LA PROTEONOMICA.

Durante el siglo XX se ha llegado a conocer la estructura celular y los distintos tipos de moléculas que juegan papeles claves en la gran máquina de la vida. Entre ellas, las moléculas de los ácidos nucleicos que forman los genes. Gran parte de la secuencia de nuestro genoma sirve para codificar la producción de proteínas, las otras moléculas sobre las que se asienta la vida, las que hacen el trabajo para que un organismo funcione a la perfección, o deje de hacerlo. El impacto de los estudios sobre proteínas será enorme. La mayor parte de las enfermedades están asociadas a una proteína, por lo que el diseño de fármacos específicos está ligado al conocimiento de cómo esa proteína funciona. Muchas reacciones bioquímicas basadas en mecanismos enzimáticos que son utilizadas en la industria, podrían verse mejoradas con el conocimiento exacto de la estructura del enzima que las regula. Podremos también aprender a fabricar, como lo hacen los organismos vivos, estructuras mecánicamente excelentes, como los huesos y diseñar prótesis a medida. Por lo tanto, no es de extrañar que, tras el análisis del genoma, el siguiente gran desafío de la investigación biológica sea el conocimiento sistemático de esas moléculas de proteínas codificadas en el genoma. Este gran proyecto se ha denominado descubrimiento de la proteómica o genómica estructural. Se persigue la catalogación y el análisis estructural de las distintas proteínas, unas cien mil, que existen en el cuerpo humano. O al menos de las cinco mil que se consideran de mayor interés.

Las proteínas son moléculas enormes, cuyo peso molecular puede ser miles de veces mayor que el de una molécula, por ejemplo, de vitamina C. Consisten en largas cadenas de aminoácidos con distintos residuos, que se pliegan sobre sí mismas en formas complejas con multitud de recovecos. Precisamente, el trabajo que cada proteína realiza depende de ese plegamiento, por lo que es indispensable conocer los detalles íntimos de esas complejas estructuras para avanzar los estudios de biomedicina y biotecnología. Desgraciadamente no existe hoy en día un microscopio suficientemente potente para ver con nitidez la posición de los átomos en esas grandes macromoléculas y obtener una imagen de su estructura en volumen.

DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS.

Hay una salida para descubrir la estructura de las proteínas, que es conocida por la cristalografía y que se basa en una aplicación de los rayos X. Cuando la luz de cualquier tipo pasa a través de una estructura ordenada, por ejemplo un apilamiento ordenado de bloques formados por distintos elementos, se difracta y cuando sale de ella, contiene información suficiente sobre cómo están colocados los elementos en los bloques. Es decir se obtiene como una imagen en sombra de la estructura de los bloques. Esta imagen sólo se puede obtener cuando la longitud de onda de la luz que se utiliza es semejante a la distancia entre los elementos ordenados o bloques. Cuando se descubrió que los rayos X tenían una longitud de onda parecida a las distancias entre los átomos de las moléculas (una distancia cien millones de veces más pequeña que un centímetro), comenzó toda una revolución en el conocimiento de la estructura íntima de los materiales. Solo hacía falta una estructura ordenada de moléculas, es decir un cristal. Muchas substancias minerales, como la sal común o el diamante, forman cristales. Otras, como el azúcar eran productos naturales extraídos de vegetales que se producían cristalizados. Y pronto aprenderíamos a fabricar cristales de moléculas sintéticas. Cuando se obtuvieron cristales de proteínas, tarea muy difícil, el siguiente paso era más sencillo: aplicar la difracción de rayos X a esas macromoléculas biológicas. Mediante el conocimiento de las estructuras de las proteínas. Se abrió la puerta hacia sus aplicaciones en biología y medicina.

Por supuesto, dado que es muy difícil cristalizar las proteínas, un paso ineludible en ese proyecto del Proteoma es este, aún más que fabricar artificialmente la cadena de las proteínas compuesta por una sucesión de aminoácidos. De hecho se piensa que la purificación y sobre todo cristalización de las proteínas es el cuello de botella para descubrir sus funciones y aplicaciones . Desgraciadamente tanto las proteínas, como los carbohidratos y los ácidos nucleicos, por no decir ya las moléculas combinadas de ellos, son reacias a cristalizar. Además de su gran tamaño y su complicada forma, los apilamientos de esas macromoléculas (cristales) son difíciles de obtener porque la interacción que las mantiene unidas unas moléculas con otras son débiles fuerzas o enlaces como los de hidrógeno, o los puentes salinos, no los firmes enlaces que asientan fuertemente los cristales de moléculas pequeñas.

Es decir por una parte la propia estructura tridimensional de una macromolécula como una proteína es muy frágil (enlaces débiles entre distintos puntos de la cadena como puentes de hidrógeno o puentes de disulfuro), pero por otra parte las uniones de las macromoléculas entre si para formar el cristal es aún mucho mas débil. Todo ello hace a estos sistemas muy inestables y que para obtener buenos cristales y de grandes dimensiones las condiciones experimentales sean muy precisas y delicadas.

Este inusualmente gran cristal cubico del virus del mosaico del tabaco ha crecido en microgravedad en un satélite. Es así de un tamaño 30 veces mayor que el de cristales similares crecidos en la Tierra.

¿CÓMO OBTENER BUENOS CRISTALES DE PROTEÍNAS?

Obtener un cristal de alta calidad es muy parecido a levantar un muro de ladrillos de distintos colores con una pauta determinada. Mientras más lento le suministremos al albañil los ladrillos más ordenado será el muro en su forma y más se ajustará a la pauta de colores. Si el suministro es más rápido que su habilidad para colocarlos adecuadamente el resultado será un muro más desordenado. Disponer de un buen molde (parte ya fabricada del muro) y de un buen cemento adecuadamente moldeable ( añadir un agente cristalizante, compuesto que provoca la unión de las moléculas de proteínas) facilita mucho la labor de obtener un muro estupendo.

La técnica de cristalización que la mayoría de laboratorios utilizan hoy en día en la Tierra, es una técnica de evaporación que consiste en depositar una gota de una disolución de proteína y aditivos y dejarla evaporar parcialmente en determinadas condiciones experimentales (pH, temperatura, presión, disolventes, distintas proporciones de agentes cristlizantes, etc.). Se espera que después de varios días de evaporación el azar haga que aparezcan buenos cristales. Esta metodología basada en ensayo y error, es decir se preparan cientos de gotas diferentes con la esperanza de que en alguna de ellas se atisbe tendencia a la cristalización. A continuación se prepara una nueva remesa de gotitas alrededor de esa condición experimental prometedora, y así hasta que finalmente se obtenga un cristal adecuado.

Cuando un cristal está bien ordenado y es grande, la ordenación de otras proteínas a su alrededor es más fácil, y se puede pasar de la obtención en la escala de los microgramos a la de gramos con un mayor rendimiento. Los cristales de las proteínas son frágiles y blandos, contienen tanta agua en su interior que no resisten el contacto con el aire. Para realizar con ellos los estudios de difracción, hay que colocarlos en un pequeño capilar transparente a los rayos X para evitar que se sequen.

Todo ese trabajo es rutinario, conlleva mucho esfuerzo y los resultados dependen en cierta medida de la suerte en la cristalización, por lo que todos los proyectos de genómica estructural o proteonómica hecha en la Tierra (USA, Japón y Alemania) contemplan la creación de robots que generen miles de gotas y realicen todas las operaciones descritas de forma automatizada.

Un procedimiento mas avanzado, que acelera esa búsqueda aleatoria y facilita los estudios de difracción es obtener los cristales en el Espacio en condiciones de Microgravedad.

Las proteínas son los ladrillos de nuestro cuerpo y del mundo vivo que nos rodea. Si la estructura de una proteína es conocida, entonces las empresas farmacéuticas pueden desarrollar nuevos fármacos o mejorar los conocidos para luchar contra la enfermedad en la cual dicha proteína participa. En la Tierra en la disolución de cristalización hay corrientes de convección, sedimentación y otros fenómenos inducidos por la gravedad que obstaculizan las tendencias de crecimiento de un cristal, y el resultado es la formación de unos cristales con muchos defectos como se muestra en la foto izquierda. En microgravedad, pueden crecer cristales de gran calidad en un ambiente libre de esos efectos. Estos óptimos cristales como los mostrados en la foto de la derecha proveen buenos datos estructurales. La investigación sobre cristales de insulina humana, como los de la primera fotografía pueden ayudar a mejorar el tratamiento de la enfermedad de la diabetes.

LAS VENTAJAS DE LA CRISTALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN MICROGRAVEDAD.

Un ambiente de microgravedad reduce los efectos de corrientes de fluidos entre partes distintas de la disolución y el efecto de la sedimentación dentro de la disolución de cristalización que puede interferir con el proceso del crecimiento del cristal y la calidad de los cristales formados. Así por ejemplo un cristal grande cúbico del virus del tabaco ,bajo condiciones de la microgravedad en un satélite espacial es inusualmente más de 30 veces del tamaño de cristales similares obtenidos en la Tierra.

Cuando un cristal se empieza a formarse en una disolución, las moléculas se difunden desde la disolución en los alrededores del cristal hasta unirse en la superficie a la creciente red cristalina. Así resulta que la disolución en la vecindad del germen cristalino tiene una concentración más baja del material que se cristaliza que la del resto de la disolución. Consiguientemente los alrededores de los gérmenes cristalinos tienen más baja densidad que la masa de la disolución. Bajo la influencia de la fuerza de gravedad de la Tierra, las diferencias de densidades crea corrientes de fluido en las proximidades de un cristal que está creciendo. Ese flujo de líquido entorno al incipiente cristal puede alterar la orientación y posición de las moléculas biológicas que se añaden a la red cristalina, por eso dichas corrientes crean desorden en el cristal que se va formando. Se añaden moléculas a la red cristal en la misma manera en Tierra que en microgravedad, pero en microgravedad la más baja concentración de moléculas cerca de la superficie del cristal hace que su crecimiento sea bastante más lento, lo que permite a las moléculas mal colocadas desprenderse y entonces colocarse de nuevo en una mejor orientación.

Esta series de imágenes de cristales de 10 glucosa isomerasa (tomadas automáticamente a intervalos de 1.5-horas) pueden ayudar a los investigadores a comprender como la dispersión en la velocidad de crecimiento en distintas zonas de la superficie cristalina en formación puede afectar al crecimiento y la calidad de los cristales

Cristalización exclusivamente por difusión.

La cristalización en microgravedad permite que las moléculas de proteínas disueltas en un medio líquido viajen muy lentamente a través de la disolución hasta la superficie de los incipientes núcleos cristalinos, es decir se da un transporte exclusivamente difusivo desde la masa de la disolución hasta los alrededores del sólido donde la concentración de proteína es más pequeña puesto que allí va entrando proteína desde la masa de la disolución pero esta desaparece al “pegarse al sólido cristalino.” Por este lento transporte exclusivamente difusivo en la disolución en lugar de formarse una masa de cristales minúsculos de muy mala calidad como en la Tierra donde actúan otros mecanismos aparte de la difusión entre zonas con distinta concentración, se forman menos cristales, pero mejores y de mayor tamaño.

Cristalización sin interferencia de la sedimentación.

Igualmente, la sedimentación de los gérmenes cristalinos, otro efecto de la fuerza de gravedad, puede conducir a cristales de pobre calidad. Cuando los microcristales han crecido hasta alcanzar un tamaño en el que no pueden ser sostenidos en suspensión debido a su peso dentro de la gota de disolución en que los cristales se están formando, entonces los cristales caen hasta la parte baja de la gota. Allí se establecen encima de otros cristales y dan lugar a la superposición de cristales adyacentes con distinta orientación. La difracción de rayos X usada en cristalografía requiere un cristal único y de buen tamaño para el análisis, y así la sedimentación generalmente conduce a la formación de cristales de una mala calidad y por tanto inutilizables. En el ambiente de microgravedad que hay en la baja órbita de la Tierra de los satélites, los efectos de sedimentación y corrientes de fluido de las disoluciones de cristalización se eliminan casi totalmente, y se mejoran las condiciones del crecimiento de cristales de calidad para obtener una imagen nítida por difracción de rayos X.

Delta-L : Unidad para visualización del crecimiento cristalino un utillaje propuesto para estaciones espaciales, que se espera que pueda suministrar información que ayude a los investigadores a mejorar la calidad de los cristales crecidos en microgravedad.

El resultado de cristalizaciones hechas en satélites o en la Estación Internacional del Espacio es equivalente a cientos de experimentos con gotas hechos en la Tierra. La técnica de cristalización en microgravedad asegura la obtención de cristales de máxima calidad, lo que permite “ver” la estructura molecular con el detalle necesario para entender su funcionamiento mediante la recogida de datos de difracción de rayos X. Además al producir cristales de gran tamaño en el espacio permitirá usarlos en la Tierra para la difracción de neutrones que necesita una instalación voluminosa y cara de un acelerador de partículas subatómicas Sincroton (acelera protones, electrones y neutrones entre otras partículas). Esta técnica basada en los neutrones no sólo permite “ver” la estructura en sí de las proteínas sino que es la única técnica que permite obtener información del entorno acuoso de las mismas. Es decir donde se encuentran más acumuladas las moléculas solvatadoras de agua que rodean o se hayan e los huecos interiores de la estructura tridimensional de la proteína.

Modelo estructural de taumatina desarrollado a partir de información recabada de cristales obtenidos en microgravedad. Estudios cristalográfico de estos cristales produjeron un 50% mas de datos que los obtenidos a partir de los mejores cristales fabricados en la Tierra. Taumatina es una proteína procedente de una baya africana y es muy apreciada por su sabor dulce.

ALGUNOS EJEMPLOS DE PROTEÍNAS QUE SE QUIEREN OBTENER EN EL ESPACIO.

A continuación se van a presentar algunas Proteínas que se pretenden producir en el espacio y su descripción. El numero de ellas es tan elevado que solo abordaremos unas cuantas agrupadas en familias. Estas proteínas no son exclusivamente de la familia de las vacunas (anticuerpos), pero nos sirven para comprender la importancia de la investigación espacial con las proteínas.

Las proteínas son claves en el cuerpo humano desempeñando papeles de enzimas, anticuerpos y hormonas. Las estructuras de estas macromoléculas y los sitios químicamente activos de que disponen determinan los tipos de otras moléculas con que estas pueden interactuar. Los sitios activos les permite fijarse a otras moléculas para llevar a cabo sobre ella una acción específica. Si los sitios activos, se alteran y se ponen en funcionamiento de manera inadecuada, pueden originar una enfermedad o una disfunción orgánica no deseable. Los investigadores que diseñan fármacos desean tener información de la naturaleza y dimensiones de estos sitios activos para desarrollar medicamentos que los bloqueen o los inactiven.

Este cristal de la proteína MnSOD obtenidas en microgravedad es rosa debido al ion manganeso que contiene en su centro activo. Los cristales obtenidos en la Tierra son típicamente delgadas láminas y nunca son lo suficientemente gruesos como para que un observador pueda ver este vibrante color rosa.

- Lisozima: Proteína aislada del huevo de gallina que funciona como una enzima bacteriostática que puede degradar la membrana celular bacteriana. Ha sido el primer enzima caracterizado por cristalografía. Se usa como un excelente sistema modelo para la mejor comprensión de parámetros implicados en experimentos sobre crecimiento de cristales proteínicos en microgravedad. Su aplicación es comparar los datos cinéticos de experimentos en microgravedad con datos de experimentos en laboratorios terrestres. Se obtiene así la velocidad relativa alcanzada en distintas condiciones experimentales de cristalización con gotas suspendidas en microgravedad.

Proteínas Implicadas en el sistema inmunológico.

- Alfa-Interferon: Ésta es una proteína que juega un papel importante en el sistema inmune humano. Se usa para tratar varios tipos de cáncer, y reforzar repuesta del sistema inmune a infecciones virales.

- Anti-HPr Fab Fragmento: La estructura detallada de esta proteína podrá proporcionar un imagen de un sitio de enlace del anticuerpo que reconoce a un antígeno formado por una proteína bacteriana extraña. A través del aprendizaje de la apariencia de los sitios de enlace de los anticuerpos se cree que entenderemos mejor cómo funcionan los anticuerpos en el sistema inmune.

- Gamma-Interferon: Estimula el sistema inmune del cuerpo y se usa en el tratamiento clínico de cáncer. Uso potencial como agente antitumoral contra tumores sólidos así como leucemias y linfomas. Tiene utilidad adicional como agente antinfeccioso, incluso como antiviral, antibacterial, y antiparásito.

- Anticuerpo Monoclonal: La principal proteína defensiva en animales contra todos los invasores patógenos y una de las proteínas más intensamente estudiadas. Los anticuerpos son de enorme repercusión médica por constituir la base de las vacunas así como de gran interés por la industria biotecnológica.

- Albúmina del suero: Contribuye mucho al transporte y procesos reguladores y tiene propiedades multifuncional de enlace que comprende a diversos metales, ácidos grasos, hormonas, y un amplio espectro de drogas terapéuticas. Es la proteína más abundante del sistema circulatorio, que enlaza y transporta una variedad increíble de sustancias biológicas y compuestos farmacéuticos en todo el torrente sanguíneo.

Proteínas Implicadas en la transcripción genética.

- ADN Polymerasa II: Implicada en la replicación y reparación de ADN de la bacteria Echirichia Coli. El conocimiento de la estructura de este enzima proporcionará un modelo para las polimerasas virales y humanas que será muy útil en el diseño de nuevas drogas.

- 5S ARNr: Un componente esencial de los ribosomas. Los datos estructurales que se quieren conocer ayudarán a la comprensión del proceso de biosíntesis de proteínas.

Proteínas Implicadas en reacciones bioquímicas claves en el metabolismo.

- Aldosa Reductasa: Pertenece a un grupo de reductasas de grupos aldo-ceto que tienen un amplio espectro de moléculas como substrato. Se ha comprobado la implicación de este enzima en el desarrollo de complicaciones diabéticas debido a su capacidad de catalizar la reducción de glucosa a sorbitol.

- Catalasa: principal enzima detoxificante de mamíferos, responsable de la eliminación de radicales peróxidos libres en los tejidos. Su descubrimiento y estudio puso en correlación la presencia de esos radicales con el envejecimiento y el daño celular.

- Creatina Kinasa: (Conejo) Convierte la energía de alto nivel almacenada en un enlace fosfato ( en las moléculas de fosfato de creatina) en energía utilizable (para formar la molécula de ATP). Es un enzima muy importante en el músculo y puede estar implicado en serias enfermedades de los músculos.

Los enzimas catalizan reacciones químicas especificas en las células y controlan las rutas metabólicas . Estudiar la estructura de los enzimas ayuda a los investigadores a entender mejor como actúan ellos. Creatina quinasa, fotografiada aquí, convierte la principal forma de almacenamiento de fosfato de alta energía en otra forma de energía utilizable.

Hormonas.

- Insulina humana: Facilita la incorporación de glucosa a las células. En los enfermos diabéticos hay una disminución o una falta completa de insulina, de la que resultan múltiples complicaciones dañinas.

- Hormona del crecimiento: Somatotropina humana es una de varias proteínas con formas varietales que se sintetizan en la glándula pituitaria. Somatotropina biosintética se comercializa para el tratamiento de niños extremadamente bajos porque sus glándulas pituitarias sólo producen poca cantidad de hormona del crecimiento.