TEMA 8: LA REPLICACION

Es el proceso por el cual se duplica la molécula de DNA para dar dos moléculas idénticas a la primera. Watson y Crick ya proponen este proceso. Se separan las dos cadenas y luego por complementariedad se formará la otra cadena y así dos moléculas de DNA.

Es semiconservativa pq conserva una cadena de DNA parental y otra sintetizada por complementariedad. Es un proceso muy rápido y preciso donde se revisan los errores y se corrigen. Lo lleva a cabo un complejo de enzimas y proteínas que se llama replisoma y se pueden distinguir tres etapas:

En e.coli (procariotas)

Hay un inicio de replicación que se llama Ori C, se caracteriza por ser una secuencia de DNA de 245 pb y es muy rica en Adenina y Timina, y por lo tanto una secuencia poco estable y facilita la apertura del DNA donde se tiene que iniciar la replicación. Aquí se unen una serie de proteínas que reconocen la secuencia y aquí se estructuran los replisomas.

Se empieza a copiar las cadenas. Los replisomas avanzan bidireccionalmente copiando las dos cadenas en las dos direcciones, y se genera una zona de avance que se visualizan como horquillas y se les llaman horquillas de replicación.

Se copian las dos cadenas y terminan en las secuencias de terminación aquí se unen unas proteínas que reconocen la secuencia y hace que se suelte el replisoma.

DNA POLIMERASAS

Sintetizan DNA y forman enlaces fosfodiester entre dNTPs

(DNA)n + dNTP = (DNA)n+1 + PPi

Se forma el enlace fosfodiester y se libera el fosfato. Los sustratos de la reacción son las dNTP: dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Estos necesitan un molde de DNA que copiar estas son enzimas DNA polimerasas de DNA dependientes que copian una secuencia de DNA. Estas no pueden empezar a sintetizar una cadena, necesitan una secuencia de DNA que copiar y una secuencia con extremo 3´ libre con un OH libre para engancharse y seguir copiando. Esto último es el cebador que es lo que reconocerá la polimerasa para empezar a copiar. Así todas las DNA polimerasas polimerizan 5´-3´.

El pirofosfato (producto) se hidroliza a 2 fosfato mediante la pirofosfatosa y esta reacción es la que despide el equilibrio de forma que sea irreversible pq se rompen dos enlaces que liberan mucha energía. Se rompen dos enlaces para formar uno ( PPi-2Pi).

Los sustratos son activados, llevan la energía para la reacción. Son enzimas procesivas pq se unen al molde y no se sueltan hasta que han producido varios libros de catalisis, pueden permanecer unidas al molde, además tienen actividad correctora de errores.

Hay tres tipos de DNA polimerasas:

La progresividad cambia dependiendo de la función que realicen.

DNA pol I; implicado en la síntesis de una de las cadenas, la cadena retrasada.

DNA pol II; no se sabe el papel que juega, probablemente esté implicada en la reparación.

DNA pol III; es la implicada en la replicación de las dos cadenas. Es una molécula más grande formada por muchas subunidades y funcionalmente es un dímero asimétrico. Así un monómero copia la cadena continua y en otra la cadena discontinua. Cuando está formado el dímero se le llama holoenzima de DNA pol III. Puede polimerizar hasta 500.000 polinucleótidos.

CORRECCIÓN DE ERRORES DE DNA POL III:

El centro activo admite los 4 DNtps el molde es un nucleótido entrante complementario. La DNA pol II cataliza un enlace en su centro activo erróneo, y el ciclo de la catálisis comprueba si se ha formado un apareamiento correcto o no, en un nuevo centro activo que polimeriza y entran en un sitio donde sólo cabe la estructura correcta, con la forma correcta de los pares complementaria; si es erróneo vuelve atrás y se repetirá la replicación para corregir el error. El nuevo centro activo lee el molde de pares de bases, y si es erróneo lo corrige. Lo hace tan rápido que cuando acaba de polimerizar la hebra nueva ya está corregida. DNA pol 5´-3´tiene la capacidad de hidrolizar de 3´-5´(actividad exonucleasa) si es correcto sigue polimerizando 5´-3´. Si corta la secuencia tendrá actividad endonucleada. La tasa de error es del orden 10^-6_10^-8.

ELONGACIÓN

La replicación avanza por una horquilla en una misma dirección. Las cadenas son antiparalelas y la dirección de la replicación es 5´-3´. La otra cadena se replica por partes. Así se diferencia la cadena continua que es la que se sintetiza 5´-3´y la cadena discontinua. Por marcaje radioacctivo se marcaron los sustratos de la reacción así se encontraron productos largos y pequeños fragmentos de Okazaki. Empieza a copiar un fragmento se suelta y vuelve a copiar otro fragmento.

La cadena continua tb se llama la cadena avanzada pq va más rápido en la replicación. La cadena discontinua tb se llama cadena retrasada. La complejidad de la replicación viene por la cadena retrasada.

El replisoma es el conjunto de todos los enzimas y proteínas que intervienen. Además hay otros componentes esenciales para la replicación.

Cuando se abre el dúplex hay un enzima que es la helicasa, que abre la doble hélice. Se desliza por la doble hélice y va desarrollando más ATP, esto genera una tensión en el DNA que está por delante de la horquilla de replicación. Así tiene que haber enzimas que relajen esa tensión que son las topoisomerasas, su función es mantener el superenrollamiento negativo natural del DNA. La DNA grasa es un tipo de topoisomerasas. La tendencia natural del dúplex abierto es volverse a plegar así debe haber unas proteínas SSB, que tienen mucha afinidad por el DNA de simple cadena. Son pequeñas, tetrámeros que se unen a diferentes tramos, cada 30 nucleótidos. Vana anclando el DNA de cadena simple.

La DNA polimerasa necesita un cebador, esto problema lo resuelve la primasa, que sintetiza el cebador. Sintetiza un cebador al inicio de la replicación en la cadena continua pero en la discontinua tiene que sintetizar un cebador para cada fragmento de Okazaki. La primasa es una RNA polimerasa DNA dependiente (molde DNA), lee desoxiribonucleico e incorpora ribonucleotidos. Esta enzima no tiene cebador y así no tiene capacidad correctora.

La DNA pol III copia ambas cadenas, es un dímero asimétrico y se llama holoenzima DNA polIII. Esta reconoce el cebador y sintetiza de forma procesiva la cadena continua, una vez se ha unido al molde no se suelta. En la cadena discontinua se ha de esperar a que se abra la cadena y la primaria sintetice un cebador para que la DNA pol reconozca 3´OH y lo extienda. Las polimerasas no pueden unir los fragmentos así que se queda un hueco que se le llama nick (ausencia de un enlace fosfodiester), esta estructura lo reconoce la DNA pol I que tiene actividad polimerasa 5´3´, actividad correctora exo 3´5´ (vuelve atrás, verifica y sigue copiando) y es una exonucleasa 5´3´que supone reconocer un extremo e ir degradando nucleótidos. Al encontrar el hueco es capaz de hidrolizar el primer nucleótido del cebador, elimina el ribonucleótido e introduce un desoxiribonucleótido. Sustituye una secuencia de RNA por una secuencia de DNA. El efecto visual es que desplaza al hueco. La DNA pol I tiene una baja procesividad, es un monómero y tres centros activos. Cuando la DNA pol I termina su función actúa la DNA ligasa que reconoce un dúplex que no tiene enlace fosfodiester en una de sus cadenas, así catalizará su formación con la condición del sustraro sea un dúplex.

Como ambas cadenas avanzan en la misma dirección se piensa que la cadena retardada gira la cadena en la misma dirección que la otra cadena. Una vez copia el fragmento suelta la cadena y esta haciendo eso continuamente.