el conejo.

OBTENCIÓN DEL SUERO:

En el suero hay muchos tipos de proteínas además de los anticuerpos. El suero contiene multitud de anticuerpos diferentes contra diferentes moléculas, incluso en animales superinmunizados contra un antígeno, los anticuerpos circulantes contra ese antígeno no superan la décima parte del total.

Los anticuerpos contra nuestro antígeno presentes en el suero no son de un sólo tipo: hay multitud de ellos, que reconocen diferentes partes del antígeno (anticuerpos policlonales).

Proceso de obtención del suero:

Se desangra el animal y se separa el suero de las células sanguíneas, la sangre se coagula en 12 h, se centrífuga y separamos, nos quedamos con el plasma q tieneAc y otras prot. General- no molestan los demás Ac y xa identificar una prot se usa el suero. Tb se pueden separar los anticuerpos del resto de los componentes del suero (cromatografía de afinidad usando proteína-A). Separo los Ac de las proteínas por precipitación diferencial con sulfato amonico 40-60%, Ac precipitan. Se pueden purificar los anticuerpos dirigidos contra nuestro antígeno x cromatografía de inmunoafinidad,(Sepha y prot A). Pasamos x la columna algo q separe la prot A del Ac, tampones de ph extremos ác, se recoge en un tampón neutro muy [] xa neutralizar, tris ph7-8

Para obtener Ac monoclonales tenemos q inyectar el Ag a un ratón (general-), varias inyecciones, le extraemos el bazo y extraemos cel plasmática (linfocito B) y las unimos a cel mieloma (un tipo de linfocito B canceroso) .Selección de clones productores de Ac, nos quedamos con los q los produzcan en abundancia y de alta afinidad. Gran ventaja no hay reac cruzadas, se puede mantener indefinida- el cultivo.

La cromatrografia de inmunoafinidad colocamos el Shepadex y nuestra proteína y así obtenemos Ac monoclonales.

MARCAJE DE ANTICUERPOS:

Los anticuerpos se pueden marcar para permitir su detección, lo cual implica la unión covalente al dominio Fc de moléculas o átomos fácilmente detectables, tales como:

-125I emisor γ se detecta con contador de centelleo o autoradiografia.

- Enzimas se le pegan enz completas a la región Fc: peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, -galactosidasa, etc.

Detección con:

* Sustratos que dan lugar a productos coloreados solubles, que se pueden medir en un espectrofotómetro.

*  Sustratos que dan lugar a productos coloreados insolubles, que forman un precipitado en el lugar en el que se encuentra el anticuerpo, útiles por ejemplo en inmunolocalización y western blots.

* Sustratos que producen luz (detectada con luminómetro o película fotográfica).

* Biotina, luego detectada con avidina/streptavidina (acopladas a algún otro tipo de marcador). La afinidad avidina/streptavidina-biotina es la más alta conocida la unión es en la práctica irreversible.

* Fluorocromos (por ejemplo Fluoresceína y Rhodamina). Detección con microscopio de fluorescencia o espectrofluorímetro.

INMUNOPRECIPITACIÓN:

Consiste en la separación de un antígeno de una mezcla compleja mediante precipitación con el anticuerpo (por ejemplo una proteína de un extracto celular).

   Pasos a seguir:

1.- Marcaje del antígeno mediante incubación en un medio que contenga precursores radiactivos del antígeno (OPCIONAL). Normalmente las proteína se marcan mediante incubación de las células con [35S]Metionina

2.- Homogeneizar: rotura de las células en un tampón apropiado, usando el método de homogenización adecuado en cada caso.

3.- Adición del anticuerpo al extracto e incubación para permitir la formación del complejo antígeno-anticuerpo, en suero policlonales se suelen formar redes, va en f (x) de la [] de ambos este balanceada

4.- Adición de proteína A (constituyente de la pared de S. Aureus, que tiene alta afinidad por las Fc de las IgG) unida a fase sólida (por ejemplo proteína A - Sephadex). Separación y lavado de ésta para eliminar el material no unido.

5.- El complejo antígeno-anticuerpo es normalmente analizado mediante electroforesis en SDS( banda superior Ag, inf Ac, si hay 3º sería q la prot tiene subunidades) seguida de autorradiografía. Pero también puede ser usado para estudios enzimáticos o de unión de ligandos, western- blots, inmunizar de nuevo un animal, etc.

El resultado de la inmunoprecipitación depende de :

Afinidad del anticuerpo. Para anticuerpos monoclonales se necesitan afinidades del orden de 108 M-1.

Abundancia relativa del antígeno: la inmunoprecipitación es más sencilla para proteínas abundantes, pero es posible para abundancias relativas de hasta 1/1.000.000. cuanto + abundante mejor.

Naturaleza del antígeno: Las proteínas insolubles (de membrana) y altamente polimerizadas (citoesqueleto) son difíciles de inmunoprecipitar.

Necesita anticuerpos de alta afinidad y especificidad, en orden de preferencia:

a) Mezcla de Ac monoclonales: el complejo se une sólo x un sitio ,x eso hay varios Ac monoclonales, así la prot se une al complejo por distintos epitopos

Ac

prot A

Sephadex

El ruido de fondo (precipitación de antígenos diferentes al que se uso para obtener el anticuerpo) es a menudo un problema, sobre todo en el caso de anticuerpos policlonales. Puede deberse a :

- Ag q reconoce a mi prot ta reconoce a otras, rezc cruzada

- Ag policlonales, mi preparación de Ac está contaminado con Ac q reconocen otras prot pero no la mía.

*Posibles soluciones ruido de fondo(2) :

1.- Usar la mínima cantidad de anticuerpo y no más. Más contaminación cuanto + bandas hay, son las más débiles y al ir diluyendo son las q desaparecen antes

2.- Aumentar la dureza de los lavados, lavar con tampón ph 9, de las interacciones Ag-Ac se rompen, las 1º son las del ruido de fondo.

* Eliminación de los anticuerpos que producen reacción cruzada:

3.- Incluyendo en la reacción de inmunoprecipitación un exceso de proteínas que compitan por estos anticuerpos, por ejemplo albúmina bovina (no marcada) para eliminar la interacciones inespecíficas o un extracto del mismo organismo obtenido en condicionase en las cuales no se expresa el antígeno de interés (por ejemplo a partir de un mutante que no expresa la proteína de interés). La [] de prot no marcadas pueden aparecer en bandas no marcadas muy débiles.

reac cruzada no se obs + bandas pq albumina no está marcada

4.- Eliminar del suero los anticuerpos que dan lugar a reacción cruzada mediante una inmunoprecipitación previa con albúmina (1º) o con un extracto que no contenga el antígeno de interés (2º).

5.- Ambas cosas a la vez: 1º inmunoprecipitación previa mutante y luego añadimos el estracto del mutante en exceso en la prot

*Eliminación del extracto de las proteína que dan lugar a ruido de fondo (2)

6.- Inmunoprecipitación previa usando suero preinmune (obtenido del mismo animal antes de la inmunización) o suero de una animal de la misma especie no inmunizado(1º dibujo).

7.-Eliminación de los anticuerpos que se unen a la fase sólida, mediante inmunoprecipitación (estrictamente no es una inmunoprecipitación, pq no hay Ac) previa sólo con fase sólida, sin anticuerpo (2º Ac). Las por del estracto con afinidad a la fase sólida o a la prot A precipitan 1º

Aplicaciones inmunoprecipitación:

Seguimiento de la evolución de la cantidad de antígeno: inducción, represión, cálculo de la vida media (cantidad de una prot pase a se la 1/2 ) imp saberlo pq ahí influye la regulación, vida media = estabilidad.

Autoradiogradia tras electroforesis Inhibidor de la sint de prot, no sirve xa medir la vida media

Cultivo de bac le añadimos Metionina marcada, cambio medio por el aas sin marcar en exceso

Autoradiografia se obs como se degrada la prot , intensidad de la banda con el tiempo

Estudio de modificaciones postraduccionales de proteínas (por ejemplo fosforilación)

Estudio de interacciones proteína-proteína (uniones) pueden confundirse con el ruido de fondo

-Al inmunoprecipitar la proteína A con anticuerpos anti-A, una proteína B que estuviese unida a ella también precipitaría, ej circulo cuadrado

-Necesidad de hacer controles para diferenciar de reacción cruzada:

Usar tanto anti-A como anti-B, tiene q dar =

Confirmar por otros métodos tales como cross-linking o 2-hybrid.

2- HYBRID: desarrollado en levaduras, factor transcripcional de levaduras q media la transcripción de un gen concreto. Cuando la levadura tiene la prot sin otra y hay actividad enz-> se detecta fácil si f(x) o no. AD BD se pueden dividir en 2, manipulando el gen de esta prot. A cada uno le une una prot de la cual quiero estudiar la interacción. Si tienen interacción las prot se unirá el complejo, habrá transcripción y act enz

CROSSLINKING: añadir un agente químico formaldehído, une covalentemente todo aquello q está cerca prot A y B en elect dan 2 bandas aunque interaccionan pq no estan unidas covalente-

Western blot (Inmunoblot)

Técnica muy poderosa que permite detectar la presencia, cantidad y calidad de un antígeno en una mezcla compleja, consiste en lo siguiente:

1.-   Rotura de las células o tejidos en un tampón apropiado, se pueden romper las células incluso en el tampón de muestra de la electroforesis en SDS (se produce la desnaturalización inmediata de las proteínas). Tb se puede hacer en conformación nativa. Tiene la ventaja de q no hay proteolísis pq se degrada todo incluso las proteasas.

2.-   Electroforesis (normalmente en SDS) del extracto obtenido.

3.-   Electrotransferencia de las proteínas a un soporte sólido (membranas de nitrocelulosa, PVDF o nylon) , lo hacemos aplicando corriente. 

4.- Si añado el Ac a la mem se pega a ella pq es a fin a la prot, por eso antes bloqueo los sitios de unión con una mezcla de proteínas, por ejemplo leche desnatada en polvo.

5.-   Incubación de la membrana con el anticuerpo dirigido contra el antígeno de interés (anticuerpo primario). La disolución tb contiene leche desnatad por si queda algún sitio libre.

6.-   Lavado del anticuerpo primario, disolución con un tampón, todo lo q no está unido a ella se va, incluido el Ac 1º no unido.

7.-   Incubación de la membrana con otro anticuerpo dirigido contra el anticuerpo primario, por ejemplo anti IgG de conejo obtenido en cabra, marcado con alguno de los marcadores ya vistos, por ejemplo fosfatasa alcalina (anticuerpo secundario).

8.-   Lavado del anticuerpo secundario.

9.-   Revelado del marcador. Incubamos con el sustrato de la enz, producto coloreado insoluble-> mancha color ene l sitio donde está la prot. Intensidad de color revela la cantidad. O q el producto de transf. de luz, se detecta sobre la mem un film transparente y una película fotográfica, una cámara de video detecta la luz permite establecer relaciones cuantitativas en f(x) de la intensidad.

Es necesario que el anticuerpo 1º reconozca la proteína desnaturalizada, lo cual es casi siempre cierto para los anticuerpos policlonales, pero no para los monoclonales.

Es común que aparezcan problemas de ruido de fondo, es decir aparecen bandas tras el revelado que no se corresponden con el antígeno y que se deben a reacción cruzada de los anticuerpos, especialmente si se trata de anticuerpos policlonales. Posibles soluciones :

- Aumentar el bloqueo de la membrana para eliminar el ruido de fondo inespecífico.

- Tratar el anticuerpo previamente a su uso con un extracto lo más parecido posible al que se cargó a la electroforesis pero en el que esté ausente la proteína de interés.

INMUNOENSAYO:

Se usan para detectar y cuantificar anticuerpos y antígenos. Todos requieren la unión del anticuerpo o del antígeno a una fase sólida, normalmente placas de microtitulación de PVC (polyvinylchloride) o membranas de nitrocelulosa.

Ejemplo de inmunoensayo en el que se detecta la cantidad de anticuerpo presente en una muestra.

ELISA y RIA: Se diferencian en el tipo de marcaje que se utiliza en el 1º el marcaje es con una enzima y en el 2º el marcaje es radiactivo.

ELISA: soporte sólido al que le unimos el Ag o Ac al que le añadimos el correspondiente Ag o Ac. El soporte sólido son placas de microtitulacion de PVC ( polinilclorae, plástico con capacidad de unir proteínas) el aparato lee las placas. Tb se puede usar membranas de nitrocelulosa.

Ej. Inmunoensayo: detección cantidad Ac xa detectar si se ha pasado la rubéola. Ponemos los Ac en la placa añadimos una muestra del Ag q pasa a través de las paredes durante incubación. Lavamos el líq con tampón. Luego añadimos la muestra problema, incubamos y esperamos a q ocurra la unión Ag-Ac, lavamos con tampón. Añadimos un Ac2º ( marcado, desarrollado en otro organismo). Lavamos y revelamos con sustrato para enzima, cmp, espectrofotrometro,...

TIPOS DE INMUNOENSAYO:

1.- Captura del Ac

2.- Captura del Ag

3.- Ensayo con 2 Ac en sándwich

Se dividen en f(x) de cual esta en la placa el Ag, Ac....

MÉTODO DE DETECCIÓN DEL Ag (en orden de mayor a menor sensibilidad)

A. Ensayo con dos anticuerpos en sandwich. Se requieren dos anticuerpos monoclonales diferentes (uno marcado y otro no) o anticuerpos policlonales purificados por inmunoafinidad (un parte marcada y otra no).

Un Ac en el soporte y otro que añadiremos posteriormente marcado. Se suelen usar anticuerpos monoclonales, pq en los ensayos no puede haber ruido de fondo. Se pueden usar Ac policlonales pero deben estar purificados por inmunoafinidad, tendríamos el Ac dividido en 2 partes, una marcada y la otra sin marcar, se unen a distintos epitopos del Ag.

1.-  Unión del anticuerpo no marcado al soporte.

2.-  Bloqueo de sitios de unión libres en el soporte.

3.-  Adición de la muestra de antígeno “problema” y lavado.

4.-  Adición del anticuerpo marcado y lavado

5.-  Revelado del marcador.

Obtenemos una muestra patrón para determinar cuantitativamente cuanto hay.

B. Ensayo de competencia. Se requiere antígeno puro, dos posibilidades:

a) Captura del antígeno, con anticuerpo limitante: Una cantidad conocida de antígeno marcado se mezcla con la muestra problema (contiene antígeno frío) y ambas se ponen en una placa con anticuerpo unido al soporte. Tras incubar y lavar se mide la radiactividad en cada pocillo, cuanto mayor sea la cantidad de antígeno en la muestra, menor será la cantidad de antígeno radiactivo que se detecta (hay que hacer una curva de calibrado).

b) Captura del anticuerpo, con antígeno limitante. En primer lugar se une antígeno puro al soporte y se añade luego una mezcla de anticuerpo marcado y muestra (con antígeno a determinar). Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno en la muestra problema, menor será la unión de anticuerpo a la fase sólida (hay que hacer una curva de calibrado).

C. Ensayo por captura de anticuerpo: la muestra problema se une a la fase sólida y se añade luego un exceso de anticuerpo marcado.

MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE Ac (en orden de mayor a menor sensibilidad):

Detección por captura de anticuerpo, usando un exceso de antígeno:

1.-  Unión del antígeno (en exceso) al soporte sólido.

2.-  Adición de la solución “problema” conteniendo los anticuerpos y lavado (todos los anticuerpos se unen).

3.-  Adición de un anticuerpo 2º marcado (por ejemplo anti-inmunoglobulinas de conejo, obtenidas en cabra, unidas a fosfatasa alcalina) o de proteína A marcada. Lavado

4.-  Revelado del marcador.

Los anticuerpos también pueden ser detectados tratándolos como un tipo más de antígenos, por cualquiera de los métodos de detección de antígenos ya vistos.

Placas cubiertas con streptavidina permiten el uso de antígenos o anticuerpos marcados con biotina.

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