Introducción

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de microorganisos.

Además estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

Objetivos

• Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar -aplicando éste método- distintos microorganismos.

• Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioquímcas es o son el (los) adecuado(s) de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.

• Entender los principios bioquimicos de las pruebas.

• Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioquímias

• Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos

• Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioquímicas.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD TECNOLOGICA

TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

Microbiología

“Pruebas Bioquímicas”

Autor:

Lab N° 4

Cod. 06

Bibliografía

• Microbiología / Thomas D. Brock, Michael T. Madigan

2a. ed. en español, 1993. México ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana.

• Microbiología / Michael J. Pelczar, Jr., Roger D. Reid

2a. ed. en español., 1982. México : Ed. McGraw-Hill.

• Tratado de microbiología : con inclusión de inmunología y

genética molecular / Bernard D. Davis

2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat.

Internet:

• http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html

• http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html

• http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html

• http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html

Prueba de la Oxidasa

El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.

Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.

Procedimiento:

Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.

Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.

Resultados:

(+) Pseudomonas aeruginosa

( - ) Escherichia coli

Prueba de la Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa

El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

Prodecimiento:

Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de peróxido de hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp.

Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.

Procedimiento:

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no oganizados

2: pequeños coágulos oganizados

3: gran coágulo organizado

4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Staphylococcus epidermis.

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción	Interpretación
Enturbiamiento del Agar.	Hay movilidad
Agar transparente de- sarrollo solo en picada	No hay movilidad
Azul (alcalino)	Descarboxila ornitina
Coloración Amarilla (ácido)	No descarboxila
Rojo (anillos)	Indol (+)
Amarillo (anillos)	Indol ( - )

Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

• bacterias fermentadoras de la glucosa

• bacterias fermentadoras de la lactosa

• bacterias fermentadoras de sacarosa

• bacterias aerogénicas

• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Prodedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

Resultados:

• Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp.

• Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.

• Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp.

• Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Procedimiento:

Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción	Interpretación
Azul (alcalino)	Hay movilidad
Rojo	No hay movilidad
Engrecimiento	Descarboxila ornitina
Ruptura del Agar	No descarboxila
Fondo Amarillo y Tendido púrpura	Descarboxilación de lisina

Pruebas Bioquímicas IMViC:

Agar Citrato

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento:

Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir  falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Resultados:

(+)Klebsiella spp.

( - ) Escherichia Coli

Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Resultados:

(+) Escherichia coli

( - ) Klebsiella pneumoniae

Rojo Metilo

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. 
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

Resultados:

(+) Escherichia coli
( - ) Enterobacter aerogenes

Vogues Proskauer

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Procedimiento:

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia  luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados:

(+) Enterobacter aerogenes

(-)Escherichia coli

Microorganismos utilizados en las Pruebas Bioquímicas

MICROORGANISMO	FAMILIA	TINCION	FORMA	MOVILIDAD
PSEUDOMONA SPP.	ENTEROBACTER	GRAM -	BACILOS CORTOS, CURVADOS O RECTOS	POSEE FLAGELOS POLARES
SALMONELLA	ENTEROBACTER	GRAM -	BACILOS CORTOS	FLAGELOS PERÍTRICOS
SHIGUELLA SPP.	ENTEROBACTER	GRAM -	BASTONCILLOS	NO TIENE
ESCHERICHIA COLI	ENTEROBACTER	GRAM -	BACILOS CORTOS NO ESPORULADOS	FLAGELOS PERÍTRICOS
STAPHYLOCOCCUS AUREUS	MICROCACEAE	GRAM +	COCACEA	NO TIENE

Resultados Experimentales

Grupo 1: Sebastián Leyton - Carlos Vera

Grupo 2: Yuri Gálvez - David Fuica

Grupo 3: Graciela Quintero - Carolina

Grupo 4: Carolina Iribarra - Jessica Pizarro

Oxidasa

MICROORGANISMO	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
PSEUDOMONA SPP.	+	+	+	+
SALMONELLA	+	+	+	+
SHIGUELLA SPP.	-	-	-	-
ESCHERICHIA COLI	+	+	+	+
STAPHYLOCOCCUS AUREUS	-	-	-	-

Catalasa

MICROORGANISMO	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
PSEUDOMONA SPP.	+	+	+	+
SALMONELLA	+	+	+	+
SHIGUELLA SPP.	-	+	-	+
ESCHERICHIA COLI	+	+	+	+
STAPHYLOCOCCUS AUREUS	+	+	+	+

Coagulasa

MICROORGANISMO	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
STAPHYLOCOCCUS AUREUS	+	+	+	+

Indol

MICROORGANISMO	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
ESCHERICHIA COLI	+	+	+	+

Agar Citrato

MICROORGANISMO	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
ESCHERICHIA COLI	-	-	-	-

Vogues-Proskauer

MICROORGANISMO	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
ESCHERICHIA COLI	-	-	-	-

Rojo Metilo

MICROORGANISMO	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
ESCHERICHIA COLI	+	+	+	+

LIA

MICROORGANISMO(S) DETECTADO(S)	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
SALMONELLA	DESCARBOXILACION DE ORNITINA	DESCARBOXILACION DE ORNITINA	DESCARBOXILACION DE ORNITINA	DESCARBOXILACION DE ORNITINA
SHIGUELLA SPP.	DESCARBOXILACION DE LISINA	DESCARBOXILACION DE LISINA	DESCARBOXILACION DE LISINA	DESCARBOXILACION DE LISINA

MIO

MICROORGANISMO(S) DETECTADO(S)	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
PSEUDOMONA SPP.	DESCARBOXILACION DE ORNITINA	DESCARBOXILACION DE ORNITINA	DESCARBOXILACION DE ORNITINA	DESCARBOXILACION DE ORNITINA
ST. AUREUS	NO DESCARBOXILA ORNITINA	NO DESCARBOXILA ORNITINA	NO DESCARBOXILA ORNITINA	NO DESCARBOXILA ORNITINA

TSI

MICROORGANISMO(S) DETECTADO(S)	GRUPO 1	GRUPO 2	GRUPO 3	GRUPO 4
SALMONELLA	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO
SHIGUELLA SPP.	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS	GLUCOSA FERMENTADA LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADAS

Diagrama de flujo realización de Pruebas Bioquímicas

RECOLECCIÓN DE MATERIALES A UTILIZAR EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS

PREPARACION DE MATERIAL DE LABORATORIO

REALIZACION DEL PROCEDIMINTO PARA PRUEBAS BIOQUIMICAS

INCUBACION DE MUESTRAS

ANOTAR RESULTADOS

ANALISIS DE RESULTADOS

COMPARACION DE RESULTADOS EXPERIMENTALES Y TEORICOS

EVALUACION Y RESULTADOS FINALES DE PRUEBAS BIOQUIMICAS