RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR:

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR:

La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es la herramienta analítica que proporciona mayor información estructural y estereoquímica en un tiempo asequible. La técnica no es destructiva y tiene aplicaciones en todas las áreas de la Química y en algunas de la Biología.

Disponiendo de accesorios adecuados permite la observación de tejidos (accesorio de microimagen). Con otros tipos de instrumentos es una técnica de diagnóstico en Medicina.

La Resonancia Magnética Nuclear es una espectroscopia de absorción cuyo fundamento es la absorción de energía (radiofrecuencias) por un núcleo magnéticamente activo, que está orientado en el seno de un campo magnético, y que por efecto de esa energía cambia su orientación.

INTERACIÓN DEL ESPÍN NUCLEAR CON UN CAMPO MAGNÉTICO:

Los núcleos atónicos se caracterizan por un movimiento de rotación en torno a un eje. La frecuencia a la que precesan los núcleos se denomina frecuencia de Larmor:

Como todo movimiento atómico este también está cuantizado, en este caso por el número cuántico de espín nuclear I.

En condiciones normales, a cada núcleo le corresponde un único valor de I.

En el caso de elementos ligeros estas transiciones no se consiguen ya que cada núcleo tiene su propio valor de I, siendo este dependiente del número de protones y neutrones de la siguiente forma:

Nº másico (A)	Nº atómico (Z)	Valor de I	Ejemplos
Impar	Impar	1/2, 3/2, 5/2,...	1H, 19F
Par	Par	0	12C, 16O
Par	Impar	1, 2, 3,...	14N, 2H= D
Impar	Par	1/2, 3/2, 5/2...	13C

Si I = 0 No tiene spín, luego no va a producir espectro, ya que no tienen propiedades magnéticas.

Si I " 1 Todos tienen lo que se llama un momento eléctrico cuadrupolar, lo que quiere decir que no son esféricos, es decir, que su distribución de cargas no es esférica.

OBTENCIÓN DEL ESPECTRO DE RMN:

ESPECTRÓMETRO DE RMN:

A continuación, se muestra de forma esquemática los principales componentes de un equipo para medidas de resonancia magnética nuclear.

El espectrómetro de RMN consta de cuatro partes:

1. Un imán estable, con un controlador que produce un campo magnético preciso.

2. Un transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas.

3. Un detector para medir la absorción de energía de radiofrecuencia de la muestra.

4. Un ordenador y un registrador para realizar las gráficas que constituyen el espectro de RMN.

Para obtener un espectro de RMN, se coloca una pequeña cantidad del compuesto orgánico disuelto en medio mililitro de disolvente en un tubo de vidrio largo que se sitúa dentro del campo magnético del aparato. El tubo con la muestra se hace girar alrededor de su eje vertical.

En los aparatos modernos el campo magnético se mantiene constante mientras un breve pulso de radiación rf excita a todos los núcleos simultáneamente. Como el corto pulso de radiofrecuencia cubre un amplio rango de frecuencias los protones individualmente absorben la radiación de frecuencia necesaria para entrar en resonancia (cambiar de estado de espín).

A medida que dichos núcleos vuelven a su posición inicial emiten una radiación de frecuencia igual a la diferencia de energía entre estados de espín. La intensidad de esta frecuencia disminuye con el tiempo a medida que todos los núcleos vuelven a su estado inicial.

Un ordenador recoge la intensidad respecto al tiempo y convierte dichos datos en intensidad respecto a frecuencia, esto es lo que se conoce con el nombre de transformada de Fourier (FT-RMN).

El imán superconductor mantiene su temperatura de trabajo gracias a que esta recubierto por capas como muestra la siguiente figura:

DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICAS UTILIZADAS:

1D TRANSFERENCIA DE POLARIZACIÓN:

SPT Heteronuclear (Selective Polarization Transfer Heteronuclear).

Técnica basada en la Transferencia de Polarización

Permite Determinar el Signo Relativo de las Constantes de Acoplamiento

Identifica el 1H acoplado dipolarmente con un 13C

Secuencia de pulsos:

Emitimos un pulso de 90ºx en el canal de protón y se deja un tiempo  fijo igual a 1/2J. La J elegida es un promedio de la sustancia, lo cual es una limitación de la técnica.

INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer).

Experimento equivalente al anterior 

Aumenta la Intensidad de la Señal de núcleos con baja Relación Giromagnética

Es importante tener en cuenta que los multipletes pueden aparecer distorsionados, por esto esta tecnica no suele utilizarse en la práctica.

DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)

Técnica basada en la Transferencia de Polarización; permite aumentar la sensibilidad con núcleos poco sensibles (X). Condición: X debe estar acoplado escalarmente con otro núcleo activo de mayor sensibilidad (1H generalmente). 

El experimento X {1H } DEPT distingue para un sistema XHN-jZj las diferentes señales en función del número de H unidos al núcleo activo X.

Así, para 13C-H y la secuencia de pulsos indicada abajo, la selección de la longitud del pulso p3 hace posible discernir entre CH, CH2, CH3 (los C cuaternarios no aparecen):

p3(ðº)/Editado	Ejemplo: Sea el espectro 13C{1H}
45º/CH, CH2, CH3
90º/CH
135º/CH, CH2, CH3

No aparecen los C cuaternarios (o X no unidos a H). Si se desea tenerlos en el espectro se debe emplear las secuencias PENDANT o DEPTQ

Es posible obtener espectros donde sólo aparezca un sólo tipo de XHi (i=1,2,...) empleando combinaciones lineales de los resultados obtenidos mediante DEPT135, DEPT90 y DEPT45.

Secuencia de pulsos:

El comienzo de la secuencia de pulsos del DEPT es un pulso de 90° de protón. El tiempo de espera depende (al igual que en el INEPT) de la velocidad de relajación de protón (esto es una ventaja ya que esta es mas rápida que la de carbono). El pulso de protón de ángulo variable transforma la coherencia directamente observable de single cuanto. El pulso de 180 de carbono se aplica para asegurar que los desplazamientos del heteronúcleo X son perfectamente reenfocados. La intensidad de la señal del heteronúcleo que es finalmente detectada depende de la longitud del pulso de ángulo variable y también del numero de protones unidos directamente ( acoplados a un enlace) al núcleo X.

2D CORRELACIÓN HOMONUCLEAR:.

EXPERIMENTOS:

1H,1H-COSY (Correlation SpectroscopY)

Información que proporciona

 

- Detecta pares de núcleos acoplados escalarmente.

- Orden de Magnitud de J detectada: detecta J 3 Hz (es capaz de medir nJ con n3)

 

Por ejemplo en:

En un COSY90 deberán dar señal de correlación: sólo H con H y H con H intensos, en un experimento Long Range COSY además deberá dar señal de correlación H con H intensa

  

- Forma en que aparece la información:

 

 Se obtiene dos espectros de s y Js, las proyecciones sobre cada eje dan el espectro monodimensional.

ESPECTRO:

• De las señales diagonales se lee el desplazamiento químico.

• De las señales de cruce obtenemos la posición de los protones en acoplamiento al protón considerado.

COMO SE MIDE:

Se traza la diagonal donde se encuentran los desplazamientos químicos de todos los protones, y para localizar con cuales se encuentra en acoplamiento un protón dado se trazan horizontales.

 

• A tener en cuenta:

• No sirve para determinar el valor de J

•   El experimento funciona incluso en el caso de sistemas que dan espectros 1D no resueltos

Secuencia de pulsos:

 

 

ph1: (x)4, (y)4, (-x)4, (-y)4

ph2: x, y, -x, -y

adq: (x, -x)2, (-y, y)2, (-x, x)2, (y, -y)2

 

Pulso de 90ºx en el canal de protón, transforma la magnetización longitudinal en magnetización transversal.

Se deja un tiempo de evolución, en el cual el vector de magnetización se desdobla en dos, separadas por un ángulo  , cuanto mayor diferencia de desplazamientos químicos exista entre los protones en acoplamiento, mayor será la diferencia de ángulos.

Si transcurrido ese tiempo se emite un segundo pulso:

• Las componentes de x´ no se alteran.

• Las componentes de y´ giran 90º.

La intensidad de la señal que se recibe mediante el FID va a estar modulada por J y por , ya que se mide el valor de las componentes en x´ e y´.

• La primera transformada de Fourier: las líneas estarán moduladas de acuerdo con T1.

• La segunda transformada de Fourier: nos permite determinar los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento.

VARIANTES DEL COSY:

• COSY-45. Se sustituye el segundo pulso de 90º por uno de 45º, así se disminuye la intensidad de las señales diagonales, aumentando así la intensidad de las señales de cruce.

• COSY-LR (A larga distancia). Se introduce una mayor demora antes y después del pulso de 90ºx, así se logra aumentar la intensidad de las señales de cruce correspondientes a constantes de acoplamiento pequeñas.

• COSY-DQF. Se irradia con dos pulsos de 90º muy próximos en el tiempo (se comporta como un filtro dicuántico), elimina señales de singletes, como por ejemplo la del disolvente.

13C,1H-COSY:

Es una técnica análoga a la anterior (pero de correlación heteronuclear) que permite calcular los desplazamientos químicos de protones y carbonos, permitiendo así saber a que piezas se encuentran unidas por enlace químico.

Secuencia de pulsos:

Primero se da un pulso de 90ºx en el canal de protón, haciendo pasar así a los vectores de magnetización a la dirección positiva del eje y´ , tras un tiempo t1/2 se emite un pulso de 180ºx en el canal de 13C (o del heteroátomo) que invierte los campos de acoplamiento y el sentido de giro de los vectores (se invierte la población del 13C).

Pasado el t1/2 los dos vectores de acoplamiento dan un eco.

Se introduce entonces una demora (tiempo fijo ajustado a : 1 = 2 = 1/2J).

Pasado este tiempo los vectores de acoplamiento se encuentran en oposición de fase.

Se emite ahora el pulso de 90ºy en el canal de protón, y al mismo tiempo se emite uno de 90ºx en el canal de 13C.

Al alterar la magnetización del protón, se altera la de los carbonos en acoplamiento a el.

Se deja evolucionar un tiempo T= 1, como uno es dextrógiro y otro levógiro, se acaban juntando produciendo un vector a lo largo de eje x´.

En el momento de la detección se desacopla mediante un desacoplamiento de banda ancha.

La intensidad de un singlete de 13C va a venir modulada por el desplazamiento químico del protón con el cual estaba acoplado.

Si se hacen espectro con T1 variable se ven las distintas frecuencias de modulación de los distintos carbonos y con ello se determinan los desplazamientos químicos de los protones a los que estaban unidos.

TÉCNICA TOCSY: (Correlación total).

Esta técnica se basa en el mecanismo de relajación escalar.

Secuencia de pulsos:

El primer pulso de 90º pasa la magnetización longitudinal a magnetización transversal.

Pasado un tiempo T1 se aplica otro pulso de 90ºx que restaura parte de la magnetización longitudinal.

El tercer pulso nos permite ver la variación de la intensidad de los distintos protones que provocan la transferencia de polarización (se denomina pulso de medida).

TÉCNICA 1D TOCSY:

Es una variante muy importante de la anterior ya que requiere un tiempo de registro bajo.

El pulso de 90º que se da en esta variante, es selectivo, es decir, solo afecta a un determinado protón. Al ser selectivo hace desaparecer la magnetización longitudinal de ese núcleo transformándola a transversal.

Al hacer desaparecer la magnetización del núcleo irradiado, al estar interconectados los núcleos en la molécula afectará a las intensidades de el resto.

• Si TM es corto: solo se transferirá entre los núcleos con acoplamiento grande respecto al irradiado.

Por tanto, al ir aumentando el tiempo de mezcla se irá viendo como se transfiera la magnetización entre los núcleos de una cadena.

EFECTO NOE: EFECTO NUCLEAR OVERHAUSER:

Es un efecto basado en acoplamientos dipolares, que son los que se producen a través del espacio, y a diferencia de los escalares no suelen provocar acoplamientos, estos solo se dan cuando la distancia entre los nucleos es inferior a la suma de radios de Van der Waals.

El efecto NOE se describe como la variación de la intensidad que experimenta la señal de un núcleo X al irradiar un nucleo A con el que X se encuentra en acoplamiento dipolar, (independientemente de que estubieran o no en acoplamiento escalar).

El efecto NOE no es enstantáneo, de forma que si el tiempo de irradiación es corto, no aparecerá este efecto en los espectros de desacoplamiento.

Otra cosa importante para llevar a cabo experimentos basados en este efecto, es que las muestras deben estar previamente desgasificadas, de lo contrario el mecanismo de relajación paramagnético sustituirá al dipolar y no se apreciará este efecto.

1H, 1H NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY)

Se basa en introducir un tiempo de mezcla en una secuencia análoga a la del H-H COSY.

Nos da información sobre sistemas de espín acoplados dipolarmente (a través del espacio, acoplamiento directo). Identifica espines que evolucionan mediante relajación cruzada.

- Determina en un sólo experimento todas las variaciones de señal por NOE que se pueden producir en la molécula

- Determinaciones estructurales en problemas de estereoquímica (exo/endo, Z/E, etc).

Determinación	Ejemplo
Geometría de Alquenos (Z vs E)
Configuraciones
Asignaciones de H en Anillos Aromáticos

-En general, las señales de cruce indican qué protones se encuentran cerca de otros.

Los NOE pueden ser positivos o negativos

El signo de las señales de correlación puede ser igual o distinto al de las señales de la diagonal principal.

Señales Diagonal	Origen de Pico Cruce	Signo Pico Cruce
Positiva	NOE Positivo	Negativo
		NOE Negativo	Positivo
		Intercambio Químico	Positivo
		Tipo COSY	Fase mezclada/Antifase

Las distancias que da el NOE son aproximadas. Se trata de estimaciones, no son medidas comparables a un análisis de difracción de Rayos X.

Secuencia de pulsos:

Durante el tiempo de mezcla:

La evolución temporal de dos sistemas acoplados dipolarmente se puede explicar mediante las ecuaciones de Solomon. Así, dependiendo de las condiciones iniciales después del segundo pulso tras el período Tm las ecuaciones que gobiernan el estado del sistema son:

La información que se transfiere directamente del espín I1z (que evolucionó según T1 durante t1) al espín I2z (que evoluciona según T2 durante la adquisición, t2) da lugar a las señales de correlación.

En la secuencia d1-90x-t1-90-x-ðm-90x-AQ(t2):

El ciclo de fases elimina todas las coherencias distintas de las de cero cuanto que se detectan en t2. 

1H, 1H ROESY (Rotating-frame Overhauser Enhancement SpectroscopY)

Sistemas de espín acoplados dipolarmente (a través del espacio, en acoplamiento directo). Identifica espines que evolucionan mediante relajación cruzada en condiciones de spin-lock (espines fuertemente acoplados).

Determina en un sólo experimento todas las variaciones de señal por NOE que se pueden producir en la molécula.

Tiene las misma aplicaciones que la secuencia NOESY y complementa a esta en los casos en los que se anula el NOE (ð0ðc=1), lo cual suele ocurrir para moléculas con pesos moleculares comprendidos entre 1000 y 2000 daltons.

Signo:

- Para dos espines acoplados directamente, las señales ROE son positivos.

El signo de las señales de correlación puede ser igual o distinto al de las señales de la diagonal principal.

Signo Señales Diagonal	Origen de Pico Cruce	Signo Pico Cruce
Positiva	ROE Directo	Negativo
		ROE Negativo	Positivo (débil)
		Intercambio Químico	Positivo
		Tipo COSY	Fase mezclada/Antifase
		TOCSY	Positivo
		Falso ROE (TOCSYðROE)	Negativo

-Interferencias Posibles: 

Interferencias en ROESY	Solución
a) Señales tipo TOCSY	Repetir los experimentos con diferente frecuencia de referencia [las señales tipo TOCSY se verán fuertemente alteradas)]
		Usar una baja potencia de radiofrecuencia (2-3 KHz)
		Usar secuencias de pulsos  de spin lock especiales a) -(ðy-δ)n-  con ððð ððº b) -(ðððx-ððð-x)n-

b) Señales tipo COSY. Son debidas a que la secuencia spin-lock actuó como un pulso de 90º. Las señales suelen ser poco intensas.

c) Atenuación de los picos de cruce por efecto off-resonance

Secuencia de pulsos:

Tras el período t1, la aplicación de la secuencia spin lock hace que toda la magnetización sobre el eje y evolucione por efecto la relajación cruzada. Así, si dos espines 1 y 2 están acoplados dipolarmente, en el experimento ROE se transfiere directamente información desde  I1y (que evolucionó según T1 durante t1) al espín I2y (que evoluciona según T2 durante la adquisición, t2).

Además la secuencia -(ðððx-ððð-x)n-  (ROE-transverso) suprime eficazmente la interferencia TOCSY.

2D CORRELACIÓN HETERONUCLEAR:

HETCOR (Correlation SpectroscopY).

- Detecta acoplamientos escalares a través de enlaces pero de núcleos distintos.

- Orden de Magnitud de J detectada: 145 Hz.

Por ejemplo en:

 

 

Deberán dar señal de correlación: H con C y H con C

 

• Forma en que aparece la información:

 

 

Se pueden manipular los parámetros de este experimento para que también sirva para medir acoplamientos a larga distancia.

 

Secuencia de pulsos

 

 

d2 es el parámetro más importante que permite seleccionar los acoplamientos a un enlace, d2= 1/(21JC,H ).

 

Transferencia Efectiva: 2IxSz 2IzSx tras los pulsos de 90º en H y 13C.

 

Picos de cruce: procede de 2 IxSz que está modulado en 1 durante t1 y que al transformarse en 2IzSx, tras los pulsos de 90º (p2 y p3), da origen a términos que están modulados en 2 durante la adquisición (t2).

 

Long-Range-HETCOR. (Long-Range-Heteronuclear-Correlation)

 

- Detecta acoplamientos escalares a través de un enlace.

- Orden de Magnitud de nJ detectada: 10 Hz.

 

Por ejemplo en:

 

 

Deberán dar señal de correlación: H con C y H con C

• Forma en que aparece la información:

 

• En el espectro aparecen las señales deseadas de 2JH,C y 3JH,C; ya que 2JH,C  3JH,C no es posible discernir estas señales.

• Pueden aparecer todos los acoplamientos H, C que impliquen nJC,H = 1/(2 d2 ).

• Las correlaciones basadas en 1JH,C interfieren siempre por ello es preciso realizar el experimento HETCOR para comparar

 

Secuencia de pulsos:

d2 es el parámetro más importante que permite seleccionar los acoplamientos a más de un enlace, d2= 1/(2 nJC,H ), n1.

 

Transferencia Efectiva: 2IxSz 2IzSx tras los pulsos de 90º en H y 13C.

 Picos de cruce: procede de 2 IxSz que está modulado en 1 durante t1 y que al transformarse en 2IzSx, tras los pulsos de 90º (p2 y p3), da origen a términos que están modulados en 2 durante la adquisición (t2).

TÉCNICAS DE DETECCIÓN INVERSA:

Los experimentos de correlación entre proton y un heteronúcleo hacen uso de un método de adquisición que se denomina detección inversa. Esto se refiere al hecho de que la información del desplazamiento químico del heteronúcleo está codificada en la señal de 1H que es la que se finalmente se detecta. La ventaja de los experimentos de detección inversa es que se puede mejorar mucho la sensibilidad en la detección del heteronúcleo habitualmente baja debido a su pequeña constante magnetogírica y/ó baja abundancia natural.

Los experimentos de detección inversa suelen comenzar mediante una transferencia inicial de polarización desde protón que tiene cte. magnetogírica alta (I en la figura), hacia el heteronúcleo con una cte. magnetogírica menor (S en la figura). El siguiente paso es la evolución del desplazamiento químico del heteronúcleo seguida de otras posibles etapas intermedias. Al final del proceso hay una transferencia de vuelta de la magnetización desde el heteronúcleo a protón que es el que finalmente se detecta y que codifica el desplazamiento químico del heteronúcleo. Mediante este proceso de ida y vuelta de la magnetización (protón->heteronúcleo, heteronúcleo-> protón), se produce un incremento en sensibilidad respecto al experimento con detección directa.

2D HSQC editado

Experimento 2D de correlación 1H/13C tipo HSQC con edición de multiplicidad de carbonos.

Permite distinguir las señales de picos que pertenecen a grupos CH, CH2 y CH3.

Existen las siguientes opciones para este experimento:

• Desacoplamiento de otros núcleos durante los tiempos de evolución

• Supresión de disolvente/s (WET, watergate etc.)

Es un método de correlación de constantes de acoplamiento heteronucleares.

Secuencia de pulsos

HMQC: (Coherencia cuántica múltiple heteronuclear).

Es una técnica similar al H-H COSY ( los espectros se leen igual). Se diferencian en que la secuencia de pulsos es diferente:

Se llama técnica de detección inversa ya que se mejora la sensibilidad (respecto al H-H COSY) observando (midiendo en) el decaimiento del protón que es el núcleo mas sensible.

HMBC:

Este experimento 2D permite tener información y asignar señales del esqueleto de una molécula.

Los picos que se observan son correlaciones a través de dos o tres enlaces entre un protón y un heteronucleo). En ocasiones se puede llegar a observar correlaciones hasta cuatro enlaces.

Una gran ventaja de este experimento cuando el heteronucleo es poco sensible y/o abundante ( por ejemplo carbono trece o nitrógeno quince), es su mayor sensibilidad respecto al experimento 1D de detección del heteronucleo. Los carbonos cuaternarios pueden ser difíciles de observar en el espectro monodimesional por su baja sensibilidad. Para estos casos, el HMBC es una alternativa mucho más sensible que permite observar y asignar correlaciones de carbonos cuaternarios que tengan 1 protón a dos o tres enlaces.

COMBINACIONES:

2D HMQC- TOCSY

Experimento híbrido que combina HMQC y TOCSY. El espectro 2D que se obtiene contiene por un lado las correlaciones directas a un enlace protón / carbono (autopico) y además para cada una de estas correlaciones aparecen las correlaciones TOCSY del sistema de espines con el protón del auto-pico.

Este experimento es útil para trazar la conectividad 1H-1H en regiones en que hay mucho solapamiento en el espectro de protón.  

Secuencia de pulsos

HMQC-TOCSY versión sin gradientes

El primer paso de la secuencia es un HMQC en que la magnetización de proton se transfiere al 13C que tiene directamente unido que evoluciona durante t1. A continuación la magnetización se transfiere de vuelta al protón original que tiene unido directamente. Esto es seguido por un período de mezcla (mix) donde se aplica una secuencia de bloqueo de espines tipo MLEV-17, DIPSI-2 etc para realizar la transferencia TOCSY a los demás protones del sistema de espín que son detectados durante t2.

HMQC-TOCSY versión con gradientes

En esta versión de HMQC-TOCSY se utilizan los gradientes para realizar la selección de coherencias lo que permite reducir el ciclo de fases.

2D selC HMQC- NOESY

Experimento híbrido que combina HMQC y NOESY. El espectro que se obtiene es un 2D con correlaciones directas a un enlace protón/ heteronúcleo (HMQC). Además en la traza de la dimensión de proton de cada pico de correlación directa 1H/13C aparecen las correlaciones NOESY con el protón correspondiente.

Esta secuencia incorpora dos pulsos semiselectivos en el heteronúcleo con objeto de poder seleccionar una región del espectro de interés lo que permite acortar el tiempo de adquisición.

Secuencia de pulsos

 

El primer paso de la secuencia es un HMQC con pulso semiselectivo en heteronúcleo. Solamente para aquellos carbonos seleccionados, la magnetización de protón se va a transferir al 13C que tiene directamente unido.

Durante el siguiente periodo de evolución t1 se registra el desplazamiento químico del heteronúcleo y el acoplamiento heteronuclear mediante operadores de doble y cero cuanto a la vez que se suprime el acoplamiento heteronuclear 1H-13C mediante un pulso de 180º en medio de t1.

A continuación, mediante otro pulso selectivo en heteronúcleo, la magnetización se transfiere de vuelta al protón que tiene unido directamente. Esto es seguido por un período de mezcla (mix) donde simplemente se espera un tiempo para que haya transferencia NOESY desde este protón a los demás protones acoplados dipolarmente.

La magnetización que resulta es finalmente detectada durante un periodo t2 con desacoplamiento de heteronúcleo.

 

 

Practica de Resonancia Magnética

Nuclear

SECUENCIAS BÁSICAS 1D Y 2D